用热激蛋白Hsp70基因检测昆虫寿命的方法及应用

摘要

本发明提供了一种用热激蛋白Hsp70基因检测昆虫寿命的方法；检测热激蛋白Hsp70编码基因表达量在检测昆虫寿命中的应用；热激蛋白Hsp70编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。本发明的有益效果是：本发明的试验证明，本发明所提供的检测方法可通过检测热激蛋白Hsp70基因的表达量来检测并评估不同种群的昆虫寿命，主要针对不同食物营养源的大草蛉成虫寿命。试验证明用本方法提供的方法检测昆虫寿命仅需2‑3天，而用传统的生物学方法需要30‑60天。本发明所采用的检测方法简单易行、材料易获得且操作便捷，是一种极为经济实用的适于商品化昆虫产品检验检测的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说涉及一种用热激蛋白Hsp70基因检测昆虫寿命的方法及应用。

背景技术

害虫生物防治在农林业可持续发展及绿色植保中发挥着重要的作用。大草蛉是一种非常优良的天敌资源，在自然界对多种害虫种群数量的消长有显著的控制效果，其主要捕食蚜虫、粉虱、螨类、小型鳞翅目幼虫、蓟马、介壳虫和斑潜蝇幼虫等，具有广泛而深远的应用前景。大量繁殖获得高品质的大草蛉是其成功应用于生物防治的重要条件。目前国际上已实现多种草蛉的商品化生产，通过降低生产成本实现利润最大化是天敌昆虫规模化及商品化生产中极为关键的因素。采用较为经济的室内人工繁殖方法如利用不同的昆虫(替代)猎物、含昆虫成分的人工饲料和不含昆虫成分的人工饲料大量繁殖大草蛉，具有易获得、高繁殖系数、高整齐度和低成本等优点，势必能够大幅度节省生产成本，提高天敌昆虫生防利用率。值得注意的是不同食物繁殖生产的大草蛉生物学特性参差不齐，释放于田间后其生防效果相差各异。

大草蛉成虫寿命是评价天敌昆虫生物学特性的重要参考指标，寿命越长，其生命周期内总产卵量及捕食量越高，天敌种群增长快，倍增时间短，能在短时间内有效控制害虫种群数量的增长，降低防治成本，提高其生防效果。相反，寿命越短，其生命周期内种群扩增能力及捕食量降低，为保障害虫种群数量控制在一定水平，需要额外加大天敌昆虫释放量，大大增加了防治成本，减少了利润。目前，较为传统的评估不同食物饲喂或不同商家来源的大草蛉产品成虫寿命的方法为统计其从羽化当天至自然死亡的时间，耗时费力且高经济投入，因此，亟待寻求一种快速并经济的方法检测天敌昆虫商品重要生物学特性-寿命的方法。

研究表明，热激蛋白Hsp70与衰老过程有着密切的关系，对延长昆虫寿命具有积极作用。

发明内容

本发明克服了现有技术中的不足，本发明的一个目的是提供一种用于检测热激蛋白Hsp70编码基因表达量在检测昆虫寿命中的应用；另一个目的是提供一种用热激蛋白Hsp70基因检测昆虫寿命的方法；另一个目的是提供用于检测热激蛋白Hsp70编码基因的表达量的物质和热激蛋白编码基因。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

检测热激蛋白Hsp70编码基因表达量在检测昆虫寿命中的应用；所述热激蛋白Hsp70的核苷酸序列为序列表中的序列1。

进一步，所述昆虫包括昆虫个体或昆虫种群，所述热激蛋白Hsp70基因编码的蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列2，或序列表中序列1自5’末端第1-1632位核苷酸编码的544个氨基酸序列；

所述昆虫为大草蛉。

进一步，所述用于检测热激蛋白Hsp70编码基因表达量的物质为如下1)-3)中任意一种：

1)引物对A由引物1和引物2组成，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4；

2)含有所述引物对A的qRT-PCR反应体系；

3)含有所述引物对A或包含所述qRT-PCR反应体系所有试剂的试剂盒。

进一步，所述qRT-PCR反应体系的试剂由qRT-PCR扩增缓冲液Mix体系、dNTP、cDNA、由所述引物1作为的上游引物、由所述引物2作为的下游引物、去离子水、荧光染料组成；

所述上游引物、所述下游引物在所述qRT-PCR反应体系中的终浓度均为8-10μM。

进一步，所述反应体系还包括内参引物对B，所述内参引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物3的核苷酸序列为序列表中序列6；

所述引物4核苷酸序列为序列表中序列7。

一种用于检测热激蛋白Hsp70编码基因表达量的qRT-PCR反应体系，所述qRT-PCR反应体系的试剂由引物对A、qRT-PCR扩增缓冲液Mix体系、dNTP、cDNA、去离子水、荧光染料组成；

所述引物对A由引物1和引物2组成，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4；

所述引物1作为所述qRT-PCR反应体系中的上游引物，所述引物2作为所述qRT-PCR反应体系中的下游引物；

所述上游引物、所述下游引物在所述qRT-PCR反应体系中的终浓度均为8-10μM。

进一步，所述反应体系还包括内参引物对B，所述内参引物对B由引物3和引物4组成；

所述引物3的核苷酸序列为序列表中序列6；

所述引物4核苷酸序列为序列表中序列7。

一种用于检测热激蛋白Hsp70编码基因表达量的试剂盒，包括引物对A或包含qRT-PCR反应体系所有试剂。

进一步，所述引物对A由引物1和引物2组成，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4。

进一步，所述qRT-PCR反应体系的试剂由引物对A、qRT-PCR扩增缓冲液Mix体系、dNTP、cDNA、去离子水、荧光染料组成；

所述引物对A由引物1和引物2组成，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4；

所述引物1作为上游引物、由所述引物2作为下游引物，所述上游引物、所述下游引物在所述qRT-PCR反应体系中的终浓度均为8-10μM。

进一步，所述qRT-PCR反应体系还包括内参引物对B，所述内参引物对B由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中序列6；所述引物4核苷酸序列为序列表中序列7。

一种检测昆虫寿命的方法，包括如下步骤：

第一步，用引物对A或qRT-PCR反应体系或试剂盒对待测的昆虫进行qRT-PCR扩增；

第二步，对比所述待测昆虫的热激蛋白Hsp70基因的表达量；

上述方法中所述昆虫一般为昆虫个体或昆虫种群；

所述试剂盒含有所述引物对A或所述qRT-PCR反应体系包含的所有试剂。

进一步，所述引物对A由引物1和引物2组成，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4。

进一步，所述qRT-PCR反应体系由引物对A、qRT-PCR扩增缓冲液Mix体系、dNTP、cDNA、去离子水、荧光染料组成；

所述引物对A由引物1和引物2组成，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4；

由所述引物1作为上游引物、由所述引物2作为下游引物，所述上游引物、所述下游引物在所述qRT-PCR反应体系中的终浓度均为8-10μM。

进一步，所述qRT-PCR反应体系还包括内参引物对B，所述内参引物对B由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中序列6；所述引物4核苷酸序列为序列表中序列7。

进一步，所述qRT-PCR扩增的模板为昆虫cDNA；所述昆虫为大草蛉。

一种热激蛋白编码基因，

所述蛋白的编码蛋白质的核苷酸序列为序列表中序列1；

所述蛋白的编码蛋白质的氨基酸序列为序列表中的序列2。

本发明的有益效果为：本发明的试验证明，本发明所提供的检测方法可通过检测热激蛋白Hsp70基因的表达量来检测并评估不同种群的昆虫寿命，主要针对不同食物营养源的大草蛉成虫寿命。试验证明用本方法提供的方法检测昆虫寿命仅需2-3天，而用传统的生物学方法需要30-60天。本发明所采用的检测方法简单易行、材料易获得且操作便捷，是一种极为经济实用的适于商品化昆虫产品检验检测的方法。

附图说明

图1为大草蛉内参基因Actin(GenBankKC505163)的扩增曲线；

图2为大草蛉内参基因Actin(GenBankKC505163)的熔解曲线；

图3为大草蛉热激蛋白Hsp70基因的扩增曲线；

图4为大草蛉热激蛋白Hsp70基因的熔解曲线；

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1：昆虫热激蛋白Hsp70编码基因的鉴定及其qRT-PCR专用引物的设计

研究表明热激蛋白Hsp70与衰老过程有着密切的关系，对延长昆虫寿命具有积极作用，是一种检测昆虫寿命的很好的分子标记。因此，本发明利用大草蛉热激蛋白Hsp70基因的表达量来检测并评估其寿命。

大草蛉热激蛋白Hsp70的核苷酸序列为序列表中序列1，其编码的氨基酸序列为序列表中的序列2。

针对大草蛉热激蛋白Hsp70基因用于qRT-PCR扩增而设计的专用引物如下：

上游引物：5’-CTGCAGAAGCGTATTTAGGCC-3’(序列3)

下游引物：5’-GCTAATGCTGCTGCTGTCGG-3’(序列4)

实施例2：热激蛋白Hsp70(Heat shock protein 70(HSP70))基因在检测大草蛉寿命中的应用

试验中所用大草蛉(Chrysopa pallens(Rambur)(Neuroptera:Chrysopidae),公众可由中国农业科学院植物保护研究所获得)根据取食猎物和人工饲料分为两组，分别记为昆虫A和昆虫B；各组30-36对，分3次重复；

取食猎物的大草蛉(昆虫A)：饲喂猎物的大草蛉饲养条件为温度(26±1)℃，相对湿度(70±5)％，光周期L:D＝16h：8h。每对雌、雄成虫每天饲喂一定量大豆蚜虫，试验至大草蛉成虫个体自然死亡截止。

取食人工饲料的大草蛉(昆虫B)：饲喂人工饲料的大草蛉饲养条件为温度(26±1)℃，相对湿度(70±5)％，光周期L:D＝16h：8h。每对雌、雄成虫每日饲喂15-20mg粉状饲料，试验至大草蛉成虫个体自然死亡截止。

猎物(大豆蚜虫(Aphis glycines Matsumura))室内以大豆(Glycine max L.,品种为化诱5号)苗为寄主，建立稳定种群供试验所用；

人工饲料配方组成为家蝇蝇蛆脱脂粉10g，全鸡蛋粉(干粉)4g，茶花粉(干粉)2g，蔗糖粉(干粉)2g。

一、大草蛉cDNA的合成

1、大草蛉RNA的提取

采用SV total RNA isolation system kit(Promega,Madison,WI,USA)试剂盒提取RNA，步骤如下：

(1)将各组大草蛉样品放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨之后，加入1ml的RNALysis Buffer(实验用之前加入β-mercaptoethanol)。

(2)用RNA-free枪头将上述裂解液转移至新的1.5ml RNase-free离心管中，上下充分混匀，室温静置反应5min.

(3)加入350μl的RNA Dilution Buffer(RDA,blue)。前后震荡,充分混匀。

(4)70℃加热2min.

(5)常温,12000rpm,离心10min.将上清液转移至新的1.5ml离心管中。

(6)加200μl 95％的乙醇至(5)中的离心管中,用枪轻轻的打匀。

(7)转移(6)中的上清液至离心柱(Spin Columns)中,离心柱置于2ml无盖收集管(Collection Tubes)上。

(8)常温,12000rpm,离心1min.弃滤液。

(9)往离心柱(Spin Columns)中加入600μl的RNA Wash Solution(实验用之前加入100ml 95％的乙醇)。

(10)常温,12000rpm,离心1min.弃滤液。

(11配制DNase incubation mix.具体方法：向RNase-free 200μl的PCR管中依次加入Yellow Core Buffer 40μl,MnCl 25μl,DNase I 5μl，用枪轻轻的混匀。

(12)将上述配好的DNase incubation mix 50μl加入到离心柱(Spin Columns)膜的正中央。室温反应15min.

(13)向离心柱正中央加200μl DNase Stop Solution(实验用之前加入8ml 95％的乙醇)。

(14)常温,12000rpm,离心1min.弃滤液。

(15)向离心柱正中央加600μl RNA Wash Solution,常温,12000rpm,离心1min.弃滤液。

(16)向离心柱正中央加250μl RNA Wash Solution,常温,12000rpm,离心2min.

(17)将离心柱转移至洗脱管(Elution Tubes)中准备收集RNA。

(18)向离心柱正中央加100μl Nuclease-Free Water。常温,12000rpm,离心2min.

(19)重复步骤(18)以提高RNA的洗脱效率。

(20)电泳检测所提RNA的完整性。

(21)NanoDrop ND-1000分光光度计测定260/280比值。

2、反转录

反转录采用Thermo ScientificTM RevertAidTM First Strand cDNASyinthesis Kit(Thermo)试剂盒。在反转录之前，用RQ1RNase-Free DNase(Promega,Madison,USA)去除残留的基因组DNA。

Ⅰ基因组DNA的去除：

(1)将下列试剂按照规定体积加入离心管中，见表1：

表1各组分加入体积

将离心管置于37℃温浴30min；

(2)加1μl RQ1DNase于上述离心管中终止反应

(3)65℃，10min激活DNase

(4)至此，RNA样品已去除基因组DNA，可以用于下一步qRT-PCR反应中。

Ⅱ第一链cDNA的合成(20μl反转录反应体系)：

(1)将下列试剂按照规定体积加入离心管中，见表2：

表2各组分加入体积

(2)将下列试剂按照顺序依次加入上述反应管中，见表3：

表3各组分加入表2对应的离心管

(3)简短离心混匀

(4)42℃温浴60min

(5)70℃，5min终止反应。反应结束后cDNA第一链低温保存或直接用于下一步PCR

反应。

二、qRT-PCR扩增

qRT-PCR扩增反应体系各组分体积见表4，反应程序见表5：

表4荧光定量qRT-PCR反应体系

表5荧光定量qRT-PCR反应程序

以大草蛉Actin(GenBank KC505163，序列5)基因作为内参基因，扩增引物如下：

内参上游引物：5’-TCCAGAAGAACACCCAATCC-3’(序列6)

内参下游引物：5’-ATACACCATCACCAGAGTCAAGT-3’(序列7)。

若取食昆虫猎物的大草蛉组中热激蛋白Hsp70基因的平均表达量显著低于取食人工饲料的大草蛉组，则前者寿命显著短于后者。

qRT-PCR结果如图1-4所示，图1为2组大草蛉内参基因的扩增曲线；图2为2组大草蛉内参基因的熔解曲线；图3为2组大草蛉热激蛋白Hsp70基因的扩增曲线；图4为2组大草蛉热激蛋白Hsp70基因的熔解曲线。结果显示扩增曲线平滑，重复性较好；熔解曲线呈现单一峰值，表示无非特异性扩增，荧光定量结果准确。

qRT-PCR中各处理组大草蛉内参基因的Ct值见表6：

表6各处理组大草蛉内参基因Actin的Ct值

qRT-PCR中各处理组大草蛉热激蛋白Hsp70基因的表达量见表7：

表7各处理组大草蛉热激蛋白Hsp70基因的表达量

上述结果显示，取食昆虫猎物的大草蛉组热激蛋白Hsp70基因的表达量显著低于取食人工饲料的大草蛉组，推测取食昆虫猎物的大草蛉组的寿命显著短于取食人工饲料的大草蛉组。

通过传统生物学方法，即每日按照所述实施例中的方法饲喂上述2组大草蛉，每天观察记录，直至大草蛉成虫个体自然死亡截止，计算分别饲喂昆虫猎物和人工饲料的2组大草蛉的雌性成虫寿命分别为38.00±1.39天和56.00±3.37天；雄性成虫寿命分别为41.50±2.69天和59.60±3.72天，结果证明本发明中的检测结果与传统方法检测结果相一致，表明本发明中的检测方法正确。本方法检测昆虫寿命仅需2-3天，传统的生物学方法需要30-60天，明显缩短了时间周期，并且检测的结果准确。

结果表明，可以采用本发明中所述的检测方法既经济又快速检测不同营养源大草蛉的热激蛋白Hsp70基因的表达量，进一步明确不同营养源或不同商品化来源的草蛉寿命的长短。

本发明中所述热激蛋白Hsp70基因的表达量可以作为分子标记检测并评估不同营养源的大草蛉种群的寿命；包含用于扩增热激蛋白Hsp70基因的特异性引物或上述qRT-PCR反应体系包含的试剂及试剂盒均可作为检测不同营养源大草蛉寿命的试剂。

不同营养源大草蛉RNA提取试剂盒、离心柱吸附及RNA纯化方法也是本发明保护的范围。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 用热激蛋白Hsp70基因检测昆虫寿命的方法及应用

<130> 2010

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atggcacctg caattggaat tgatttggga acaacatact cttgtgttgg agtatggcaa 60

caaggaaaag tggaaattat tgcaaacgac caaggaaatc gaacaacacc atcgtatgtt 120

gcattcagtg atacagaacg attaattgga gatgcagcaa aaaatcaagt tgcaatgaat 180

ccacaaaata cagtctttga tgcaaaacgt ttaattggtc gaaaatttga tgatcccaaa 240

atacaagcag atatgaaaca ttggccattc aaagtcataa atgattgtgg taaaccaaaa 300

attcaagtag aatttaaagg agaacaaaaa cggtttgcac ccgaagaaat aagttcaatg 360

gtattaacaa aaatgaaaca aactgcagaa gcgtatttag gccaagaagt tcgtgatgct 420

gttatcactg tgccagcata cttcaatgat tctcaacggc aagctacaaa agatgcagga 480

gcaattgctg gattgaatgt gctacgaata ataaatgaac cgacagcagc agcattagca 540

tacggtttgg ataagaactt gaagggtgaa cgaaatgtgt taatatttga tttggggggt 600

ggtacctttg atgtatcaat tttaacaatc gatgagggtt cattgtttga agtacgatct 660

actgctggtg atacacattt aggtggtgaa gattttgata atcgccttgt gaatcacctg 720

gctgaagaat ttaaacggaa gtttagaaaa gacctacgta tgaatccgcg agcgttacga 780

cgactacgta cagcagctga acgagctaaa cggacactgt cttccagtac cgaagcaact 840

attgaaattg atgctttatt tgaaggaatc gattactaca cgaaaatatc aagagcacgt 900

ttcgaagaac tttgttctga tttgttccgt ggcaccttgc aaccagttga gaaagctttg 960

gctgatgcta aattagataa aggagcaata cacgatgttg tcttggttgg aggatcaaca 1020

cgcattccaa aaatacaatc attgctacaa aactatttct gtggtaaacc attaaactta 1080

tcaattaatc cagacgaagc tgtagcatat ggtgcagctg ttcaagcagc aattctaagt 1140

ggagcatcag acacaaagat tcaagatgtg ctgttagtcg atgtaacacc attatcatta 1200

ggaatagaaa ctgctggtgg tgtcatgact aaaataattg aacgaaatgc ccgaattcca 1260

tgcaaacaaa cacaaacatt tacaacgtac tcggataatc aaccagctgt taccattcaa 1320

gtgtttgaag gcgaacgtgc aatgaccaaa gacaataact tattaggaac atttgattta 1380

actggaatac caccagctcc acgaggtgtt ccaaaaattg aagtaacatt tgatttggac 1440

gcgaatggaa tcttaaatgt atctgccaaa gataacagca gtggtaattc aaagaatata 1500

acaatacgaa atgacaaagg tcgtttatca cagacagaca ttgatcgcat gttagccgaa 1560

gctgagaagt acaaagaaga agatgaacgt caacgagaag tgattgcagc tagaaatcaa 1620

ttagaaggtt ac 1632

<210> 2

<211> 544

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Ala Pro Ala Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val

1 5 1015

Gly Val Trp Gln Gln Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly

202530

Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Ser Asp Thr Glu Arg Leu

354045

Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Met Asn Pro Gln Asn Thr

505560

Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Lys Phe Asp Asp Pro Lys

65707580

Ile Gln Ala Asp Met Lys His Trp Pro Phe Lys Val Ile Asn Asp Cys

859095

Gly Lys Pro Lys Ile Gln Val Glu Phe Lys Gly Glu Gln Lys Arg Phe

100 105 110

Ala Pro Glu Glu Ile Ser Ser Met Val Leu Thr Lys Met Lys Gln Thr

115 120 125

Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Gln Glu Val Arg Asp Ala Val Ile Thr Val

130 135 140

Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly

145 150 155 160

Ala Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Asn Leu Lys Gly Glu Arg Asn

180 185 190

Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Ile Leu

195 200 205

Thr Ile Asp Glu Gly Ser Leu Phe Glu Val Arg Ser Thr Ala Gly Asp

210 215 220

Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Leu Val Asn His Leu

225 230 235 240

Ala Glu Glu Phe Lys Arg Lys Phe Arg Lys Asp Leu Arg Met Asn Pro

245 250 255

Arg Ala Leu Arg Arg Leu Arg Thr Ala Ala Glu Arg Ala Lys Arg Thr

260 265 270

Leu Ser Ser Ser Thr Glu Ala Thr Ile Glu Ile Asp Ala Leu Phe Glu

275 280 285

Gly Ile Asp Tyr Tyr Thr Lys Ile Ser Arg Ala Arg Phe Glu Glu Leu

290 295 300

Cys Ser Asp Leu Phe Arg Gly Thr Leu Gln Pro Val Glu Lys Ala Leu

305 310 315 320

Ala Asp Ala Lys Leu Asp Lys Gly Ala Ile His Asp Val Val Leu Val

325 330 335

Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Ile Gln Ser Leu Leu Gln Asn Tyr

340 345 350

Phe Cys Gly Lys Pro Leu Asn Leu Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val

355 360 365

Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Ser Gly Ala Ser Asp

370 375 380

Thr Lys Ile Gln Asp Val Leu Leu Val Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu

385 390 395 400

Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Lys Ile Ile Glu Arg Asn

405 410 415

Ala Arg Ile Pro Cys Lys Gln Thr Gln Thr Phe Thr Thr Tyr Ser Asp

420 425 430

Asn Gln Pro Ala Val Thr Ile Gln Val Phe Glu Gly Glu Arg Ala Met

435 440 445

Thr Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Thr Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro

450 455 460

Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Lys Ile Glu Val Thr Phe Asp Leu Asp

465 470 475 480

Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Ser Ala Lys Asp Asn Ser Ser Gly Asn

485 490 495

Ser Lys Asn Ile Thr Ile Arg Asn Asp Lys Gly Arg Leu Ser Gln Thr

500 505 510

Asp Ile Asp Arg Met Leu Ala Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Glu Glu Asp

515 520 525

Glu Arg Gln Arg Glu Val Ile Ala Ala Arg Asn Gln Leu Glu Gly Tyr

530 535 540

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ctgcagaagc gtatttaggc c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gctaatgctg ctgctgtcgg 20

<210> 5

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atggagaaga tctggcatca cactttctac aatgaattgc gagtcgctcc agaagaacac 60

ccaatccttc tcactgaagc cccattgaac ccaaaagcta accgtgaaaa gatgacccaa 120

atcatgtttg aaaccttcaa cacaccagct atgtatgtag ctatccaagc tgtcctctcc 180

ttatacgctt caggtcgtac cactggtatc gtacttgact ctggtgatgg tgtatcacac 240

actgtcccaa tctatgaagg ttatgctctc ccccacgcca tcctccgttt ggacttggct 300

ggacgtgact taactgacta cctcatgaaa atcttaactg aacgtggtta ctctttcaca 360

accaccgctg aacgggaaat tgttcgtgac atcaaggaaa aactttgcta tgttgctctt 420

gacttcgaac aagaaatggg aacagccgcc gcttcaacct ccctcgaaaa atcatacgaa 480

cttcctgatg gtcaagtcat caccattggt aatgaaagat tccgttgccc agaatcactc 540

ttccaaccat ccttcttggg tatggaatct tgcggtatcc acgaaactgt ctacaactca 600

atcatgaagt gtgatgtaga tatccgtaaa gacttgtacg ccaacaatgt cctctccggt 660

ggtaccacca tgtacccagg tattgctgac cgtatgcaaa aggaaatcac cgcattggcc 720

ccatcaacca tcaaaatcaa gatcattgct ccaccagaac gtaaatactc cgtatggatc 780

ggtggttcca tcttggcttc cctctccact ttccaacaaa tgtggatctc aaaacaagaa 840

tacgacgaat ccggcccagg aattgtccac cgcaaatgtt tctaaatgtt cttctcctat 900

tacaaaatat tctttattat ttatttatgt ctactattaa gatctacaca tacataacat 960

tttatttgtt aattatgtaa tatttgcatc attataaata cagaatttat ttaatttaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1041

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tccagaagaa cacccaatcc 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atacaccatc accagagtca agt 23