ZmCCT9在调控玉米开花期性状中的应用

摘要

本发明公开了ZmCCT9在调控玉米开花期性状中的应用。实验证明。本发明公开的ZmCCT9为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列3的第1‑275位的蛋白质；A2)将序列表中序列3的第1‑275位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的ZmCCT9及其编码基因可以调控植物的开花期，导入ZmCCT9编码基因并表达ZmCCT9的植物开花期延长，敲除ZmCCT9编码基因的植物开花期缩短，表明，ZmCCT9及其编码基因可以用来调控植物开花期。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，ZmCCT9在调控玉米开花期性状中的应用。

背景技术

开花是植物从营养生长向生殖生长转变的重要过程。当植物生长发育到一定时期，在合适的光照、温度、水分和营养条件下，植物叶片产生的成花素信号经维管束运输到茎尖分生组织，诱导相关成花基因的表达，进而分化出花原基，进一步发育形成花器官。开花期是作物重要的农艺性状之一，开花期的长短决定了作物生育期的长短，且在一定程度上制约着作物的地区及季节适应性。开花期属于典型的数量性状且受微效多基因控制。近年来，研究人员通过图位克隆和筛选突变体等方法在植物开花期调控方面取得了重大进展，克隆了许多开花期相关的基因。研究表明，控制开花期的途径主要有以下4种：即光周期途径、春化途径、自主开花途径和赤霉素途径，其中光周期途径的研究最深入。与模式植物拟南芥和水稻相比，玉米在开花期调控方面的研究还有待进一步加强和完善。

玉米(Zea mays ssp.mays)是由约1万年前分布于墨西哥南部的大刍草(Zea maysssp.parviglumis)驯化而来。虽然大刍草仅分布在墨西哥南部的较小区域内，但现代栽培玉米已经遍布世界各地，已成为世界上种植最广泛的作物之一。热带玉米对光周期敏感，只有在短日照低纬度地区才能正常开花结实，在长日照高纬度地区表现出不开花或延迟开花的特性，这极大地阻碍了优良种质资源的充分利用。而温带玉米则对光周期不敏感，可以在长日照高纬度地区正常开花结实。因此，光周期敏感性的降低在玉米从短日照低纬度地区向长日照高纬度地区扩散分布的过程中起着关键的作用。目前，玉米中调控开花期且功能研究相对完善的基因有ZCN8、DLF1、ZmCCT和VGT1。ZCN8基因是拟南芥FT基因和水稻Hd3a和RFT1基因在玉米中的直系同源基因，并且作为成花素基因发挥其功能。ZCN8主要在叶片表达，合成的ZCN8蛋白通过维管束运输到茎尖分生组织与拟南芥FD基因的直系同源基因DLF1基因发生互作，共同促进下游成花基因的表达，从而促进玉米由营养生长向生殖生长的转变，进而促进开花。ZmCCT是水稻Ghd7基因在玉米中的直系同源基因并在玉米光周期反应中发挥了重要的功能。在长日照条件下，大刍草ZmCCT等位基因比温带玉米ZmCCT等位基因表达量高且抑制ZCN8基因的表达，从而导致晚开花。VGT1作为ZmRAP2.7基因的顺式作用因子负向调控ZmRAP2.7基因的表达。ZmRAP2.7基因是拟南芥TOE1基因在玉米中的直系同源基因且负向调控玉米开花。

近年来随着生物技术的发展，玉米开花期调控机理的研究取得了巨大的发展。但玉米开花期调控机理还没有得到完全的解析。因此，克隆和解析调控玉米开花期的新基因对进一步了解和完善玉米开花期调控机理、扩大玉米种植范围、玉米分子育种、新品种的培育、种质资源的评价和栽培技术的创新具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的是利用名称为ZmCCT9的蛋白质及其编码基因调控植物的开花期性状。

本发明首先提供了ZmCCT9在调控植物开花期性状中的应用；ZmCCT9为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列3的第1-275位的蛋白质；

A2)将序列表中序列3的第1-275位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3的第1-275位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL

上述A2)中的ZmCCT9蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A2)中的ZmCCT9蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的ZmCCT9蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述A3)的蛋白质可为序列3的第1-275位与GFP的融合蛋白质。

本发明还提供了与ZmCCT9相关的生物材料在调控植物开花期性状中的应用；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码ZmCCT9的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低ZmCCT9表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)：

b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或基因组DNA分子；

b2)序列表中序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码ZmCCT9的cDNA分子或基因组DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码ZmCCT9的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，序列2所示的DNA分子编码序列3的第1-275位所示的ZmCCT9蛋白质。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码ZmCCT9蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的ZmCCT9蛋白质的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ZmCCT9蛋白质且具有ZmCCT9蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3的第1-275位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述90％或90％以上同一性，可为95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码ZmCCT9蛋白质的核酸分子的表达盒(ZmCCT9基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达ZmCCT9蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动ZmCCT9基因转录的启动子，还可包括终止ZmCCT9基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128

(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes>

可用现有的表达载体构建含有所述ZmCCT9基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pCUN-GFP载体、pCBC-MT1T2载体或pBUE411载体。

B3)所述重组载体可含有序列2的DNA序列。进一步B3)所述重组载体具体可为pCUN-GFP-ZmCCT9。所述pCUN-GFP-ZmCCT9为将pCUN-GFP载体的BamHⅠ和SpeⅠ识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的DNA分子得到的表达序列3所示的ZmCCT9与GFP的融合蛋白质的重组载体。

B8)所述核酸分子可为利用crisper/cas9的方法降低ZmCCT9表达的核酸分子，如靶向编码ZmCCT9的核酸分子的gRNA。所述gRNA的靶序列具体可为序列1的第369-388位和/或序列1的第2734-2753位。

B9)所述重组载体具体可为pBUE411-ZmCCT9。所述pBUE411-ZmCCT9为将pBUE411载体经BsaI酶切后得到的载体骨架与序列表中序列4所示的DNA片段经BsaI酶切后得到的DNA片段连接得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌EHA105。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了调控植物开花性状产品，所述产品含有ZmCCT9或所述生物材料。

所述产品可以ZmCCT9或所述生物材料作为其活性成分，还可将ZmCCT9或所述生物材料与其他具有相同功能的物质一起作为其活性成分。

本发明还提供了下述X1)或X2)或X3)或X4)的方法：

X1)培育长开花期植物的方法，包括：使受体植物中表达ZmCCT9，提高受体植物中ZmCCT9的含量，或，提高受体植物中ZmCCT9的活性；

X2)延长植物开花期的方法，包括：使受体植物中表达ZmCCT9，提高受体植物中ZmCCT9的含量，或，提高受体植物中ZmCCT9的活性；

X3)培育短开花期植物的方法，包括：降低受体植物中ZmCCT9的含量，或降低受体植物中ZmCCT9的活性；

X4)缩短植物开花期的方法，包括：降低受体植物中ZmCCT9的含量，或降低受体植物中ZmCCT9的活性。

上述方法的X1)和X2)所述方法均可通过向所述受体植物中导入ZmCCT9的编码基因实现。

X3)和X4)所述方法均可通过敲除所述受体植物中ZmCCT9的编码基因实现。敲除所述受体植物中ZmCCT9的编码基因可通过crisper/cas9的方法实现。crisper/cas9的方法所用靶序列可为序列1的第369-388位和/或序列1的第2734-2753位。

上述方法中，ZmCCT9的编码基因可为B1)所述核酸分子。

在本发明的实施例中，所述ZmCCT9蛋白质的编码基因(即序列2所示的DNA分子)通过含有ZmCCT9基因表达盒的ZmCCT9基因重组表达载体导入目的植物中。

上述方法中，其中所述ZmCCT9基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述ZmCCT9基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述ZmCCT9基因表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

X1)和X2)所述方法还包括从导入序列2所示的ZmCCT9的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株得到长开花期植物。X3)和X4)所述方法还包括从敲除所述编码基因的植物中筛选所述编码基因突变的植物得到短开花期植物。

本发明中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为玉米。

实验证明，本发明的ZmCCT9及其编码基因可以调控植物的开花期，导入ZmCCT9编码基因并表达ZmCCT9的植物开花期延长，敲除ZmCCT9编码基因的植物开花期缩短，表明，ZmCCT9及其编码基因可以用来调控植物开花期。

附图说明

图1为空载对照植株和阳性ZmCCT9基因转基因植株中ZmCCT9基因表达量的检测。

图2为空载对照植株和阳性ZmCCT9基因转基因植株在长日照条件下的表型示意图。标尺大小代表20cm。

图1和图2中，过表达阳性植株均表示阳性ZmCCT9基因转基因植株。

图3为野生型和阳性ZmCCT9基因敲除植株在长日照条件下的表型示意图。标尺大小为20cm。

图4为野生型和阳性ZmCCT9基因敲除植株在长日照条件下的开花期数据比较示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的玉米自交系W22(Huang et al.，Identification and finemapping of quantitative trait loci for the number of vascular bundle in maizestem，Journal of Integrative Plant Biology，January 2016，Volume 58，Issue 1，81–90)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pCBC-MT1T2载体和pBUE411载体均记载在文献(Xing et al.，ACRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editing in plants，BMC Plant Biology2014,14:327)中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、ZmCCT9基因转基因植株的制备及表型鉴定

本发明提供了来源于玉米W22的一个名称为ZmCCT9基因的基因，W22中ZmCCT9基因的基因组序列为序列表中序列1，序列1的第797-2599位为ZmCCT9基因的内含子；ZmCCT9基因的CDS序列为序列表中序列2，将该序列记为ZmCCT9编码基因，ZmCCT9编码基因编码序列表中序列3的第1-275位所示的ZmCCT9蛋白质。

1)重组载体的构建

表达载体pCUN-GFP-ZmCCT9的构建：将pCUN-GFP载体的BamHⅠ和SpeⅠ识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2所示的DNA分子(即ZmCCT9编码基因)，得到重组载体，将该重组载体命名为pCUN-GFP-ZmCCT9，pCUN-GFP-ZmCCT9能表达序列表中序列3所示的ZmCCT9与GFP的融合蛋白质。其中，序列3的第1-275位为ZmCCT9的序列，第280-518位为GFP的序列。pCUN-GFP载体的构建方法如下：将pCAMBIA1300(CAMBIA公司)中的植物选择基因Hpt替换为Bar基因，并将KpnⅠ和SacⅠ识别序列间的DNA片段替换为GFP基因。

2)转基因植株的制备

将步骤1)的pCUN-GFP-ZmCCT9导入到农杆菌EHA105中，得到重组菌EHA105-pCUN-GFP-ZmCCT9，按照农杆菌介导的转基因方法利用EHA105-pCUN-GFP-ZmCCT9对高转化效率的玉米受体材料ZC01(Li et al.，RNA-guided Cas9as an in vivo desired-targetmutator in maize，Plant Biotechnology Journal(2017),pp.1–11)的幼胚进行转化，利用Bar基因对转化的愈伤组织进行筛选，最后得到转基因植株。同时设置转空载体作为对照。

3)转基因阳性植株鉴定

提取转基因植株和空载对照植株的基因组DNA，用载体上的Bar基因特异引物Bar-F/Bar-R和跨ZmCCT9基因内含子的引物304-F/300-R分别进行PCR扩增。

PCR扩增的反应体系：玉米基因组DNA模板1μl(100ng/μl)，正向引物0.5μl(10pmol/μl)，反向引物0.5μl(10pmol/μl)，2×Taq PCR StarMix with Loading Dye(GenStar康润生物公司)5μl，超纯水3μl。总反应体系为10μl。

PCR扩增的反应条件：①95℃10min，②95℃45s，③57℃45s，④72℃30s，⑤从②-④循环35次，⑥72℃10min，⑦4℃保存。

如果Bar-F/Bar-R引物可以扩增出目标条带，而304-F/300-R扩增不出条带，则说明该植株为转基因空载对照植株。如果Bar-F/Bar-R引物可以扩增出目标条带且304-F/300-R也可以扩增出目标条带，则说明该植株是阳性ZmCCT9基因转基因植株。

相关引物的序列如下：

Bar-F(正向引物)：5’-TTTCGGTGACGGGCAGGAC-3’；

Bar-R(反向引物)：5’-TGCACCATCGTCAACCACTA-3’。

304-F(正向引物)：5’-GACAGCAATCCAGCGACGACGT-3’；

300-R(反向引物)：5’-GTAGCGAATCTGCTTCTCGTAG-3’。

4)阳性ZmCCT9基因转基因植株ZmCCT9基因表达水平的鉴定

ZmCCT9基因所用引物为304-F(正向引物)和300-R(反向引物)。

提取各植株的总RNA，并进行反转录得到cDNA，利用各引物对用荧光定量PCR仪ABI7500(ABI Life Technologies，美国)进行qRT-PCR分析，每个样品3个生物学重复，每个生物学重复进行3次技术性重复。以玉米ZmTubulin1基因作为内参。

相关引物的序列如下：

ZmTubulin1-F:5’-GTGTCCTGTCCACCCACTCTCT-3’；

ZmTubulin1-R:5’-GGAACTCGTTCACATCAACGTTC-3’。

扩增体系：5ng/μl的cDNA 4μl，2×SYBR Mix 4.8μl，DyeⅡ0.2μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl。

扩增条件：95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火延伸34s，40个循环。

PCR反应结束后，分析各个样品的扩增曲线和溶解曲线以确定实验结果的可信度，然后用Excel通过2^-ΔCt法分析ZmCCT9基因相对于内参基因的表达倍数并计算标准误差，对最终结果作图。

结果表明，ZmCCT9基因的表达量在阳性ZmCCT9基因转基因植株中显著高于空载对照植株，如图1所示。

5)阳性ZmCCT9基因转基因植株表型的鉴定

在长日照条件下，阳性ZmCCT9基因转基因植株开花期明显晚于空载对照植株，当空载对照植株已经开花散粉时，阳性ZmCCT9基因转基因植株还没有发生从营养生长到生殖生长的转变(图2)。因此，通过转基因证实ZmCCT9基因具有延迟开花期的功能。

实施例2、ZmCCT9基因敲除植株的制备及表型鉴定

本实施例通过敲除ZmCCT9基因进一步确定ZmCCT9基因在玉米生长发育中的功能，具体方法如下：

1)重组载体的构建

以序列表中序列2所示的DNA分子(即ZmCCT9编码基因)为基础设计两个Cas9蛋白的剪切位点，如剪切位点1和剪切位点2所示。分别将剪切位点1和剪切位点2序列整合进引物对ZmCCT9_Cas9-F和ZmCCT9_Cas9-R。然后以pCBC-MT1T2载体为DNA模板，用引物对ZmCCT9_Cas9-F和ZmCCT9_Cas9-R进行扩增，将得到的序列中正确的DNA片段记为pCBC-MT1T2-ZmCCT9片段(其序列为序列表中序列4)。将pCBC-MT1T2-ZmCCT9片段、pBUE411载体、BsaI限制性内切酶(New England Biolabs)和T4连接酶(New England Biolabs)一起进行酶切/连接反应，将序列正确的重组载体记为pBUE411-ZmCCT9载体。pBUE411-ZmCCT9载体为将pBUE411载体经BsaI酶切后得到的载体骨架与pCBC-MT1T2-ZmCCT9片段经BsaI酶切后得到的DNA片段连接得到的重组载体。

相关位点和引物的序列如下：

剪切位点1：5’-ACCGCGGGTTTCCCGGGATG-3’(序列1的第369-388位)。

剪切位点2：5’-GATTCGCTACGCTTCCCGTA-3’(序列1的第2734-2753位)。

ZmCCT9_Cas9-F：5’-GGTCTCTGGCGACCGCGGGTTTCCCGGGATGGTTTTAGAGCTAGAAATA-3’；

ZmCCT9_Cas9-R：5’-GGTCTCTAAACTACGGGAAGCGTAGCGAATCCGCTTCTTGGTGCC-3’。

2)转基因植株的制备

将步骤1)的pBUE411-ZmCCT9导入到农杆菌EHA105中，得到重组菌EHA105-pBUE411-ZmCCT9，按照农杆菌介导的转基因方法利用EHA105-pBUE411-ZmCCT9对高转化效率的玉米受体材料ZC01的幼胚进行转化，将Bar基因作为选择标记基因对转化的愈伤组织进行选择，最后得到ZmCCT9基因敲除植株。

3)ZmCCT9基因敲除植株鉴定

提取ZmCCT9基因敲除植株和野生型植株(玉米受体材料ZC01)的基因组DNA，用Bar基因特异引物Bar-F/Bar-R和两对分别跨剪切位点1(TS1-F/TS1-R)和剪切位点2(TS2-F/TS2-R)的引物扩增。

如果Bar-F/Bar-R引物可以扩增出目标条带且TS1-F/TS1-R和/或TS2-F/TS2-R的扩增产物在目标剪切位点与野生型片段相比存在小片段的插入和/或缺失，则说明该植株是阳性ZmCCT9基因敲除植株。PCR扩增的反应体系与反应条件同实施例1步骤3)。

TS1-F(正向引物)：5’-GGTTGCACAGAACCACTCAA-3’；

TS1-R(反向引物)：5’-CAGCTGGCCGTACTGAGC-3’。

TS2-F(正向引物)：5’-AGAATTGGATCTGGGTCCTTGT-3’；

TS2-R(反向引物)：5’-TCCCTCTACGGGAGTATTTGG-3’。

鉴定得到的三个阳性ZmCCT9基因敲除植株分别记为敲除系1、2和3，和野生型植株相比，敲除系1ZmCCT9基因中缺失序列表中序列1的第382-395位与第2750-2751位，敲除系2ZmCCT9基因中缺失序列表中序列1的第369-393位与第2750位，敲除系3ZmCCT9基因中缺失序列表中序列1的第382-385位与第2745-2751位。

4)阳性ZmCCT9基因敲除植株表型的鉴定

在长日照条件下，三个阳性ZmCCT9基因敲除植株(敲除系1、2和3)的开花期均明显早于野生型植株(图3和图4)。说明ZmCCT9基因能调控玉米开花期。

<110> 中国农业大学

<120> ZmCCT9在调控玉米开花期性状中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3175

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 1

ctctctctct ctccctctct tcgttctcct ccacacaccg agccgaccga gcacatcatc 60

attctctcgc aaggcaccgc gtgtacgagc tagccaagcg gccggggcag aagcaaacaa 120

gctcacacaa accacacgcg gagagccaga ggagtggtgg aaggaggagg aagagcgagg 180

ggtcaagggc tcaagctcaa gagagagcga gtgagttcac tcaacgtgcg gcggcggcga 240

cgtcctacgt cctacgcaca ggatgtcggc gtcgagcgcc gcgtgccgcg tatgtggcgg 300

cgtagcggag tgcgcgtgcc acggccacgg cgccggcgcg cggtgcgggg ccgccgtcgc 360

ggacctcaac cgcgggtttc ccgggatgtg gcaccagcac caccagcagc cggaggagga 420

ggagcccagc gtcgccggcg gtggcgcggc ggcggggctg caggagttcc agttcttcgg 480

ccacgacgac gaccacgaca gcgtggcgtg gctgttcaac gacccggcgc cccacctgca 540

ccgcggcccg gcgccggccg cgggcgcggc cgggaacggg gttgtggccg aggccgcgca 600

gcggagagcg ccgctgttcg acgggtacgc gcacgctcag tacggccagc tgccgggcca 660

cgggctcatg ttcgacgtgc cgctgggccg gggcggcgac gacgacgcgg cggtgctgga 720

ggcagggctg gggctaggcg gcgccggcgc cggcgccggc gacagcaatc cagcgacgac 780

gtccagcgcc acaatcgtga gtgcttcgat tatccatctc tgtgtcctca atcgtcgtga 840

gtcgtgaccc ccgtcgacaa gtccaataat aatttcaaag ctgatatgca tgcgattcgt 900

gttacgtggt tgtgcacaat tgcgtgcggt taattgcttc atatgcttga gagggagatt 960

taaaagatcg agctacgtac gtcctaattt cgctagctta atttgcattg tactataccc 1020

agattttaat ttggccgata acacaagtga ttattggaaa cgtcaaaaag ccgccaattt 1080

gtggtccagc gtcactccga ctagtaagga gtaggactac gtacggagct agctagctag 1140

tccaaaacag tgcaccgtca cgactataag tcacagtcct gtctttcttc tttcttcctt 1200

ctcctcttct acctttccaa ctcaatagga taaaagtcac attattaaag cctgacttta 1260

ggcctattta tttgaaatta taatctatcc agacatataa tctaatatat tttaaactaa 1320

gtgttagttc aaaatatgtt acatcatata atcttgacaa actatatgta atcccaaaca 1380

aacgagctct ttgtttatat caacgaaatt cctggtaatc ataagatctg catcaagcca 1440

tcaacgctta ttagatcgga cagctctacc tatatatcta tcaaaccatc tatctataca 1500

tctatctata ctaagaagaa ggtacagaaa ttgcaaagcc atgcatacac attataattt 1560

acatttacag tatagtataa gaagatagaa ggggaacaat cgcggagaac atcatcagtt 1620

aattgcagtt atacttcatt tgttcagtgg ctagtgagaa cactaaaatt aagctagtat 1680

gacaacatga cggaattttg attgggttta caatgatgca caaatgaagt ggaacaaggt 1740

ccttgcccaa atacaaggtt tttctttttc tttttccttt acccttcagt gtcgctatct 1800

ttctgacaac atgctgataa ttacaaaaac tggcaaatac aattttcgtt cttttctccc 1860

ttgctaccgc tatttgtcta tcattgtgct cacgacgggc cgtgaagata accctggcca 1920

acaggcagct actcaattct catttcatgt ggttctgttc tacgtacaat attgatccca 1980

acttctcatc atttctgttg agtagtactg tcatctcttt ttttttctga aaaggattga 2040

gtagtgttat cttactgagt gctgccacac tgtaaccagt ttccgaatat aacagcaagt 2100

ttaataatac agctgacttc tgacggtaaa gatcattgca gcctgctatt tagccaacct 2160

atataatagt taactcttca ctattaatgc atgattctac ctcacaaatt tttttgttct 2220

aatatccgct tctcctgtct ctactcttct ctttcctcca cataagcatt tagacaactt 2280

atatcatcta aacagaagcg atgttatctt actgaatgtt gtcatggccc atagctcatc 2340

tcaaaagcag gaatccatgt gagagaattg gatctgggtc cttgtaattt tattccatta 2400

tttatgatca aattaagatg gcgctacatg catctaggaa tgtagtgggt tcctgaagtg 2460

ttatgtgggt cagctagtcc agttcgtcat ttcttcccct acatggctaa caacatgcat 2520

gttggagttt acatccgatc cctacacatg catcggcggt gccttattat gttggatcga 2580

cacgtacgtc ctttttcaga tgtccttctg cgggagcacg ttcaccgacg cggcggccaa 2640

cggcagcgca agcggcgccg acccggcagt ggaccgggag gcgaaggtga tgcggtacaa 2700

ggagaagcgg aagaggaggc gctacgagaa gcagattcgc tacgcttccc gtaaggcgta 2760

cgcggagatg cggccgcgcg tcaagggccg cttcgccaag gtgcccgacg gtgatgctcc 2820

cgcgccacca gcgccggccg ctgcgggggg ctacgaacca ggccggctcg acctcggatg 2880

gttccgttca tagcaaacac ctatgtcggt cacatcatta gcggactcca acggaacccc 2940

ggccccctcc cctgccgggc atggagtgcc ccggcggctt tccctcgcct ccatcggcgc 3000

ccacacggtg gccccctcgt ggggtgagac aaccaaatac tcccgtagag ggactctaat 3060

ctctctctcc actaattaat tgtatttagt gtaaaattaa ctttttagta taattagcag 3120

ataacaatgt gtattattac ggtactataa atatgatagt attttttaaa acttc 3175

<210> 2

<211> 825

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 2

atgtcggcgt cgagcgccgc gtgccgcgta tgtggcggcg tagcggagtg cgcgtgccac 60

ggccacggcg ccggcgcgcg gtgcggggcc gccgtcgcgg acctcaaccg cgggtttccc 120

gggatgtggc accagcacca ccagcagccg gaggaggagg agcccagcgt cgccggcggt 180

ggcgcggcgg cggggctgca ggagttccag ttcttcggcc acgacgacga ccacgacagc 240

gtggcgtggc tgttcaacga cccggcgccc cacctgcacc gcggcccggc gccggccgcg 300

ggcgcggccg ggaacggggt tgtggccgag gccgcgcagc ggagagcgcc gctgttcgac 360

gggtacgcgc acgctcagta cggccagctg ccgggccacg ggctcatgtt cgacgtgccg 420

ctgggccggg gcggcgacga cgacgcggcg gtgctggagg cagggctggg gctaggcggc 480

gccggcgccg gcgccggcga cagcaatcca gcgacgacgt ccagcgccac aatcatgtcc 540

ttctgcggga gcacgttcac cgacgcggcg gccaacggca gcgcaagcgg cgccgacccg 600

gcagtggacc gggaggcgaa ggtgatgcgg tacaaggaga agcggaagag gaggcgctac 660

gagaagcaga ttcgctacgc ttcccgtaag gcgtacgcgg agatgcggcc gcgcgtcaag 720

ggccgcttcg ccaaggtgcc cgacggtgat gctcccgcgc caccagcgcc ggccgctgcg 780

gggggctacg aaccaggccg gctcgacctc ggatggttcc gttca 825

<210> 3

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ser Ala Ser Ser Ala Ala Cys Arg Val Cys Gly Gly Val Ala Glu

1 5 1015

Cys Ala Cys His Gly His Gly Ala Gly Ala Arg Cys Gly Ala Ala Val

202530

Ala Asp Leu Asn Arg Gly Phe Pro Gly Met Trp His Gln His His Gln

354045

Gln Pro Glu Glu Glu Glu Pro Ser Val Ala Gly Gly Gly Ala Ala Ala

505560

Gly Leu Gln Glu Phe Gln Phe Phe Gly His Asp Asp Asp His Asp Ser

65707580

Val Ala Trp Leu Phe Asn Asp Pro Ala Pro His Leu His Arg Gly Pro

859095

Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Gly Asn Gly Val Val Ala Glu Ala Ala

100 105 110

Gln Arg Arg Ala Pro Leu Phe Asp Gly Tyr Ala His Ala Gln Tyr Gly

115 120 125

Gln Leu Pro Gly His Gly Leu Met Phe Asp Val Pro Leu Gly Arg Gly

130 135 140

Gly Asp Asp Asp Ala Ala Val Leu Glu Ala Gly Leu Gly Leu Gly Gly

145 150 155 160

Ala Gly Ala Gly Ala Gly Asp Ser Asn Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ala

165 170 175

Thr Ile Met Ser Phe Cys Gly Ser Thr Phe Thr Asp Ala Ala Ala Asn

180 185 190

Gly Ser Ala Ser Gly Ala Asp Pro Ala Val Asp Arg Glu Ala Lys Val

195 200 205

Met Arg Tyr Lys Glu Lys Arg Lys Arg Arg Arg Tyr Glu Lys Gln Ile

210 215 220

Arg Tyr Ala Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Met Arg Pro Arg Val Lys

225 230 235 240

Gly Arg Phe Ala Lys Val Pro Asp Gly Asp Ala Pro Ala Pro Pro Ala

245 250 255

Pro Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Glu Pro Gly Arg Leu Asp Leu Gly Trp

260 265 270

Phe Arg Ser Thr Ser Gly Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe

275 280 285

Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly

290 295 300

His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly

305 310 315 320

Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro

325 330 335

Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser

340 345 350

Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met

355 360 365

Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val

385 390 395 400

Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile

405 410 415

Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile

420 425 430

Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg

435 440 445

His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln

450 455 460

Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr

465 470 475 480

Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp

485 490 495

His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly

500 505 510

Met Asp Glu Leu Tyr Lys

515

<210> 4

<211> 954

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtctctggc gaccgcgggt ttcccgggat ggttttagag ctagaaatag caagttaaaa 60

taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt tttttttcgt 120

tttgcattga gttttctccg tcgcatgttt gcagttttat tttccgtttt gcattgaaat 180

ttctccgtct catgtttgca gcgtgttcaa aaagtacgca gctgtatttc acttatttac 240

ggcgccacat tttcatgccg tttgtgccaa ctatcccgag ctagtgaata cagcttggct 300

tcacacaaca ctggtgaccc gctgacctgc tcgtacctcg taccgtcgta cggcacagca 360

tttggaatta aagggtgtga tcgatactgc ttgctgctca tgaatccaaa ccacacggag 420

ttcaaattcc cacagattaa ggctcgtccg tcgcacaagg taatgtgtga atattatatc 480

tgtcgtgcaa aattgcctgg cctgcacaat tgctgttata gttggcggca gggagagttt 540

taacattgac tagcgtgctg ataatttgtg agaaataata attgacaagt agatactgac 600

atttgagaag agcttctgaa ctgttattag taacaaaaat ggaaagctga tgcacggaaa 660

aaggaaagaa aaagccatac ttttttttag gtaggaaaag aaaaagccat acgagactga 720

tgtctctcag atgggccggg atctgtctat ctagcaggca gcagcccacc aacctcacgg 780

gccagcaatt acgagtcctt ctaaaagctc ccgccgaggg gcgctggcgc tgctgtgcag 840

cagcacgtct aacattagtc ccacctcgcc agtttacagg gagcagaacc agcttataag 900

cggaggcgcg gcaccaagaa gcggattcgc tacgcttccc gtagtttaga gacc 954