一类新骨架杂萜化合物，其制备方法、药物组合物和抗肿瘤应用

摘要

本发明公开了一类新型的杂萜类化合物及其制备方法、药物组合物和在抗肿瘤药物中的应用。该类化合物为松香烷型二萜和间苯三酚通过α‑吡喃酮单元连接而成。药理实验表明该类化合物对胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌和食管癌等具有显著的抗肿瘤活性，可以用作抗肿瘤药物在临床上使用。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，一类新骨架的杂萜化合物，其制备方法、药物组合物及其在临床上的抗肿瘤应用。

背景技术

近年来，随着生活环境的日益恶化、社会人口老龄化以及不良生活方式等因素，我国的癌症发病率和死亡率持续增长。癌症，已经成为我国致死率最高的“杀手”，严重影响着国民的身体健康。中国人口约占全球人口的19.3％，癌症发病占全球癌症发病的21.8％，和世界癌症平均发病水平持平。中国癌症死亡约占全球癌症死亡26.9％，死亡率水平相对较高(CA Cancer J Clin，2016，66：115-132)。在我国，最常见的癌症有肺癌、肝癌、胃癌、食管癌和乳腺癌。目前，临床上对于癌症主要的治疗手段有手术切除、放射治疗和化学药物治疗。手术切除主要用于局部肿瘤的治疗，而后期已发生扩散的肿瘤则无法切除，而放射治疗靶向性高，适应症广，并发症少，但是复发率高，且局限性大；化学药物治疗经常作为手术或放射的搭配治疗，效果明显，应用较广，是目前临床上能够有效控制癌症病情的有效手段，但是目前的化学药物治疗也存在很多的弊端，大多数的化学药物不仅杀死肿瘤细胞，同时也对人体的健康细胞造成危险，常见的毒副作用包括白细胞和血小板下降、恶心、头晕、静脉炎等症状。由于现代治疗癌症方法的种种弊端，使得人们将视野转向了天然来源。比如，近二十年来市场上的抗癌植物药紫杉醇、羟喜树碱等因其疗效好、副作用少的特点取得了广泛的认同，使人们将肿瘤药物的开发寄希望于天然来源上。

间苯三酚类化学成分作为机体次级代谢产物，广泛来源于植物、海洋生物、微生物等，结构类型新颖，生物活性丰富，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等生理功能，吸引了越来越多的研究。自然界存在的间苯三酚主要通过和其他的化学集团偶联存在，常见有酰化的间苯三酚、卤代间苯三酚、间苯三酚二聚体，特别是间苯三酚和萜类的偶联物，形成了多种新骨架类型的化学成分，并且具有显著的抗肿瘤活性。以前的研究报道间苯三酚大多是和单萜或倍半萜进行偶联，但是鲜有间苯三酚和二萜的偶联物。

狼毒大戟(E.fischeriana)为大戟科(Euphorbiaceae)大戟属多年生草本植物，以根入药，其味辛性平，归肝、脾经。主治水肿腹胀、心腹疼痛、慢性气管炎、各种结核、疥癣等疾病，主要分布在黑龙江、吉林、内蒙古东部等地(《中国植物志》，1997，44(3)：89)。目前已从狼毒大戟植物分离得到了170余个化合物，分别属于二萜、三萜、酚酸类等，现代药理学研究表明从狼毒大戟的根部分离得到的多种二萜化合物具有抗肿瘤、抗炎和抗菌等作用。发明人从狼毒大戟的根部分离得到一类间苯三酚和二萜通过α-吡喃酮单元连接而成的新骨架化合物，并且发现它们可以显著地抑制多种肿瘤细胞和动物移植瘤的生长。

发明内容：

本发明提供了一类具有通式I和II所示结构母核的杂萜化合物或其药学上可接受的盐；

本发明所述的杂萜化合物的药物组合物，包括杂萜类化合物及其药学上可接受的载体、增效剂或赋形剂。

本发明的药物及其组合物药物制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液和注射剂等剂型；

本发明提供的制备方法，指的是从狼毒大戟的根部经过提取、分离、纯化得到该类杂萜化合物；

本发明提供一种包含上述杂萜类化合物及其药物组合物在抗肿瘤药物上的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

(1)本发明的第一方面提供了一类具有通式I和II所示结构母核的杂萜化合物

R₁，R₂，R₃选自氢、羟基、羰基、酯基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、氨基、甲氨基、二甲氨基、乙胺基、二乙胺基、异丙氨基、二异丙氨基、硝基、卤素等；

R₄，R₅选自氢、不饱和或饱和的烃基、取代或不取代的芳香环、低级糖、多聚糖糖、金属离子、有机酸酯基、硝基、卤素等；

本发明优选的化合物，但不限定于图1所示结构：

Fischernolide A：R₁＝α-OH，R₂＝H，R₃＝O，R₄＝OH，R₅＝OCH₃；

Fischernolide B：R₁＝α-OH，R₂＝β-OH，R₃＝OH，R₄＝OH，R₅＝OCH₃；

Fischernolide C：R₁＝α-OH，R₂＝β-OCH₃，R₃＝OH，R₄＝OH，R₅＝OCH₃；

(2)本发明的第二方面提供了杂萜衍生物的药物组合物包括杂萜衍生物和增效剂与药效学上可接受的载体。

所述增效剂可以是以下物质的任一种：羟基喜树碱、紫杉醇、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、米托蒽醌、氮芥、环磷酰胺、顺铂(DDP)、卡铂、奥沙利铂、 5-氟尿嘧啶、卡培他滨、雷替曲塞、阿糖胞苷、吉西他滨、甲氨蝶呤、培美曲塞、羟基脲、6-巯嘌呤、阿霉素、吉西他滨、C₁-C₂₀酰胺基吉西他滨、氟铁龙、克拉屈滨、氟尿嘧啶、替加氟、卡莫氟、双呋氟尿嘧啶、去氧氟尿苷、艾西拉滨、卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、阿糖胞苷、环胞苷、曲沙他滨、沙帕他滨、地西他滨、伯舒替尼、他菲替尼、依罗替尼、达克替尼、来那替尼、多韦替尼、帕纳替尼、巴非替尼、司美替尼、卡扎替尼、鲁索替尼、卢佐替尼、艾乐替尼、卡博替尼、乐伐替尼、色瑞替尼、阿法替尼、舒尼替尼、拉帕替尼、克唑替尼、阿帕替尼、埃罗替尼、卡奈替尼、阿西替尼、博舒替尼、尼洛替尼、吉非替尼、达沙替尼、西他列汀、伊马替尼、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、氨蝶呤、羟基脲、肌苷二醛、腺苷二醛、依鲁替尼、曲美替尼、鲁索利替尼、阿扎胞苷、氯法拉滨、来那度胺等。

本发明还涉及含有作为活性成份的本发明的杂萜化合物和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.01～95％重量，在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.01～50mg，优选的单元剂型含有0.01～10mg。

本发明活性部位的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明活性部位与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

(2)本发明活性部位或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等，优选口服给药。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂 (包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等。固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明活性部位可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

(4)本发明的第三方面在于提供了该类化合物的制备方法

从大戟科大戟属植物狼毒大戟(Euphorbia.fischeriana Steud.)的干燥根中，经回流提取、有机萃取、多种柱层析和制备液相等方法，得到该类化合物，具体操作步骤如下：

步骤一、取狼毒大戟根部，干燥并粉碎，加入8-15倍量的溶剂回流提取2-4 次，提取温度优选65℃至80℃，每次提取时间为1-3小时，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液；

步骤二、将浓缩液通过有机溶剂萃取2-5次，合并有机相，回收有机溶剂，得萃取物I；所述有机溶剂为石油醚、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或乙酸丙酯；所述有机溶剂的用量为浓缩液体积的1.5-2倍；

步骤三、将萃取物I通过硅胶柱层析，采用有机试剂进行梯度洗脱，洗脱剂优选石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、氯仿-甲醇等，并利用硅胶薄层板检识，合并为7个(A-G)流分；随后选择E进行反相硅胶柱色谱层析(洗脱剂优选乙醇- 水或甲醇-水)，通过硅胶薄层板检识共得5个(E1-E5)流分；选择E3-E5通过葡聚糖凝胶进行柱层析，洗脱剂用二氯甲烷-甲醇或石油醚-氯仿-甲醇；

步骤四、通过反相或正相制备液相色谱纯化(色谱柱可选择C4、C8、C6、 C18等，流动相可选择甲醇-水或乙腈-水)，得到该类杂萜化合物。

优选地，步骤一中，提取溶剂为水和乙醇的混合物，混合后乙醇浓度范围为 60-95％；优选提取溶剂的用量为原料的12倍；

优选地，步骤二中，有机溶剂为二氯甲烷；

优选地，步骤三中，硅胶柱层析洗脱剂为油醚-乙酸乙酯；反相硅胶柱色谱层析洗脱剂为甲醇-水(8∶2-10∶0)；葡聚糖凝胶为Sephadex LH-20，洗脱剂为石油醚-氯仿-甲醇(5∶5∶1)；

优选地，步骤四中，色谱柱选择C18。

(5)本发明涉及上述杂萜类化合物及其药物组合物在制备抗肿瘤药物的应用：

MTS实验表明该类杂萜化合物对于包括人胰腺癌PANC-28、人结肠癌等细胞 HT-29、人肝癌BEL-7402、人肺癌A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌SGC-7901 和人食管癌Eca-109在内的多种肿瘤细胞具有显著的抑制作用；动物的药效学实验证明该类杂萜可显著地抑制人结肠癌HT-29裸鼠移植瘤的生长。

附图说明

图1：Fischernolides A-C的结构

图2：Fischernolide A对人结肠癌HT-29异体移植瘤裸鼠模型的体重影响

具体实施方式

下面以Fischernolides A～C的具体实施步骤为例来进一步来说明本发明的详细内容，但本发明的内容不局限于此。

实施例一

(1)取干燥的狼毒大戟根部10kg，粉碎，加入10倍量的95％乙醇回流提取3 次，提取温度优选75℃，每次提取2小时，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液；

(2)将(1)中得到的浓缩液通过乙酸乙酯萃取3次，合并，回收有机溶剂，得萃取物I；

(3)将萃取物I通过硅胶柱层析，采用有机试剂进行梯度洗脱，利用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(0∶1-1∶0)，并利用硅胶薄层板检识，合并为7个(A-G)流分；随后选择E进行反相硅胶柱色谱层析，甲醇-水梯度洗脱(20∶80-100∶0)，通过硅胶薄层板检识共得5个(E1-E5)流分；选择EE5通过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶进行柱层析，石油醚-氯仿-甲醇(5∶5∶1)等度洗脱，共得到10个流分(E5- 1～10)；

(4)选取流分E5-6～8通过反相制备液相色谱，80％乙腈-水等度，流速5.0ml/min，得到Fischernolide A(54mg)，Fischernolide B(41mg)，Fischernolide C(37mg)。

实施例二

(1)取干燥的狼毒大戟根部20kg，粉碎，加入10倍量的80％乙醇回流提取3 次，提取温度优选70℃，每次提取2.5h，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液；

(2)将(1)中得到的浓缩液通过乙酸乙酯萃取3次，合并，回收有机溶剂，得萃取物I；

(3)将萃取物I通过硅胶柱层析，采用有机试剂进行梯度洗脱，利用石油醚-丙酮梯度洗脱(0∶1-1∶0)，并利用硅胶薄层板检识，合并为8个(A-H)流分；随后选择F进行反相硅胶柱色谱层析，甲醇-水梯度洗脱(30∶70-100∶0)，通过硅胶薄层板检识共得7个(F1-F7)流分；选择F5通过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶进行柱层析，氯仿-甲醇(1∶1)等度洗脱，共得到10个流分(F5-1～10)；

(4)选取流分F5-6～8通过反相制备液相色谱，85％甲醇-水等度，流速4.5ml/min，得到Fischernolide A(115mg)，Fischernolide B(89mg)，Fischernolide C(78mg)。

实施例三

(1)取干燥的狼毒大戟根部5kg，粉碎，加入12倍量的85％乙醇回流提取4次，提取温度优选80℃，每次提取2h，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液；

(2)将(1)中得到的浓缩液通过乙酸乙酯萃取3次，合并，回收有机溶剂，得萃取物I；

(3)将萃取物I通过硅胶柱层析，采用有机试剂进行梯度洗脱，利用氯仿-甲醇梯度洗脱(0∶100-1∶0)，并利用硅胶薄层板检识，合并为6个(A-F)流分；随后选择D进行反相硅胶柱色谱层析，甲醇-水梯度洗脱(10∶90-100∶0)，通过硅胶薄层板检识共得8个(D1-D8)流分；选择D4通过Sephadex LH-20葡聚糖凝胶进行柱层析，二氯甲烷-甲醇(1∶1)等度洗脱，共得到8个流分(D4-1～8)；

(4)选取流分D4-6～7通过反相制备液相色谱，90％甲醇-水等度，流速3.0ml/min，得到Fischernolide A(30mg)，Fischernolide B(22mg)，Fischernolide C(20mg)。

实施例四

Fischernolide A～C的物理性质和核磁数据：

(1)Fischernolide A

Fischernolide A：黄色不定型粉末；-32.00(c0.05，MeOH)；UV_max：208，229，280and>max3352，2944，2834，1654，1727，1586，1475，779，708cm^-1；>+(cal.507.2024)；¹H>6)：δ_H1.38(1H，m，H-1α)，1.18(1H，m，H-1β)，1.53(1H，overlap，H-2α)，1.41(1H，m，>3)，3.89(3H，s，24-OCH₃)；¹³C>6)：δ_c41.0(C-1)，17.7(C-2)，38.9(C-3)，32.8(C-4)，53.5(C-5)，19.2(C-6)，40.8(C-7)，69.0(C-8)，70.5(C-9)，38.87(C-10)，196.1(C-11)，179.1(C-12)，138.4(C-13)，155.8(C-14)，115.0(C-15)，165.0(C-16)，138.9(C-17)，33.5(C-18)，21.6(C-19)，20.3(C-20)，104.4(C-21)，>

(2)Fischernolide B

Fischernolide B：黄色不定型粉末；-147.99(c0.025，MeOH)；UV_max：203，279，354nm；IR(KBr)v_max3355，2947，2834，1656，1583，1447，706cm^-1；HR-ESI-MS：>+(cal.527.2276)；¹H>6)：δ_H>3)，3.98(3H，s，24-OCH₃)，>13C>6)：δ_c41.2(C-1)，18.0(C-2)，39.9(C-3)，33.5(C-4)，54.3>

(3)Fischernolide C

Fischernolide C：黄色不定型粉末；32.00(c0.05，MeOH)；UV_max：203，279，354nm；IR(KBr)v_max3363，2950，2831，2324，1509，1031，635cm^-1；HR-ESI-MS：m/z>+(cal.527.2287)；¹H>6)：δ_H1.38(1H，m，H-1α)，1.19(1H，m，H-1β)，1.53(1H，m，H-2α)，1.41(1H，overlap，H-2β)，1.44(2H，m，>3)，3.97(3H，s，24-OCH₃)，3.36(1H，s，>3)，4.47(s，8-OH)，6.03(s，26-OH)；¹³C>6)：δ_c41.3>

实施例五.

利用MTS法来筛选化合物的抗肿瘤活性

(1)实验材料和仪器

PANC-28，BEL-7402，HT-29，A549和MCF-7细胞株购自中国科学院细胞典藏库(上海)；DEME培养基，1640培养基，PBS缓冲液，胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；均购自美国Gibco公司；MTS细胞活性检测试剂盒(日本Dojindo公司)；DMSO(美国Sigma公司)；96孔板(美国corning 公司)。

二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo公司)；全波长酶标仪(美国Thermo FisherScientific公司)；超净工作台；离心管、吸管等相关耗材；离心机(BIOFUGE STRATOS)；漩涡振荡器(SCILOGEX MX5)美国SCILOGEX公司；倒置电子显微镜；移液器。

(2)细胞复苏及培养

取出液氮中标记好的PANC-28、BEL-7402PANC-28，BEL-7402，A549， MCF-7，SGC-7901，Eca-109和HT-29细胞冻存管投入37℃水浴锅中快速解冻，尽量于1min内完成融化。冻存管经酒精消毒后，吸取冻存液，转入15ml无菌离心管中，加入相应的培养基后，使之混匀，再离心去除上清液。根据上述步骤再重复洗涤一次，然后加10ml培养液混匀重悬细胞，再将其转移至10ml培养皿内，并放于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中培养。

PANC-28，BEL-7402，A549，MCF-7，SGC-7901和Eca-109细胞用含10％ FBS的RPMI1640高糖培养基培养在37℃，5％CO₂培养箱中，当细胞密度达到70％-80％时，将其传代。传代时先吸去旧的培养基，用PBS洗涤2次后，在培养皿中加入含EDTA的胰蛋白酶并放置37℃培养箱3min，然后加入培养基终止消化，1000r离心5min，弃去消化液并加入含血清的培养基吹打细胞，形成细胞悬液，最后根据细胞数量，将其转移到新的培养皿中，完成细胞传代。HT-29细胞用DEME培养基培养，培养步骤与PANC-28细胞一样。

(3)MTS试验

先用培养基将细胞配置成单个细胞悬液，再用细胞计数板计数，将5种细胞悬液密度分别稀释为1.5×10⁴个/ml，然后各吸取200μl接种到96孔板上(接种过程中需对细胞悬液进行多次混匀，以保证接种后每孔的细胞密度完全相同)，并放入培养箱。培养24h后，加入用含10％FBS的培养基稀释的不同浓度的药物(①活性筛选时药物浓度均为40μg/ml，②求半数抑制浓度时，各药物浓度分别为0.05、0.2、1.0、5.0、10μg/ml)，同时还设置DMSO对照组和不含细胞的空白组，继续培养48小时后，向每孔加入20μL>

细胞增殖抑制率(％)＝[(A对照-A样品)/(A对照-A空白)]×100％

(4)结果

表1.杂萜类化合物抑制肿瘤细胞筛选试验结果

表1的结果表明杂萜类化合物Fischernolides A～C对人胰腺癌PANC-28、人结肠癌HT-29、人肝癌BEL-7402、人肺癌A549、人乳腺癌MCF-7、人胃癌 SGC-7901和人食管癌Eca-109等多种肿瘤细胞系具有显著的毒性作用，特别是 Fischernolide A和Fischernolide C的作用尤为显著。

实施例六.

杂萜化合物Fischernolide A体内对人结肠癌HT-29裸鼠移植瘤药效试验

(1)实验材料：

裸鼠：BALB/c裸鼠，每只质量18-22g，6周龄，均为雄性，北京维通利华公司购买；HT-29细胞株购自中国科学院细胞典藏库(上海)；

(2)具体实验步骤

①将培养的HT-29人结肠癌细胞配制成1×10⁷个/ml的细胞悬液，用碘伏消毒裸鼠左侧肋腹及周边，取0.2ml细胞悬液腹腔注射，接种；

②接种一周后，根据移植瘤的大小将裸鼠随机分为8组，每组12只，分别为模型组，阳性药紫杉醇15mg/kg给药组，Fischernolide A两个剂量给药组8mg/kg， 16mg/kg，32mg/kg。阳性药注射给药，隔天给药1次；给药组腹腔注射给药，每天给药1次。观察肿瘤的形成时间及生长情况，定时用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，并计算体积。给药15天，记录小鼠的体重和肿瘤的体积，并处死动物，取肿瘤，称量瘤重。

(3)结果

图2.Fischernolide A对人结肠癌HT-29异体移植瘤裸鼠模型的体重影响

表2.Fischernolide A对人结肠癌HT-29裸鼠异体移植瘤生长的抑制作用

从图2可以得出，通过对比不同时间给药组、阳性药与溶剂对照组的结果，裸鼠的体重均有不同程度的下降，但不具有统计学差异；而表2的实验结果则表明FischernolideA可以明显地抑制裸鼠移植瘤的生长，与对照组对比， Fischernolide A 10、20、30mg/kg的抑制率分别为38.81％，54.23％和66.67％，呈良好的剂量效应关系，且高于紫杉醇15mg/kg组，其抑制率为24.38％。因此，可以说明Fischernolide A可明显地抑制BALB/c型裸鼠移植HT-29肿瘤的生长。

实施例七.

以Fischernolide A为原料药的片剂

取Fischernolide A和羟丙基甲基纤维素、滑石粉、乳糖、硬脂酸镁混合均匀，加无水乙醇制成软材，过24目筛，制成颗粒，干燥，加入硬脂酸镁，混匀，压片。

实施例八

以Fischernolide A为原料药的胶囊剂

取FischernolideA和淀粉、微晶纤维素、焦亚硫酸氢钠混合均匀，加无水乙醇制成软材，过24目筛，制成颗粒，干燥，加入硬脂酸镁，混匀，装入胶囊。

实施例九.

以Fischernolide A为原料药的颗粒剂

取Fischernolide A与淀粉、亚硫酸氢钠混合均匀，加无水乙醇制成软材，过 24目筛，制成颗粒，干燥，加入硬脂酸镁，混匀，装袋。

实施例十.

以Fischernolide A为原料药的口服液

上述组分混匀后，采用口服液常规制备方法，分装即可。

实施例十一

以Fischernolide A为原料药的注射剂

上述组分混匀后，采用注射剂常规制备方法，即可得100支。

实施例十二.

以Fischernolide A和环磷酰胺为原料药的片剂

取Fischernolide A、环磷酰胺和羟丙基甲基纤维素、滑石粉、乳糖、硬脂酸镁混合均匀，加无水乙醇制成软材，过24目筛，制成颗粒，干燥，加入硬脂酸镁，混匀，压片。

实施例十三

以Fischernolide A和来那度胺为原料药的胶囊剂

取FischernolideA、来那度胺和淀粉、微晶纤维素、焦亚硫酸氢钠混合均匀，加无水乙醇制成软材，过24目筛，制成颗粒，干燥，加入硬脂酸镁，混匀，装入胶囊。

实施例十四

以Fischernolide A和长春瑞滨为原料药的注射剂

上述组分混匀后，采用注射剂常规制备方法，即可得100支。