毛蕊异黄酮衍生物在制备治疗ER阴性乳腺癌药物中的应用

摘要

本发明公开了一种毛蕊异黄酮衍生物在制备治疗ER阴性乳腺癌药物中的应用。申请人通过实验发现，该毛蕊异黄酮衍生物能够下调MALAT1和GPR30的表达水平，并能失活ERK1/2、Akt磷酸化水平，抑制ER阴性乳腺癌细胞的增殖；其中MTT实验表明，式(I)所示化合物在15μM时抑制SKBR3、MDA‑MB‑468增殖效果最明显，而相同浓度的毛蕊异黄酮(15μM)对SKBR3、MDA‑MB‑468细胞增殖无明显作用。所述的毛蕊异黄酮衍生物的结构如下述式(I)所示。

说明书

技术领域

本发明涉及一种毛蕊异黄酮衍生物在制备治疗ER阴性乳腺癌药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

乳腺癌的发生率在所有成年女性肿瘤中大约占30％。而在美国，乳腺癌是所有妇科肿瘤中第二大致死因素。根据雌激素受体(ER)的表型差异，乳腺癌可以分为两种亚型：ER阳性及ER阴性。在临床上，ER阴性的乳腺癌更加难以治疗。ER属于核受体超家族的成员，分为两种亚型:ERα和ERβ，前期实验表明ERα介导内皮细胞增殖、新生血管生长都是通过经典的基因组和快速的非基因组效应来实现的。而对于ER阴性的乳腺癌，非基因组效应在其生长发育中占有更重要的地位。

G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor 30，GPR30)是一种7次跨膜G蛋白偶联受体。自2005年提出GPR30作为一种新型雌激素膜受体以来，有关GPR30参与雌激素快速非基因组通路的研究有很多。雌激素可以通过结合GPR30快速激活细胞信号转导通路及下游效应分子，介导雌激素的快速非基因组效应进而影响细胞周期进程或导致细胞功能的变化。GPR30参与信号转导的途径主要有MAPK途径和PI3K/Akt途径。

基因组学研究表明人类绝大多数基因被转录成非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)。ncRNAs包括以miRNA为代表的短小RNA和长链非编码RNA。长链非编码RNA(longnon-coding RNAs，lncRNAs)是一类转录本长度在200nt～100kb之间的ncRNAs分子。近年大量研究表明，LncRNAs参与X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。MALAT1被发现具有反式转录调控作用的长链非编码RNA，近年来研究表明MALAT1在原发性与转移性乳腺癌中的表达显著上调，并通过快速非基因组效应对乳腺癌细胞增殖产生影响，而沉默MALAT1表达则能快速通过非基因组效应抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。

黄芪为豆科多年生草本植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。据药典记载黄芪味甘，性微温，具有补气升阳、益卫固表、改善心功能、扩张冠状动脉、利尿消肿、托疮生肌、抗菌、抗病毒、抗疲劳、抗衰老、促进造血功能、保护肝脏等功效。

毛蕊异黄酮(calycosin)是从黄芪中提取和分离出来的一种异黄酮类化合物(马晓丰等，蒙古黄芪中黄酮类成分的研究，中草药，第36卷第9期,2005年9月，p1293-1296)，其结构式如下式所示：

已有的研究表明，毛蕊异黄酮具有抗氧化应激、抗病毒和调节细胞凋亡等作用，但其不足之处在于其有效浓度较大，靶点不明确。低浓度毛蕊异黄酮(<16μM)能够促进ER阳性乳腺癌细胞MCF-7增殖；虽然高浓度毛蕊异黄酮(>20μM)能够抑制ER阳性乳腺癌细胞MCF-7及T47D增殖，但是其对ER阴性乳腺癌细胞的增殖无影响(周黎明、陈健，不同浓度的毛蕊异黄酮对ER阳性乳腺癌细胞的作用及其机制研究，中国药理学会第十一届全国化疗药理学术研讨会论文集，2012年7月1日，p322-323)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种结构新颖的毛蕊异黄酮衍生物在制备治疗ER阴性乳腺癌药物中的应用。

本发明的技术方案为：下述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗ER阴性乳腺癌药物中的应用；

本发明技术方案中涉及的式(I)所示化合物的化学名称为：3-(4-甲氧基-3-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-7-(2-吗啉代乙氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮，分子量为510.6。该式(I)所示化合物可自行设计路线进行合成，具体可按以下合成路线进行合成：

其中，化合物1的化学名称为：7-羟基-3-(3-羟基-4-甲氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮，化合物2的化学名称为：1,2-二溴乙烷，中间产物3的化学名称为：7-(2-溴乙氧基)-3-(3-(2-溴乙氧基)-4-甲氧基苯基)-4H-苯并吡喃-4-酮，化合物4的化学名称为：吗啉；化合物5的化学名称为：3-(4-甲氧基-3-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-7-(2-吗啉代乙氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮。

具体的合成方法为：

1)取7-羟基-3-(3-羟基-4-甲氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮(300mg)和1,2-二溴乙烷按1：8的摩尔比溶解于13mL丙酮中，然后用三乙胺调节体系的pH＝10，室温条件下反应8h，待反应结束后，旋干，向所得残渣中加入200ml乙酸乙酯,用300mL*3的水洗三次，之后用无水硫酸钠干燥，上硅胶柱纯化(洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：4，体积比)，得到中间产物3(收率60％)；

2)取中间产物3(100mg)和吗啉按1：1的摩尔比溶解于10mL丙酮中用三乙胺调节体系的pH＝10，室温条件下反应6h，待反应结束后，旋干，向所得残渣中加入150ml乙酸乙酯，用200mL*3的水洗三次，用无水硫酸钠干燥，上硅胶柱纯化上硅胶柱纯化(洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3，体积比)，得到黄色固体产物即目标产物(收率55％)。

本发明还提供一种治疗ER阴性乳腺癌的药物，该药物含有治疗上有效剂量的下述式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐；

本发明所述治疗ER阴性乳腺癌的药物的剂型可以是药学上可接受的任意剂型，具体可以是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊或注射剂等常规剂型。

申请人的实验结果表明，上述式(I)所示化合物能够下调MALAT1和GPR30的表达水平，并能失活ERK1/2、Akt磷酸化水平，抑制ER阴性乳腺癌细胞的增殖；其中MTT实验表明，式(I)所示化合物在15μM时抑制SKBR3、MDA-MB-468增殖效果最明显，而相同浓度的毛蕊异黄酮(15μM)对SKBR3、MDA-MB-468细胞增殖无明显作用。

附图说明

图1为用不同浓度的式(I)所示化合物及其毛蕊异黄酮作用ER阴性乳腺癌细胞SKBR3、MDA-MB-468量效曲线图，*p＜0.05vs control；

图2为式(I)所示化合物影响SKBR3中MALAT1基因表达柱状图，*p＜0.05vscontrol；

图3为式(I)所示化合物影响SKBR3中GPR30基因表达的柱状图，*p＜0.05vscontrol；

图4为式(I)所示化合物影响SKBR3中ERK1/2的磷酸化的WB图；

图5为式(I)所示化合物影响SKBR3中ERK1/2的磷酸化的柱状图，*p＜0.05vscontrol；

图6为式(I)所示化合物影响SKBR3中Akt的磷酸化的WB图；

图7为式(I)所示化合物影响SKBR3中Akt的磷酸化的柱状图，*p＜0.05vscontrol；

图8为式(I)所示化合物抑制荷瘤裸鼠生长曲线，*p＜0.05vs control；

图9为式(I)所示化合物抑制荷瘤裸鼠肿瘤重量的柱状图，*p＜0.05vs control。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：本申请以下各实验例中用到的式(I)所示化合物的合成：

按以下合成路线合成得到：

其中，化合物1的化学名称为：7-羟基-3-(3-羟基-4-甲氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮，化合物2的化学名称为：1,2-二溴乙烷，中间产物3的化学名称为：7-(2-溴乙氧基)-3-(3-(2-溴乙氧基)-4-甲氧基苯基)-4H-苯并吡喃-4-酮，化合物4的化学名称为：吗啉；化合物5的化学名称为：3-(4-甲氧基-3-(2-吗啉代乙氧基)苯基)-7-(2-吗啉代乙氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮。

具体的合成方法为：

1)取7-羟基-3-(3-羟基-4-甲氧基)-4H-苯并吡喃-4-酮(300mg)和1,2-二溴乙烷按1：8的摩尔比溶解于13mL丙酮中，然后用三乙胺调节体系的pH＝10，室温条件下反应8h，待反应结束后，旋干，向所得残渣中加入200ml乙酸乙酯,用300mL*3的水洗三次，之后用无水硫酸钠干燥，上硅胶柱纯化(洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：4，体积比)，得到中间产物3(收率60％)；

2)取中间产物3(100mg)和吗啉按1：1的摩尔比溶解于10mL丙酮中用三乙胺调节体系的pH＝10，室温条件下反应6h，待反应结束后，旋干，向所得残渣中加入150ml乙酸乙酯，用200mL*3的水洗三次，用无水硫酸钠干燥，上硅胶柱纯化上硅胶柱纯化(洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：3，体积比)，得到黄色固体产物(收率55％)。

对本实施例所得黄色固体产物采用核磁共振进行表征，其氢谱和碳谱如下：

¹H>

¹³C>

因此，可以确定本实施例所得黄色固体产物即为式(I)所示化合物，其结构式如下述式(I)所示：

下面结合实验进一步说明式(I)所示化合物在制备治疗ER阴性乳腺癌的药物中的应用。

以下各实验例中所有数据用mean±SEM表示，统计学比较采用单因素方差分析并用Tukey’s test进行组间比较。

试验药物：按本发明实施例1所述方法制得的式(I)所示化合物(下面以CAG002作为其简称)，溶于DMSO中制成浓度为100mM的储备液，储于4℃备用。

试剂：RPMI-1640，小牛血清(FBS)，磷酸盐缓冲液(PBS)，青霉素-链霉素(P/S)和0.25％(W/V)胰蛋白酶/1mM EDTA(Trypsin-EDTA)购于Invitrogen(USA)。PCR逆转录试剂盒购于Sigma(St Louis，MO)。MTT检测试剂盒由Roche(Mennheim，Germany)提供。GPR30、磷酸化ERK1/2抗体，ERK1/2抗体，磷酸化Akt抗体，Akt抗体及辣根过氧化酶(HRP)标记的抗兔IgG二抗均从Cell Signaling Technology(Beverly，MA)购得。

细胞培养：人ER阴性乳腺癌(SKBR3,MDA-MB-468，ATCC，Manassas)采用RPMI-1640培养，其中含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％FBS，于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

实验例1：MTT法检测内皮细胞增殖

取长至90％融合的SKBR3,MDA-MB-468，清洗、消化后制成细胞悬液。计数后，按1x10⁴/孔接种于96孔板，培养24h待细胞完全贴壁。实验组设不同浓度的CAG002(1μM～15μM)加药组别，每组9个复孔，按200μl/孔加入含药低血清培养液。同时设置两组对照，空白对照组为0.1％DMSO的培养液，阳性对照为15μM的毛蕊异黄酮。

MTT结果显示，CAG002能够剂量依赖的抑制ER阴性乳腺癌细胞(SKBR3,MDA-MB-468)的增殖。其中药物浓度为15μM时，抑制效果最为明显，与空白对照相比抑制率达48.02％、37.79％(p<0.05)，而阳性组抑制率为2.55％、3.07％(p>0.05)。不同浓度的CAG002对ER阴性乳腺癌细胞(SKBR3、MDA-MB-468)增殖的影响如图1所示。

实施例2:长链非编码芯片检测CAG002影响ER阴性乳腺癌细胞SKBR3基因表达

SKBR3培养在10cm²培养皿中至90％融合。移去原培养液后，用含15μM>

表1：长链非编码芯片检测CAG002影响ER阴性乳腺癌细胞SKBR3基因表达

实施例3：实时定量PCR检测MALAT1、GPR30基因表达

SKBR3培养在10cm²培养皿中至90％融合。移去原培养液后，用含15μM>TM>

CAG002影响HUVECs中MALAT1和GPR30基因表达量的柱状图分别如图2和图3所示。结果显示，15μM CAG002能下调SKBR3的MALAT1、GPR30基因水平，下调比例分别为对照组的0.217及0.386倍。

实施例3：免疫印记杂交(Western Blot)检测ER、GPR30、ERK1/2蛋白激酶

SKBR3培养在10cm²培养皿中至90％融合。移去原培养液后，用含15μM>

根据MTT及PCR结果，选择15μM作为实验药物浓度。由图4-7可知，15μM CAG002能抑制SKBR3，中ERK1/2、Akt的磷酸化，而细胞中总ERK1/2及总Akt的表达量并未有明显改变。

实施例4：荷瘤裸鼠实验

人ER阴性乳腺癌细胞株SKBR3经培养传代扩增，经胰酶消化离心沉淀后制成约细胞悬液。取BALB/c裸鼠，用装有细胞悬液的注射器刺入裸鼠腋部皮下，将细胞悬液注入裸鼠皮下，每只大约0.1ml(1×10⁷个细胞)，缓慢退针，制成人乳腺癌荷瘤裸鼠模型。术后用游标卡尺测量肿块，种瘤后10d进行分组。成瘤裸鼠每组10只，分为用药组(30mg/kg)和阴性对照组。腹腔注射给药，每日1次，共20次，无药物组同样途径给予等体积量PBS，游标卡尺测量肿块长宽。20天后处死动物，分离肿瘤周边皮肤及非肿瘤组织，电子天平称重。

CAG002抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长如图8-9所示。与模型组相比，30mg/kg CAG002能抑制荷瘤裸鼠SKBR3生长曲线、减轻肿瘤重量，这与体外结果是一致的。

结论：

CAG002能产生GPR30、MALAT1抑制剂效应。MALAT1、GPR30被认为均能介导雌激素的快速非基因组效应，在ER阴性乳腺癌细胞中上述两者的上调可以促进细胞增殖，抑制凋亡。上述实验结果显示，CAG002均能通过下调MALAT1和GPR30的表达水平，比毛蕊异黄酮更能抑制ER阴性乳腺癌细胞增殖，因此，CAG002比毛蕊异黄酮更有希望成为抗肿瘤药物。

MTT实验表明CAG002能抑制SKBR3，MDA-MB-468增殖，在15μM效果最明显；而毛蕊异黄酮(15μM)对SKBR3，MDA-MB-468细胞增殖无明显作用。

长链非编码RNA芯片表明，CAG002能下调SKBR3细胞116个lncRNAs水平，其中以MALAT1最为明显。实时定量PCR及免疫印记杂交的结果显示CAG002能下调SKBR3，MDA-MB-468的GPR30、MALAT1基因水平，抑制细胞ERK1/2、Akt磷酸化。丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)家族及PI3K中的ERK1/2、Akt是介导细胞增殖的一类重要信号蛋白，可通过胞浆和核中其下游的信号分子发挥调节乳腺癌细胞增殖的作用。因此本申请考察了CAG002对ERK1/2、Akt活性的影响，发现它下调ERK1/2、Akt磷酸化水平。

以上结果提示CAG002通过下调GPR30、MALAT1水平，失活ERK1/2、Akt磷酸化水平，抑制ER阴性乳腺癌细胞的增殖。

动物实验结果显示，CAG002对荷瘤裸鼠具有很强的抑制增殖作用，用药组肿瘤生长曲线明显慢于对照组，肿瘤重量也较对照组减轻，结果说明体内外结果是一致的。