普纳替尼在制备治疗缺血/再灌注损伤药物中的应用

摘要

本发明公开了普纳替尼在制备治疗缺血/再灌注损伤药物中的应用。将普纳替尼用于治疗缺血/再灌注损伤，尤其是治疗脑组织神经病，更尤其是对缺血性脑卒中的保护作用，能显著减轻脑缺血/再灌注损伤。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，本发明提供了酪氨酸激酶抑制剂普纳替尼(Ponatinib)的新用途和给药方式，包括对脑缺血/再灌注的保护作用(缺血性脑卒中)，扩大了普纳替尼适应症范围。

背景技术

缺血脑卒中是严重危害人类健康的常见和多发病，在全球已成为第一致残和第三致死的原因，缺血性脑卒中的发病率约占脑血管病的70-80％。

脑缺血损伤与自由基过度形成、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载、炎性反应等多种机制有关，无论何种机制，最终的结局都会导致神经细胞死亡、功能破坏、脑梗死灶形成。细胞死亡的方式主要有坏死和凋亡两条途径。传统观点认为，坏死是一种随机的、意外的和不受调控的被动死亡方式，而凋亡则是一种受到严密调控的主动死亡方式。最近的研究表明，坏死也受到各种信号通路严密调控，称为调节性坏死，包括程序性坏死(programmednecrosis)，铁坏死(ferroptosis)，CypD依赖的坏死等。其中，RIPK1/RIPK3依赖的程序性坏死最受关注。研究表明，RIPK1/RIPK3依赖的程序性坏死存在于多种损伤相关性疾病中，包括心肌梗死和缺血性脑卒中。因此，抑制RIPK1/RIPK3依赖的程序性坏死已成为目前减轻缺血性脑卒中神经细胞死亡的有效途径。文献报道，RIPK1抑制剂necrostatin-1(Nec-1)能减少小鼠脑缺血损伤，改善神经功能，该作用与抑制神经细胞的程序性坏死密切相关。然而，Nec-1仅作为工具药用于动物实验，目前临床上尚无针对RIPK1/RIPK3药物用于治疗缺血性脑卒中。

新近的研究发现酪氨酸激酶抑制剂普纳替尼具有新的功能，能特异性下调RIPK1和RIPK3的蛋白表达水平,抑制细胞程序性坏死。但未有普纳替尼治疗缺血性脑卒中的报道。

发明内容

本发明所述普纳替尼的结构式如式Ⅰ所示：

化学名为：

3-(2-(imidazo[1,2-b]pyridazin-3-yl)ethynyl)-4-methyl-N-(4-((4-methylpiperazin-1-yl)methyl)-3-(trifluoromethyl)phenyl)benzamide；分子式为：C29H27F3N6O；分子量为：532.56。

本发明通过实验表明，普纳替尼通过抑制特异性抑制受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)和受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)，抑制神经细胞程序性坏死，显著降低脑缺血梗死体积,保护脑缺血/再灌注损伤的作用优于目前常用的脑血管药物。普纳替尼可以降低缺血/再灌注脑组织的程序性细胞坏死。因此，普纳替尼可应用于制备治疗缺血和/或再灌注损伤药物(本文中，以下“/”均表示“和/或”)。优选地，所述缺血/再灌注损伤包括脑缺血/再灌注损伤、心肌缺血/再灌注损伤、肝缺血/再灌注损伤和肾缺血/再灌注损伤。更优选地，所述脑缺血/再灌注损伤包括缺血性脑卒中。

本发明扩大了普纳替尼的适应症，可适用于脑缺血/再灌注损伤；与注射给药方式相比，本发明采用口服给药，操作简单，刺激性小，增强病人的依从性。

普纳替尼目前用于治疗因T315I突变对酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼、达沙替尼或尼洛替尼产生耐药的成人慢性粒细胞白血病(CML)和“费城染色体阳性”(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)。本发明首次将普纳替尼用于治疗大鼠缺血性脑卒中模型，发现普纳替尼能下调大鼠脑组织中RIPK1和RIPK3的蛋白表达水平，降低大鼠脑梗死体积，改善神经学功能，这一作用优于阳性工具药Nec-1。本发明首次证明治疗白血病的药物普纳替尼可以用于治疗缺血性脑卒中。与治疗白血病机制不同(抑制酪氨酸激酶)，普纳替尼通过下调RIPK1和RIPK3表达水平，抑制神经细胞程序性坏死而发挥作用。由于治疗缺血性脑卒中为急性和短期用药，可大大降低普纳替尼的不良反应。本发明扩大普纳替尼现有的适应症范围，发现了其新的药物作用机制。缺血性脑卒中为临床常见病，普纳替尼具有广阔的应用前景。

总之，本发明将普纳替尼用于治疗脑组织神经病，尤其是对缺血性脑卒中的保护作用，能显著减轻脑缺血/再灌注损伤。

附图说明

图1：手术前15分钟给药，A-大鼠脑组织TTC染色及梗死体积测定，B-大鼠神经学功能评分；

图2：缺血2h再灌1h后给药，A-大鼠脑组织TTC染色及梗死体积测定，B-大鼠神经学功能评分。

具体实施方式

动物实验：普纳替尼对缺血性脑卒中的保护作用

实施药品：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)购于上海山浦化工有限公司。

将普纳替尼用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为溶媒制成混悬液。

实验动物：体重250～300g的健康雄性SD大鼠48只。将实验动物在温度25℃、相对湿度60％、自由饮水、定时定量的环境中饲养一周，然后按实验各分组要求口服给药。

建模方法：用脑中动脉阻塞(MCAO)法制备大鼠脑缺血/再灌注损伤模型。步骤如下：(1)分离颈外动脉(CCA),向上分离右颈外动脉(ECA)与颈内动脉(ICA)；(2)用眼科镊暂时夹闭ECA和ICA，并结扎CCA近心端；(3)于CCA远心端放置一打好结的备用丝线，在此线下端剪一小口,将栓线插入至颈内动脉，收紧丝线，放开ECA和ICA上的动脉夹，顺ICA将栓线送至颅内；(4)遇阻力而止,从CCA分叉处算起，插入深度约为18～20mm；(5)缺血120min后，将栓线拔出，缝好皮肤，再灌注24h后处理动物。

模型成功评判标准采用Longa“5分法”对大鼠脑缺血损伤的神经功能缺损进行评分。0分：无神经缺损症状；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右旋转；3分：行走向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1～4分为有效模型。

大鼠脑TTC染色和梗死体积测定。大鼠麻醉后，迅速将脑取出，去掉嗅球及后脑，从额极开始切取4张冠状脑片，厚约2.0mm，立刻置于1％TTC溶液中，37℃避光孵育30min。然后用10％多聚甲醛溶液浸泡固定。梗死区呈现白色，非梗死区呈现红色。将每组脑片排列整齐后进行扫描。再应用ImageJ测出各脑片的梗塞面积，根据公式：梗死体积＝[(各片正面梗死面积之和+各片反面梗死面积之和)/2]×每片厚度,同样方法计算出全脑体积。

实验分组：将实验动物随机分为6组，即：

对照组(control组)：不做任何处理。

假手术组(sham组)：将栓线插到脑中动脉分叉处即停。

缺血/再灌注组(I/R)：脑缺血2h，再灌注24h。

普纳替尼+脑缺血/再灌注组(Ponatinib+I/R)1：手术前15分钟灌胃(普纳替尼用0.5％羧甲基纤维素钠做成混悬液，普纳替尼用量：20mg/kg)。普纳替尼+脑缺血/再灌注组(Ponatinib+I/R)2：缺血2h再灌后1小时灌胃(普纳替尼用量：20mg/kg)；溶媒+脑缺血/再灌注组(vehicle+I/R)：缺血2h再灌后1小时灌胃0.5％羧甲基纤维素钠(10ml/kg)。

检测指标：大鼠神经功能评分和梗死体积测定。

实验结果

普纳替尼对大鼠脑梗死体积及神经功能的影响

图1中的A所示，I/R组有明显的白色梗死灶，而手术前给予普纳替尼(L)组大鼠脑梗死灶显著缩小，明显缓解脑缺血损伤。图B，脑缺血组(I/R)大鼠出现明显的神经运动功能障碍，而普纳替尼可明显改善神经功能缺损症状(p<0.01)。

图2中的A所示，I/R组有明显的白色梗死灶，缺血2h再灌1h后给予普纳替尼(L)组大鼠脑梗死灶显著缩小，明显缓解脑缺血损伤。图B，脑缺血组(I/R)大鼠出现明显的神经运动功能障碍，而普纳替尼可明显改善神经功能缺损症状(p<0.01)。

但本专利不局限于脑缺血/再灌注损伤，因心、肝和肾缺血/再灌注损伤同样存在RIPK1/RIPK3酶活性上调，故该药同样适用于治疗心、肝和肾缺血/再灌注损伤。