一种嗜麦芽窄食单胞菌制备的生物碱类化合物及其制备方法

摘要

本发明公开了嗜麦芽窄食单胞菌Stentrophomonas maltophilia QB‑77，保藏编号为：CCTCC NO：M 2014241，制备出的生物碱fiscalin D化合物和生物碱fiscalin E化合物，结构式如下：采用原料容易且对环境没有任何污染，也不会造成资源不可逆破坏，该生物碱化合物可以为后续活性的研究提供物质基础，也为其他有生物活性化合物的合成提供先导物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物产物化学领域，具体涉及一种嗜麦芽窄食单胞菌制备的生物碱类化合物及其制备方法。

背景技术

生物碱是一类由生物次级代谢产生的含氮有机化合物，自然界中的生物碱种类较多，大多来源于植物，因此又有植物碱之称。生物碱对人和动物有重要的生理作用，包括平喘镇咳、降血糖、降血脂、抗菌、抗肿瘤、镇痛等，其中以抗菌、抗肿瘤活性最为突出。天然结构生物碱是创新药物研究中发现先导化合物的重要来源，目前应用于临床的生物碱药物已经近百种。如海洋链霉菌来源的生物碱Altemicidin、Ammonsamide D、Azamerone、Venezuelins、 Nitropyrrolins等；土壤来源链霉菌次级代谢产物生物碱Sannanine、Benhamycin、Inubosins A、Inubosins B、Inubosins C等。

嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)属于黄单胞菌目的黄单胞菌科，嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)广泛存在于水、土壤和动物体内，为条件致病菌，随着临床抗生素和免疫抑制的广泛和大剂量应用，其分离率在非发酵菌属中呈上升趋势，因此研究该菌是一个发展趋势，目前暂无从嗜麦芽窄食单胞菌的代谢物中分离生物碱的报道。

发明内容

本发明意在提供一种嗜麦芽窄食单胞菌制备的生物碱化合物以及制备方法，解决现有技术暂无从嗜麦芽窄食单胞菌的代谢物中分离生物碱的研究的问题。

一种生物碱类化合物，包括生物碱fiscalin D，其结构式如下：

fiscalin D这种生物碱为白色粉末，易溶于甲醇、丙酮及二甲亚砜溶剂，分别具有365 及254nm荧光。从红外光谱KBr压片中，在3430cm-1、2972cm-1、1704cm-1、1689cm-1、1663cm-1、1607cm-1、1482cm-1、1388cm-1有吸收，表明该化合物有羟基、甲基、羰基和苯环的结构。紫外光谱中，其最大吸收波长为206nm和226nm，表明该化合物有苯环存在。高分辨质谱图中，HRESIMS分子离子峰荷质比为526.2061[M+Na]+，其分子式为 C27H29N5NaO5，16个不饱和度。

还包括生物碱fiscalin E化合物，其结构式如下：

fiscalin E这种生物碱为白色粉末，红外光谱，在3429cm-1、2964cm-1、2932cm-1、1687cm-1、1636cm-1、1610cm-1、1480cm-1、1470cm-1、1387cm-1有吸收，表明该化合物有羟基、甲基、羰基和苯环的结构；紫外光谱，其最大吸收波长为206nm和225nm，表明该化合物有苯环存在。高分辨质谱图，HRESIMS分子离子峰荷质比为512.1903[M+Na]+，其分子式为C26H27N5NaO5，16个不饱和度。

所述生物碱类化合物是从保藏编号为：CCTCC NO：M 2014241的嗜麦芽窄食单胞菌Stentrophomonas maltophilia QB-77的发酵培养物中制备分离得到。

嗜麦芽窄食单胞菌Stentrophomonas maltophilia QB-77，该菌于2014年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO： M 2014241。

该嗜麦芽窄食单胞菌Stentrophomonas maltophilia QB-77菌株从贵州省遵义市赤水丹霞10～20cm土壤中筛选获得，是革兰氏阴性菌，属于变形菌门，γ-β亚纲，窄食单胞菌属，该菌株保存甘油中，并置于在-80℃下保存。

上述生物碱类化合物的制备方法步骤如下：

步骤一、菌株的活化：将嗜麦芽窄食单胞菌Stentrophomonas maltophilia QB-77取出活化培养；

步骤二、发酵培养：制备发酵培养基，将嗜麦芽窄食单胞菌Stentrophomonasmaltophilia QB-77置于发酵培养基中，在28℃，静置培养13d后，将菌体连同培养基捣碎，加入乙酸乙酯在28℃，130rpm下振荡萃取2次，合并2次萃取液，40℃下减压浓缩，得发酵产物；

步骤三、分离纯化：将步骤二的发酵产物用柱层析法分离，依次用不同体积比或者不同浓度的氯仿-丙酮、甲醇水、石油醚-丙酮和甲醇水洗脱后，TCL检测合并相同组分，得到生物碱类化合物。

具体的，生物碱类fiscalin D化合物制备时，所述步骤三分离纯化的具体步骤为：a、将发酵产物用易挥发的溶剂溶解得到溶液，向溶液中加入硅胶粉混合均匀，待溶剂挥发后得到样品，将样品采用柱层析法分离，用氯仿-丙酮体积为30:1～1:2下依次梯度洗脱，根据TCL 检测合并相同组分，共得8个组分，F1～F8；

b、将上述F4组分，用反相中压柱层析，甲醇水浓度为30～80％梯度洗脱，根据TCL检测合并相同组分，共得6个组分，F4-1～F4-6；

c、将上述F4-2组分，用正相硅胶柱层析，石油醚-丙酮体积比为4:1～2:1下依次梯度洗脱，得到生物碱fiscalin D化合物。

具体的，生物碱类fiscalin E化合物制备时，所述步骤三分离纯化的具体步骤为：a、将发酵产物用易挥发的溶剂溶解得到溶液，向溶液中加入硅胶粉混合均匀，待溶剂挥发后得到样品，将样品采用柱层析法分离，用氯仿-丙酮体积为30:1～1:2下依次梯度洗脱，根据TCL 检测合并相同组分，共得8个组分，F1～F8；

b、将上述F4组分，用反相中压柱层析，甲醇水浓度为30～80％梯度洗脱，根据TCL检测合并相同组分，共得6个组分，F4-1～F4-6；

c、将上述F4-3组分，用反相中压柱层析，甲醇水浓度为20～50％下依次梯度洗脱，得到生物碱fiscalin E化合物。

更为具体的，所述发酵培养基由葡萄糖、麦芽抽提物、酵母粉、碳酸钙、微量元素预混液、加入腐殖酸浸泡24h后的双蒸水和琼脂粉配制而成。该培养基的配制方法是在以新生物碱为目标产物，通过高效液相色谱作为半定量定性测定，首先通过改变采用不同的碳源、氮源、改变碳源与氮源比例；此外改变培养基发酵时间、提取溶剂，提取时间；最后才确定在该培养基条件下培养13天，采用乙酸乙酯萃取24小时，此时新生物碱的生物量最高，其生物量由最初的峰面积1201达到了23680。

优选的，所述发酵培养基中：葡萄糖4g、麦芽抽提物4g、酵母粉10g、碳酸钙2g、微量元素预混液0.5ml、1L加入6g腐殖酸浸泡24h后的双蒸水和18g的琼脂粉。

再具体的，所述微量元素预混液为ZnSO4·7H2O 2g、FeSO4·7H2O 2g、MnCl2·4H2O 2g、 CuSO4·5H2O 2g、Na2B4O4·10H2O 2g和(NH4)6MO7·4H2O 2g，用双蒸水定容至1L配制而成。

本发明的工作原理及有益效果：1)生物碱来源于嗜麦芽窄食单胞菌Stentrophomonas maltophilia QB-77，其菌株由实验室分离鉴定所得，采用原料容易且对环境没有任何污染，也不会造成资源不可逆破坏。

2)fiscalin D和fiscalin E单体化合物的获得，可以为后续活性的研究提供物质基础，也为其他有生物活性化合物的合成提供先导物。

通过文献报道相似结构类型的化合物活性，生物碱fiscalin D和fiscalin E具有抗H1N1 病毒作用、具有弱的细胞毒活性，还具有抗人类U373、Hs683恶性胶质瘤作用。

附图说明

图1：生物碱fiscalin D复合物和生物碱fiscalin E化合物的分离流程图；

图2：fiscalin D的红外光谱图；

图3：fiscalin D的紫外光谱图；

图4：fiscalin D的高分辨质谱图；

图5：fiscalin D在Methol-d4中的1H-NMR谱图；

图6：fiscalin D在Methol-d4中的13C-NMR及DEPT谱图；

图7：fiscalin D在Methol-d4中的HSQC谱图；

图8：fiscalin D在Methol-d4中的HMBC谱图；

图9：fiscalin D在Methol-d4中的ROESY谱图；

图10：fiscalin D的旋光谱图；

图11：fiscalin E的红外光谱图；

图12：fiscalin E的紫外光谱图；

图13：fiscalin E的高分辨质谱图；

图14：fiscalin E在Methol-d4中的1H-NMR谱图；

图15：fiscalin E在Methol-d4中的13C-NMR及DEPT谱图；

图16：fiscalin E在Methol-d4中的HSQC谱图；

图17：fiscalin E在Methol-d4中的HMBC谱图；

图18：fiscalin E在Methol-d4中的ROESY谱图；

图19：fiscalin E的旋光谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

制备流程基本如图1所示：

1嗜麦芽窄食单胞菌Stentrophomonas maltophilia QB-77菌株的活化

从-80℃冰箱中取出甘油斜面保存的菌种，以无菌接种环挖取1环菌株Stentrophomonas maltophilia QB-77的孢子，十字划线接种于直径11cm的基础培养基平板，28℃静置培养 3d，挑取单菌落传代至第三代可放大培养。

2发酵产物的发酵培养

嗜麦芽窄食单胞菌Stentrophomonas maltophilia QB-77选用改良GYD固体培养基发酵培养，改良GYD固体培养基为葡萄糖4g麦芽抽提物4g、酵母粉10g、碳酸钙2g、微量元素预混液0.5mL、6g/L双蒸水浸泡24h的腐殖酸，加入去离子水定容至1000mL，121℃高压灭菌30min得到，规格500mL三角烧瓶装150mL发酵培养基，每瓶按琼脂粉质量与发酵培养基体积的1.8％加入琼脂粉。每瓶接种量为培养平板上面积1×1cm2的活化菌种量， 28℃，静置培养至13d，菌体连同培养基捣碎，加入乙酸乙酯萃取两次，每次在130rpm 振荡萃取24h，合并萃取液，40℃减压浓缩，得发酵产物17.8g。

3发酵产物的纯化分离

(1)用丙酮溶剂的溶解17.8g的发酵产物，与硅胶按质量比约1:1.5(即17.8g发酵产物中加100-200目硅胶粉27g)混合均匀，待溶剂挥发后得到河沙状样品，该样品作为上柱的样品；称取100-200目硅胶粉600g与氯仿-丙酮＝30:1混合均匀(在此过程中不能产生气泡)装入长为975mm，内径为70mm分离柱中，让硅胶粉缓缓下沉直至不再下沉时加入上柱样品，采用氯仿-丙酮[30:1；15:1；10:1；5:1；2:1；1:1；1:2]，依次7个梯度洗脱，每个梯度洗脱3-5(大约每个柱体积洗脱3.6L-6L洗脱溶剂)个柱体积，每250mL洗脱溶剂为一份进行收集，共收集110份，每份经旋转蒸发仪减压回收后，加入10mL丙酮溶解后移到规格为20mL西林瓶中，薄层层析(TCL)点板，用石油醚：丙酮＝2:1、氯仿：丙酮＝5:1 或氯仿：甲醇＝10：1展开剂展开，在常规紫外可见光分析仪下观察是否具254nm或365nm 荧光，再用8％硫酸乙醇显色的颜色剂显色，最后采用碘化铋钾显色；合并具有254nm和365nm 荧光，8％硫酸乙醇显灰黑色，碘化铋钾显橘黄色，迁移值(Rf)在0.5及0.4的点，合并后称量得到F4 3.40g。

(2)F4 3.40g混合组分，反相中压柱层析，甲醇水(30％；40％；50％；60％；70％；80％) 梯度洗脱，每个梯度洗脱10-20个柱体积，每500mL为一份收集，共收集40份，每份经旋转蒸发仪减压回收后，经20mL甲醇溶解后转移到规格为25mL西林瓶中，根据TCL检测，主要检测各组分化合物的254nm、365nm、硫酸显色的颜色、各组分的Rf值等特点，合并具有254nm和365nm荧光，8％硫酸乙醇显灰黑色，碘化铋钾显橘黄色，迁移值(Rf)在0.5 的组分共有200mg，此外迁移值(Rf)在0.4的组分共有1.8g。

(3)F4-2组分200mg，采用丙酮溶解，加入300mg硅胶混合均匀，待溶剂挥发后的河沙状作为上柱的样品；称取15g硅胶与石油醚：丙酮＝4:1溶剂混合均匀后，装入长为350mm，内径为10mm分离柱中，采用石油醚：丙酮(4:1；2:1)梯度洗脱，每个梯度洗脱10 个柱体积，每25mL为一份收集；根据TCL检测，合并具有254nm和365nm荧光，8％硫酸乙醇显灰黑色，碘化铋钾显橘黄色，迁移值(Rf)在0.5的组分，最终得到生物碱fiscalin D 化合物80mg。

(4)F4-3组分1.8g，反相中压柱层析，甲醇：水(20％；30％；40％；50％)梯度洗脱，每个梯度洗脱10个柱体积，每250mL收集一份，共收集50份，每份经旋转蒸发仪减压回收后，经20mL甲醇溶解后转移到规格为25mL西林瓶中，根据TCL检测，合并具有254nm 和365nm荧光，8％硫酸乙醇显灰黑色，碘化铋钾显橘黄色，迁移值(Rf)在0.4的组分，最终得到生物碱fiscalin E化合物9.8mg。

4结构鉴定

1)生物碱fiscalin D化合物的结构鉴定

该生物碱为白色粉末，易溶于甲醇、丙酮及二甲亚砜溶剂，分别具有365及254nm荧光。从红外光谱KBr压片(图2)中，在3430cm-1、2972cm-1、1704cm-1、1689cm-1、 1663cm-1、1607cm-1、1482cm-1、1388cm-1有吸收，表明该化合物有羟基、甲基、羰基和苯环的结构。紫外光谱(图3)中，其最大吸收波长为206nm和226nm，表明该化合物有苯环存在。高分辨质谱图中(图4)，HRESIMS分子离子峰荷质比为526.2061[M+Na]+，其分子式为C27H29N5NaO5，16个不饱和度。

1H-NMR谱图(500MHz,MeOD-d4)该化合物具有8个芳香环上的氢质子信号[δH 8.26(dd, J＝8.0,1.1Hz,1H),7.85(ddd,J＝8.5,7.2,1.5Hz,1H),7.74(d,J＝7.8Hz, 1H),7.56(ddd,J＝8.5,7.2,1.5Hz,1H),7.44(dd,J＝7.7,3.0Hz,1H),7.34(td, J＝7.7,1.1Hz,1H),7.14(td,J＝7.6,0.9Hz,1H)]表明该化合物具有两个苯环，此外该化合物还含有四个甲基[1.33(s,3H),1.32(s,3H),1.21(d,J＝7.2Hz,3H), 1.00(d,J＝6.8Hz,3H)]详细数据归属详见附图。13C-NMR、DEPT及HSQC谱图(图6、图7)所示，除了两个苯环[148.4,139.3,138.7,(7.85,136.1),(7.34,131.1),(7.74, 128.8),(7.56,128.7),(8.26,127.6),(7.14,126.5),(7.43,125.8),121.8, (7.45,116.4)]及四个甲基[(1.33,25.8),(1.32,24.7),(1.21,14.9),(1.00,18.1)] 外；还具有3个羰基[177.4(s),172.5(s),162.9(s)]；四个4级碳信号(152.1,85.9, 76.2,66.6)；三个3级碳信号[(5.35,80.9),(5.58,53.9),(3.17,35.6)]；一个2级碳信号[(2.94,2.93,42.8)]。综合上述信息，该化合物共有16个不饱和度，从氢谱、碳谱、DEPT及HSQC谱知道，除了化合物两个苯环及三个羰基，该化合物还剩下5个不饱和度，在上述信息中，化学位移为152.1的4级碳信号可以推断出该化合物还含有与氮组成的双键，最后4个不饱和度构成4个环。通过上述推出的化合物的结构特征结合文献资料查询，该化合物与文献报道的fiscalin C很相似，唯一不同fiscalin C在C-3位上的氢被羟基取代。在HMBC(图8)及ROESY(图9)谱图中也得到证明。仔细对照二维谱图(HSQC、HMBC、ROESY) 和旋光谱(图10)最终确定化合物结构且命名为生物碱fiscalin D化合物。

2)生物碱fiscalin E化合物的结构鉴定

该化合物白色粉末，红外光谱(图11)中，在3429cm-1、2964cm-1、2932cm-1、1687cm-1、1636cm-1、1610cm-1、1480cm-1、1470cm-1、1387cm-1有吸收，表明该化合物有羟基、甲基、羰基和苯环的结构；紫外光谱(图12)中，其最大吸收波长为206nm和225 nm，表明该化合物有苯环存在。高分辨质谱图中(图13)，HRESIMS分子离子峰荷质比为 512.1903[M+Na]+，其分子式为C26H27N5NaO5，16个不饱和度，从分子量对比，该化合物与fiscalin D少了一个甲基。通过对比1H-NMR(图14)、13C-NMR(图15)DEPT(图15) 及HSQC(图16)非常相似，唯一不同的是该化合物少了一个甲基，即该化合物含有三个甲基。通过谱HMBC(图17)、ROESY(图18)确定该化合物少了连接在C-22位上的甲基。最后确定化合物结构并命名为生物碱fiscalin E化合物。

生物碱fiscalin D化合物和生物碱fiscalin E化合物之间可以相互转换。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。