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一种无乳链球菌WC1535△cps及其构建和应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种无乳链球菌WC1535△cps及其构建和应用;本发明的荚膜缺失型鱼源无乳链球菌菌株为无乳链球菌WC1535△cps,于2017年6月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:60208;该菌株安全性高,不存在毒力返强的风险,而且免疫原性高,能够保护受免疫鱼抵抗无乳链球菌的入侵,同时该弱毒活疫苗易培养、使用简单、生产成本低;本发明所涉及的菌株可用于制备鱼链球菌病的弱毒活疫苗,具有极高的商业价值。

著录项

法律信息

  • 法律状态公告日

    法律状态信息

    法律状态

  • 2018-10-09

    授权

    授权

  • 2018-02-13

    实质审查的生效 IPC(主分类):C12N1/21 申请日:20170811

    实质审查的生效

  • 2018-01-19

    公开

    公开

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种荚膜缺失的鱼源无乳链球菌弱毒株,无乳链球菌WC1535△cps及其构建和应用。

背景技术

鱼链球菌病主要是由无乳链球菌和海豚链球菌引起的。目前,鱼链球菌病的防控主要依赖抗生素、消毒剂、微生态制剂和疫苗免疫等。由于治疗过程中抗生素的大量使用,使得病原菌出现了耐药性,药物治疗和预防效果显著下降。而针对鱼链球菌病的疫苗主要是灭活疫苗,灭活疫苗不仅因为需要注射、操作不便和效果不理想等原因,导致疫苗的使用范围非常有限;而且灭活疫苗接种后不能在动物体内进行繁殖,通常免疫剂量较大,保护周期相对较短,常常需要多次免疫接种,单次免疫不能产生较强的免疫保护效果。因此,开发有效的弱毒活疫苗对预防鱼链球菌病具有重要的现实意义。

发明内容

为了解决上述问题,本发明的目的在于提供一种荚膜缺失的鱼源无乳链球菌弱毒株,即无乳链球菌WC1535△cps。该菌株毒性小、免疫原性强,并且对鱼的致病性显著降低,但是能够在鱼体长时间存活,可以刺激鱼体产生抗体,具有良好的保护效果。

本发明的目的之二是提供了所述无乳链球菌WC1535△cps的构建。

本发明的目的之三是提供了所述无乳链球菌WC1535△cps的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现的:

本发明所述的无乳链球菌WC1535△cps,为荚膜缺失的鱼源无乳链球菌弱毒株,于2017年6月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:60208,外文名称为Streptococcus agalactiae。

所述无乳链球菌WC1535△cps的构建方法,包括如下步骤:

(1)将重组质粒pSET4s-cpsCm经过电转化至鱼源无乳链球菌WC1535株感受态细胞,涂布于含有氯霉素的BHI平板,置于28±2℃倒置培养30~40h;

(2)再挑取培养所得单克隆至含有氯霉素的BHI液体培养基中,28±2℃培养至对数生长期,然后稀释10000倍,涂布于无抗性的BHI平板上,于37℃倒置培养;得到所述无乳链球菌WC1535△cps。

挑取单克隆进行菌落PCR验证,引物为cps-dF和cps-dR。

cps-dF:5′-CTGACAACAATGGATTTTGGGTG-3′

cps-dR:5′-CAGCATCAGTAAAAGGTTCCCATA-3′

阳性敲除克隆可以扩增到预期大小为3145bp的PCR产物。野生株PCR产物预期大小为17711bp,由于该片段长度较长,通常的Taq酶不能扩增如此长度的PCR产物,因此,野生株PCR扩增产物为阴性。缺失株PCR扩增产物进行测序分析,结果发现突变株的cps基因簇发生了缺失,这表明已经成功构建了cps缺失突变株,命名为WC1535△cps,于2017年6月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:60208,外文名称为Streptococcus agalactiae。菌株WC1535株和WC1535△cps株样品分别经过固定、负染,通过透射电镜观察菌株荚膜。结果表明,与野生株相比,突变株WC1535△cps株的荚膜出现缺失。

详细地,所述鱼源无乳链球菌WC1535感受态细胞的制备方法,具体步骤如下:

(1)鱼源无乳链球菌WC1535复苏于BHI(脑心浸液培养基)中,30±2℃培养过夜;

(2)取过夜培养的菌液加入80~120mL新鲜的BHI液体培养基中,30±2℃摇床扩大培养5~6h,OD600=0.6时,收集菌体;

(3)经扩大培养的菌液在5000r/min离心8~12min,去上清液;

(4)所得菌体使用15~25mL 10%~15%的甘油轻轻悬浮,离心去上清;得到所述鱼源无乳链球菌WC1535感受态细胞。

更进一步,重复步骤(4)两次;使用1mL 15%的甘油轻轻悬浮菌体,分装至1.5mL的离心管中,即为无乳链球菌感受态细胞。

较佳地,所述重组质粒pSET4s-cpsCm由pSET4S质粒和cps-up-Cm-cps-down基因片段的无缝克隆得到,具体为:

(1)取双酶切后的pSET4S质粒与cps-up-Cm-cps-down基因片段,然后加入Seamless cloning kit连接体系,混匀后50±2℃处理25~35min,得到连接液;所述双酶切后的pSET4S质粒与cps-up-Cm-cps-down基因片段和Seamless cloning kit连接体系之间的体积比为6:3:1;

(2)取步骤(1)中所得连接液,加入10倍连接液体积的大肠杆菌DH5α感受态细胞中,冰上孵育25~35min后,42℃热激90s,冰上孵育2~3min,然后37℃复苏25~35min,涂布于含有氯霉素的LB平板上;PCR筛选阳性克隆,阳性PCR产物进行测序验证,得到所述的重组质粒命名为pSET4s-cpsCm。

较佳地,所述双酶切后的pSET4S质粒的构建:

提取pSET4S质粒,经过HindIII和EcoRI双酶切,37℃酶切3~5h,最后用0.8%琼脂糖凝胶回收产物,得到所述双酶切后的pSET4S质粒;其中所述酶切体系为:pSET4S 1μg、HindIII 1U、EcoRI 1U、10×Buffer 3μL、补ddH2O至30μL。

较佳地,所述cps-up-Cm-cps-down基因片段的构建:

(1)cps-up-Cm-cps-down基因片段全长的PCR扩增,扩增体系为:

2×PCR Master Mix 25μL、pSET4s-F 1μL、pSET4s-R 1μL、cps-up基因片段1μL、cps-down基因片段1μL、cps-Cm基因片段2μL,加H2O至50μL;

(2)cps-up-Cm-cps-down基因片段全长的PCR扩增程序为:

a.94℃下反应4min,循环1次

b.94℃下反应30s,循环30次

c.58℃下反应30s,循环30次

d.72℃下反应3min,循环30次

e.72℃下反应10min,循环1次

f.4℃下反应停止,循环1次

最后用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果,并回收纯化cps-up-Cm-cps-down基因片段;其中,

pSET4s-F:

5′-ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC-3′

pSET4s-R:

5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′。

较佳地,所述cps-Cm基因片段的构建为:

(1)cps-Cm基因片段的扩增体系为:

2×PCR Master Mix 25μL、cps-CmF 1μL、cps-CmR 1μL、pSET5S质粒1μL、最后加H2O至50μL;

(2)cps-Cm基因片段的扩增程序为:

a.94℃下反应4min,循环1次

b.94℃下反应30s,循环30次

c.58℃下反应30s,循环30次

d.72℃下反应70s,循环30次

e.72℃下反应10min,循环1次

f.4℃下反应停止,循环1次

最后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果,并回收纯化cps-Cm基因片段;所述cps-CmF和cps-CmR是根据pSET5S质粒中氯霉素基因序列设计而得,其中,

cps-CmF:

5′-GAAACACTCACATACACCTCTTAATTCGATGGGTTCCGAGG-3′

cps-CmR:

5′-CTACAAATAATTGATATTGACCACCGAACTAGAGCTTGATG-3′。

较佳地,所述cps-up基因片段的构建为:

(1)cps-up基因片段的扩增体系为:

2×PCR Master Mix 25μL、cps-up 1μL、cps-up 1μL、无乳链球菌WC1535株的基因组DNA 1μL、最后加H2O至50μL;

(2)cps-up基因片段的扩增程序为:

a.94℃下反应5min,循环1次

b.94℃下反应30s,循环10次

c.62℃下反应45s,循环10次,每次循环1次,降低1℃

d.72℃下反应1min,循环10次

e.94℃下反应30s,循环24次

f.57℃下反应45s,循环24次

g.72℃下反应1min,循环24次

h.72℃下反应10min,循环1次

i.4℃下反应停止,循环1次

最后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果,并回收纯化cps-up基因片段;其中,

cps-upF:

5′-GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGATTTGCTCACGAAAATATG-3′

cps-upR:

5′-GAGCCTCGGAACCCATCGAATTAAGAGGTGTATGTGAGTGTTTC-3′

较佳地,所述cps-down基因片段的构建为:

(1)cps-down基因片段的扩增体系为:

2×PCR Master Mix 25μL、cps-downF 1μL、cps-downR 1μL、无乳链球菌WC1535株的基因组DNA1μL、最后加H2O至50μL;

(2)cps-down基因片段的扩增程序为:

a.94℃下反应5min,循环1次

b.94℃下反应30s,循环10次

c.62℃下反应45s,循环10次,每次循环1次,降低1℃

d.72℃下反应1min,循环10次

e.94℃下反应30s,循环24次

f.57℃下反应45s,循环24次

g.72℃下反应1min,循环24次

h.72℃下反应10min,循环1次

i.4℃下反应停止,循环1次

最后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果,并回收纯化cps-down基因片段;其中,

cps-downF:

5′-CAAGCTCTAGTTCGGTGGTCAATATCAATTATTTGTAG-3′

cps-downR:

5′-GTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCATTGTAGTAATGATTGGGTAG-3′

所述无乳链球菌WC1535△cps的应用,将所述无乳链球菌WC1535△cps应用于鱼链球菌病的防控,特别是应用于鱼链球菌病的弱毒活疫苗。

本发明所述突变株WC1535△cps由于荚膜合成相关基因簇的缺失而不能正常合成荚膜,而荚膜是无乳链球菌重要的毒力因子,因此,这种荚膜缺失株会显著降低菌株本身的致病性。本发明所述荚膜缺失型无乳链球菌弱毒株的制备方法是分别PCR扩增cps基因簇的上下游同源臂(cps-up和cps-down),然后扩增pSET5S载体上的氯霉素基因(Cm),将这3个片段连接到pSET4S载体上,得到载体pSET4s-cpsCm,再将该重组质粒转化鱼源无乳链球菌WC1535株,利用同源重组原理将无乳链球菌WC1535基因组中的cps基因簇缺失,通过温度和抗性筛选构建荚膜缺失型突变株WC1535△cps。

本发明的主要优点:本发明将WC1535株的荚膜多糖基因簇全部缺失,构建了荚膜缺失突变株,该缺失突变株对罗非鱼和斑马鱼的毒力极显著下降。由于该缺失株为荚膜基因簇全部缺失,其缺失基因分别为cpsA-cpsL和neuA-neuD(图1),缺失片段长度较长,其大小为15623bp(见cps基因簇缺失片段)。因此,该菌株的安全性高,不存在毒力返强的风险。该菌株的免疫原性高,能够保护免疫罗非鱼抵抗无乳链球菌的入侵,而且制作工艺简单,生产成本低,为有效控制我国鱼链球菌病的发生与流行奠定了坚实的基础。荚膜缺失型突变株WC1535△cps腹腔注射感染罗非鱼,该缺失突变株在罗非鱼体内平均可以存活14d,可长时间有效地刺激罗非鱼产生免疫力。并且该缺失突变株分别在不同规格的罗非鱼(5g、50g、200g和400g)上进行了安全性评价,所有的感染罗非鱼均未表现出任何临床症状,均无罗非鱼发生死亡。此外,该缺失突变株在罗非鱼体内连续传代5次,然后分离菌株进行腹腔注射感染罗非鱼。结果表明,突变株WC1535△cps在罗非鱼体内传代5次后对罗非鱼仍然不致病,而且感染罗非鱼未表现出任何临床症状。

附图说明

图1为无乳链球菌WC1535△cps株cps基因簇的缺失示意图,

图2为野生株WC1535的透射电镜图片,

图3为本发明无乳链球菌WC1535△cps的透射电镜图片。

具体的实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明,以助于本领域技术人员理解本发明,但不限制本发明的保护范围。

1.材料:无乳链球菌WC1535株,由中国水产科学研究院珠江水产研究所从患病罗非鱼体内分离。质粒pSET4S和pSET5S为日本国立动物卫生研究所的Daisuke Takamatsu博士惠赠。引用文献:Takamatsu D.,Osaki M.,Sekizaki T.Thermosensitive suicide vectors for gene replacement in Streptococcus suis.Plasmid.2001,46,140–148.

2.引物的设计合成

无乳链球菌WC1535株的基因组序列参考(GenBank accession No.CP016501),以该菌株的基因组序列为模板,使用Primer Primier 5.0软件设计扩增目的片段的引物。以引物cps-upF和cps-upR扩增cps-up上游同源臂;以引物cps-downF和cps-downR扩增cps-down下游同源臂。同时,设计位于cps基因簇两侧的引物对cps-dF和cps-dR,用于筛选cps基因缺失突变株。根据pSET5S质粒中氯霉素基因序列,设计引物cps-CmF和cps-CmR,用于扩增氯霉素基因。引物pSET4s-F和pSET4s-R用于扩增cps-up-Cm-cps-down基因片段全长。

cps-upF:

5′-GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGATTTGCTCACGAAAATATG-3′

cps-upR:

5′-GAGCCTCGGAACCCATCGAATTAAGAGGTGTATGTGAGTGTTTC-3′

cps-CmF:

5′-GAAACACTCACATACACCTCTTAATTCGATGGGTTCCGAGG-3′

cps-CmR:

5′-CTACAAATAATTGATATTGACCACCGAACTAGAGCTTGATG-3′

cps-downF:

5′-CAAGCTCTAGTTCGGTGGTCAATATCAATTATTTGTAG-3′

cps-downR:

5′-GTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCATTGTAGTAATGATTGGGTAG-3′

pSET4s-F:

5′-ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCC-3′

pSET4s-R:

5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′

cps-dF:

5′-CTGACAACAATGGATTTTGGGTG-3′

cps-dR:

5′-CAGCATCAGTAAAAGGTTCCCATA-3′

3.PCR扩增目的基因

3.1cps-up、cps-down和cps-Cm基因片段扩增体系(50μL):

表1 PCR扩增体系

3.2 cps-up和cps-down基因片段PCR扩增程序(表2):

表2 cps-up和cps-down基因片段PCR扩增程序

用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果,分别回收纯化cps-up和cps-down基因片段。

3.3 cps-Cm基因片段PCR扩增程序(表3):

表3 cps-Cm基因片段PCR扩增程序

用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果,并回收纯化cps-Cm基因片段。

3.4 cps-up-Cm-cps-down基因片段全长的PCR扩增体系(表4):

表4 cps-up-Cm-cps-down基因PCR扩增体系

3.5 cps-up-Cm-cps-down基因片段全长的PCR扩增程序(表5)

表5 cps-up-Cm-cps-down基因片段全长扩增程序

用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果,并回收纯化cps-up-Cm-cps-down基因片段。

4.pSET4s-cpsCm重组质粒的构建:

4.1 pSET4S质粒的双酶切

提取pSET4S质粒,经过HindIII和EcoRI双酶切,酶切体系见表6。37℃酶切3h,胶回收酶切产物。

表6 pSET4S质粒的双酶切反应体系

4.2 pSET4S质粒和cps-up-Cm-cps-down基因片段的无缝克隆(Seamless cloning)取双酶切后的pSET4S质粒6μL与cps-up-Cm-cps-down基因片段3μL,然后加入Seamless cloning kit连接体系1μL,混匀后50℃处理30min。

4.3 pSET4s-cpsCm重组质粒的转化与筛选

取10μL连接液,加入100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中,冰上孵育30min后,42℃热激90s,冰上孵育2min,然后37℃复苏30min,涂布于含有氯霉素的LB平板上。PCR筛选阳性克隆,阳性PCR产物进行测序验证,将获得的重组质粒命名为pSET4s-cpsCm。

5.荚膜缺失菌株的构建

一株鱼源无乳链球菌WC1535感受态细胞的制备方法,具体步骤如下:

(1)鱼源无乳链球菌WC1535复苏于BHI(脑心浸液培养基)中,30℃培养过夜;

(2)取培养过夜的菌液加入100mL新鲜的BHI液体培养基中,30℃摇床扩大培养5~6h,OD600=0.6时,收集菌体;

(3)经扩大培养的菌液在5000r/min离心10min,去上清液;

(4)菌体使用20mL 15%的甘油轻轻悬浮,离心,去上清;

(5)重复步骤(4)两次;

(6)使用1mL15%的甘油轻轻悬浮菌体,分装至1.5mL的离心管中,即为无乳链球菌感受态细胞。

重组质粒pSET4s-cpsCm经过电转化至无乳链球菌WC1535株感受态细胞,涂布于含有氯霉素的BHI平板,置于28℃倒置培养36h。挑取单克隆至含有氯霉素的BHI液体培养基中,28℃培养至对数生长期,然后稀释10000倍,涂布于无抗性的BHI平板上,于37℃倒置培养。挑取单克隆进行菌落PCR验证,引物为cps-dF(5′-CTGACAACAATGGATTTTGGGTG-3′)和cps-dR(5′-CAGCATCAGTAAAAGGTTCCCATA-3′),阳性敲除克隆可以扩增到预期大小为3145bp的PCR产物。由于野生株PCR产物预期大小为17711bp,该片段长度很长,通常的Taq酶在有限的延伸时间内不能扩增如此长度的PCR产物,因此,野生株PCR扩增产物为阴性。缺失株PCR扩增产物进行测序分析(cps-detection基因序列),结果发现突变株的cps基因簇发生了缺失,这表明已经成功构建了△cps缺失突变株,命名为WC1535△cps。

6.透射电子显微镜观察菌株胞外荚膜

菌株WC1535株和WC1535△cps株样品分别经过固定、负染,通过透射电镜观察菌株荚膜。结果表明,与野生株WC1535株相比(见附图2),突变株WC1535△cps株的荚膜出现缺失(见附图3)。

7.缺失株WC1535△cps对罗非鱼的毒力实验。

罗非鱼(体质量约为50g)随机分为4组,每组30尾。缺失株WC1535△cps和野生株WC1535分别用无菌PBS重悬,并分别稀释到1×109和1×108CFU/mL,腹腔注射0.1mL菌悬液,30℃饲养,观察罗非鱼存活状态,并记录罗非鱼死亡时间和数量,持续观察2周。结果表明,野生株1×109和1×108CFU/mL注射浓度组的罗非鱼死亡率分别为100%和90%;缺失株WC1535△cps的1×109和1×108CFU/mL注射浓度组罗非鱼均无死亡,而且没有任何临床症状。

实验结果表明,缺失株WC1535△cps对罗非鱼的毒力极显著下降。

缺失株WC1535△cps在罗非鱼体内的存活实验:

缺失株WC1535△cps用无菌PBS稀释为1×109CFU/mL,腹腔注射罗非鱼(30尾),30℃饲养。每2天解剖3尾罗非鱼,取脾脏和肾脏分离细菌,连续进行20天。实验结果表明,缺失株WC1535△cps在罗非鱼的脾脏和肾脏可以存活14d。这表明缺失株WC1535△cps可以持续刺激罗非鱼机体产生抗体,该缺失株作为无乳链球菌弱毒活疫苗具有十分重要的应用价值。

8.缺失株WC1535△cps对罗非鱼的免疫保护实验

罗非鱼(体质量约为8g)随机分为2组,每组200尾。缺失株WC1535△cps在液体BHI培养中培养至稳定生长期,然后用无菌PBS重悬,并稀释到1×109CFU/mL。免疫组罗非鱼腹腔注射0.1mL菌悬液,对照组罗非鱼腹腔注射0.1mL无菌PBS缓冲液,26±2℃水温条件下饲养,连续饲养2个月。饲养1个月和2个月时分别进行攻毒试验,计算免疫组和对照组的相对免疫保护率(RPS),每组试验鱼30尾,30℃水温条件下攻毒。疫苗免疫1个月时,免疫组的RPS为91.8%;该疫苗免疫2个月时,免疫组的RPS为78.2%,这表明缺失株WC1535△cps对罗非鱼具有良好的免疫保护效果。

上述实施例,只是本发明的较佳实施例,并非用来限制本发明实施范围,故凡以本发明权利要求所述的特征及原理所做的等效变化或修饰,均应包括在本发明权利要求范围之内。

序列表

发明名称:一种无乳链球菌WC1535△cps及其构建和应用

申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所

cps-up基因序列:

GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGATTTGCTCACGAAAATATGAGGTGTAGTAGTAAAAAGAGTTGTGGCAATTAAGGAATTATCGTCTAATAATTTGGTTAATACATCTCTATTATAGCTATTAAGAAACAGAACACCAATCTCTGAACGGAAATTTTTAACATCATCAATAATTTCCCAAGTCCTAGTTTCACGTAAAAAAAGTTCGTATTGGGTCATGTCTGTGCCATTAAAGAGAGCTACAAAAGCGTTAACCACAAATGCATAGTGTTGTGAAGAAACGCTGAACAGCTCACGACTTGTATTATCACCCTTATAACGCTCTTCAAGAAGTGCTGTTTGTTCTAGAATTTGTCGCGCATATGACAGAAATTCCATACCATCTTTTGTTAACGTTATTCCTTTTGGATTTCGAATAAAAATTTGGATCCCCATCTCAGTCTCAAGGTTCCTAACAGCGTTTGAAAGTGAAGGTTGGGTAATGTAGAGTTGTTTAGCGGCTTCATTCATGCTACCAGTTTCTACAATCTTAATAACATATTGTAATTGTTGAATTCTCATAACTCTAGTTTAAACTAGAATGTAAATAAATTCAATTAGATCAGCTAAATTATCAATATAGATCAATTGAAAATGTTATTTAGCTAATATAATCAGATTATTCCAATATTATTTTCGTTGAATATTGTATTGAAAAATGATATAATATCCAAGTAAAATTAAGGTTTTTTAAGTATTGGAGAATTACAATGTCTAATCATTCGCGCCGTCAACAAAAGAAACACTCACATACACCTCTTAATTCGATGGGTTCCGAGGCTC

cps-Cm基因序列:

GAAACACTCACATACACCTCTTAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAACGTCAATAAAGCAATTGGAATAAAGAAGCGAAAAAGGAGAAGTCGGTTCAGAAAAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGTAATATAAAAACCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAGTGACATTAGAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCATATTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATCTGACAATTCCTGAATAGAGTTCATAAACAATCCTGCATGATAACCATCACAAACAGAATGATGTACCTGTAAAGATAGCGGTAAATATATTGAATTACCTTTATTAATGAATTTTCCTGCTGTAATAATGGGTAGAAGGTAATTACTATTATTATTGATATTTAAGTTAAACCCAGTAAATGAAGTCCATGGAATAATAGAAAGAGAGAAAGCATTTTCAGGTATAGGTGTTTTGGGAAACAATTTCCCCGAACCATTATATTTCTCTACATCAGAAAGGTATAAATCATAAAACTCTTTGAAGTCATTCTTTACAGGAGTCCAAATACCAGAGAATGTTTTAGATACACCATCAAAAATTGTATAAAGTGGCTCTAACTTATCCCAATAACCTAACTCTCCGTCGCTATTGTAACCAGTTCTAAAAGCTGTATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACTAAGAAAATAAATGCAGGGTAAAATTTATATCCTTCTTGTTTTATGTTTCGGTATAAAACACTAATATCAATTTCTGTGGTTATACTAAAAGTCGTTTGTTGGTTCAAATAATGATTAAATATCTCTTTTCTCTTCCAATTGTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATTTGATATGCCTCCTAAATTTTTATCTAAAGTGAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGCTTTCTTCATTAGAATCAATCCTTTTTTAAAAGTCAATATTACTGTAACATAAATATATATTTTAAAAATATCCCACTTTATCCAATTTTCGTTTGTTGAACCATTATATCACATTATCCATTAAAAATCAAACAAATTTTCATCAAGCTCTAGTTCGGTGGTCAATATCAATTATTTGTAG

cps-down基因序列:

CAAGCTCTAGTTCGGTGGTCAATATCAATTATTTGTAGACGAAGTTAAAACCTTATAATATTTATTTTATAAAATTATTCATCTTATTTTTGCGATTTCAATAGTGATATGGTATATTTAAAGTAAGCTACGTATAGTTTTACCAGTCAGAAATAGTAAGGATGGTTGAGTATGAGAGAAACCGAAACACACGATCACCAAGCGCTAATTCAAAAATTGTTAGTCAGTATTCATTATTTAACCTTGTTTCGTGATGAAATTATATTAGTAGAAAAAACCCCATCTTTACTGGGGAAACATTTTTCTATTGCTATTGTGCAGAATGAACTAGGTGAGATACTTTCTAAAATAGAAGCTTTGAGTAAGCAAAAAAAACTGATTCGTTCTATTTATTGGTATGATGAATCGTCATTTAAAGTCATGAATAAGGCTCTGGCTATTGTAGAAGAATGGATTAAGGGCTTAGATAATCTTTTAGAATTCTGTCAATTACAGACGGTTTTTCAAGCAATTTTAGGTGATGAACGTGCACATGTATTTGGAATCCTTATTGATGTTTATACTTCTTTAAACATTATAAATACTTCTTTGAAAGAAGAAAATTCTAGACCAGTGTCCTTATCTGATTTGGCTCTAGGTCTTAAGGACGAAGATTAATAAAAAAACGTTACTGCTTTGAATGAATAAAGCAGTAACGTTTTTTATAAAATATTGCTATACTAGTAATACAGATATCTAAAAGTAAGGAGTTATAAATGAAACATTCTAGTTGGCATGATTTAATAAAAAGAGAACTACCCAATCATTACTACAATGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAAC

cps-up-Cm-cps-down基因序列:

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cps-detection基因序列:

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cps基因簇缺失片段:

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AGGACATATGCTTATCAAATGGCAAAGGAATTTTCATTAGATGTTGATACGAGAGATGATTTTATCCACGTCATCGGTCACCTCTTTTTCGATTATGCCATTAGGGAAAAAGAGAATAAAGTTTTTTATAAAGAAGGCTATAGTCGTTTGTTCAATAGAGAAGCTTCAAAGATAATTTTAGGTGATTCAAAAACGATATCTATCTCACTAGAAAATTACCATAATTATTCCCAAGGTGGTGTAACATTAGCAACGATGTTGGAAAACTTACCTAACTTTTTGACAGCTAATGTAACAGAGGCTTTTGTTTCTATAGGGGTAAATGATCTCATTACAGGTTATAGTGTGGAAGAAATATTCAGCAATTTCCAAAAACTCTACTCATTATTAGCTGAGAATAAAATAAAGATGAGATTTACAACTATTGCTTACACCCTTTTTAGAGAAACTGTCAATAATGCAGATATTGAGAAAATCAATCAATGGCTAACAGAATTTTGTTATCAAAATCAGATTCCACTGTTAGATATTAATAGATTTTTATCAAAGGATGGTAATCTAAATTATCATTTAACTAGTGATGGATTACATTTTACTCAAGAGGCTAATGATTTGTTACAAAG

序列号

发明名称:一种无乳链球菌WC1535△cps及其构建和应用

申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所

cps-up基因序列:

GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGATTTGCTCACGAAAATATGAGGTGTAGTAGTAAAAAGAGTTGTGGCAATTAAGGAATTATCGTCTAATAATTTGGTTAATACATCTCTATTATAGCTATTAAGAAACAGAACACCAATCTCTGAACGGAAATTTTTAACATCATCAATAATTTCCCAAGTCCTAGTTTCACGTAAAAAAAGTTCGTATTGGGTCATGTCTGTGCCATTAAAGAGAGCTACAAAAGCGTTAACCACAAATGCATAGTGTTGTGAAGAAACGCTGAACAGCTCACGACTTGTATTATCACCCTTATAACGCTCTTCAAGAAGTGCTGTTTGTTCTAGAATTTGTCGCGCATATGACAGAAATTCCATACCATCTTTTGTTAACGTTATTCCTTTTGGATTTCGAATAAAAATTTGGATCCCCATCTCAGTCTCAAGGTTCCTAACAGCGTTTGAAAGTGAAGGTTGGGTAATGTAGAGTTGTTTAGCGGCTTCATTCATGCTACCAGTTTCTACAATCTTAATAACATATTGTAATTGTTGAATTCTCATAACTCTAGTTTAAACTAGAATGTAAATAAATTCAATTAGATCAGCTAAATTATCAATATAGATCAATTGAAAATGTTATTTAGCTAATATAATCAGATTATTCCAATATTATTTTCGTTGAATATTGTATTGAAAAATGATATAATATCCAAGTAAAATTAAGGTTTTTTAAGTATTGGAGAATTACAATGTCTAATCATTCGCGCCGTCAACAAAAGAAACACTCACATACACCTCTTAATTCGATGGGTTCCGAGGCTC

cps-Cm基因序列:

GAAACACTCACATACACCTCTTAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAACGTCAATAAAGCAATTGGAATAAAGAAGCGAAAAAGGAGAAGTCGGTTCAGAAAAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGTAATATAAAAACCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAGTGACATTAGAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCATATTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATCTGACAATTCCTGAATAGAGTTCATAAACAATCCTGCATGATAACCATCACAAACAGAATGATGTACCTGTAAAGATAGCGGTAAATATATTGAATTACCTTTATTAATGAATTTTCCTGCTGTAATAATGGGTAGAAGGTAATTACTATTATTATTGATATTTAAGTTAAACCCAGTAAATGAAGTCCATGGAATAATAGAAAGAGAGAAAGCATTTTCAGGTATAGGTGTTTTGGGAAACAATTTCCCCGAACCATTATATTTCTCTACATCAGAAAGGTATAAATCATAAAACTCTTTGAAGTCATTCTTTACAGGAGTCCAAATACCAGAGAATGTTTTAGATACACCATCAAAAATTGTATAAAGTGGCTCTAACTTATCCCAATAACCTAACTCTCCGTCGCTATTGTAACCAGTTCTAAAAGCTGTATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACTAAGAAAATAAATGCAGGGTAAAATTTATATCCTTCTTGTTTTATGTTTCGGTATAAAACACTAATATCAATTTCTGTGGTTATACTAAAAGTCGTTTGTTGGTTCAAATAATGATTAAATATCTCTTTTCTCTTCCAATTGTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATTTGATATGCCTCCTAAATTTTTATCTAAAGTGAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGCTTTCTTCATTAGAATCAATCCTTTTTTAAAAGTCAATATTACTGTAACATAAATATATATTTTAAAAATATCCCACTTTATCCAATTTTCGTTTGTTGAACCATTATATCACATTATCCATTAAAAATCAAACAAATTTTCATCAAGCTCTAGTTCGGTGGTCAATATCAATTATTTGTAG

cps-down基因序列:

CAAGCTCTAGTTCGGTGGTCAATATCAATTATTTGTAGACGAAGTTAAAACCTTATAATATTTATTTTATAAAATTATTCATCTTATTTTTGCGATTTCAATAGTGATATGGTATATTTAAAGTAAGCTACGTATAGTTTTACCAGTCAGAAATAGTAAGGATGGTTGAGTATGAGAGAAACCGAAACACACGATCACCAAGCGCTAATTCAAAAATTGTTAGTCAGTATTCATTATTTAACCTTGTTTCGTGATGAAATTATATTAGTAGAAAAAACCCCATCTTTACTGGGGAAACATTTTTCTATTGCTATTGTGCAGAATGAACTAGGTGAGATACTTTCTAAAATAGAAGCTTTGAGTAAGCAAAAAAAACTGATTCGTTCTATTTATTGGTATGATGAATCGTCATTTAAAGTCATGAATAAGGCTCTGGCTATTGTAGAAGAATGGATTAAGGGCTTAGATAATCTTTTAGAATTCTGTCAATTACAGACGGTTTTTCAAGCAATTTTAGGTGATGAACGTGCACATGTATTTGGAATCCTTATTGATGTTTATACTTCTTTAAACATTATAAATACTTCTTTGAAAGAAGAAAATTCTAGACCAGTGTCCTTATCTGATTTGGCTCTAGGTCTTAAGGACGAAGATTAATAAAAAAACGTTACTGCTTTGAATGAATAAAGCAGTAACGTTTTTTATAAAATATTGCTATACTAGTAATACAGATATCTAAAAGTAAGGAGTTATAAATGAAACATTCTAGTTGGCATGATTTAATAAAAAGAGAACTACCCAATCATTACTACAATGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAAC

cps-up-Cm-cps-down基因序列:

ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGATTTGCTCACGAAAATATGAGGTGTAGTAGTAAAAAGAGTTGTGGCAATTAAGGAATTATCGTCTAATAATTTGGTTAATACATCTCTATTATAGCTATTAAGAAACAGAACACCAATCTCTGAACGGAAATTTTTAACATCATCAATAATTTCCCAAGTCCTAGTTTCACGTAAAAAAAGTTCGTATTGGGTCATGTCTGTGCCATTAAAGAGAGCTACAAAAGCGTTAACCACAAATGCATAGTGTTGTGAAGAAACGCTGAACAGCTCACGACTTGTATTATCACCCTTATAACGCTCTTCAAGAAGTGCTGTTTGTTCTAGAATTTGTCGCGCATATGACAGAAATTCCATACCATCTTTTGTTAACGTTATTCCTTTTGGATTTCGAATAAAAATTTGGATCCCCATCTCAGTCTCAAGGTTCCTAACAGCGTTTGAAAGTGAAGGTTGGGTAATGTAGAGTTGTTTAGCGGCTTCATTCATGCTACCAGTTTCTACAATCTTAATAACATATTGTAATTGTTGAATTCTCATAACTCTAGTTTAAACTAGAATGTAAATAAATTCAATTAGATCAGCTAAATTATCAATATAGATCAATTGAAAATGTTATTTAGCTAATATAATCAGATTATTCCAATATTATTTTCGTTGAATATTGTATTGAAAAATGATATAATATCCAAGTAAAATTAAGGTTTTTTAAGTATTGGAGAATTACAATGTCTAATCATTCGCGCCGTCAACAAAAGAAACACTCACATACACCTCTTAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAACGTCAATAAAGCAATTGGAATAAAGAAGCGAAAAAGGAGAAGTCGGTTCAGAAAAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGTAATATAAAAACCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAGTGACATTAGAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCATATTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATCTGACAATTCCTGAATAGAGTTCATAAACAATCCTGCATGATAACCATCACAAACAGAATGATGTACCTGTAAAGATAGCGGTAAATATATTGAATTACCTTTATTAATGAATTTTCCTGCTGTAATAATGGGTAGAAGGTAATTACTATTATTATTGATATTTAAGTTAAACCCAGTAAATGAAGTCCATGGAATAATAGAAAGAGAGAAAGCATTTTCAGGTATAGGTGTTTTGGGAAACAATTTCCCCGAACCATTATATTTCTCTACATCAGAAAGGTATAAATCATAAAACTCTTTGAAGTCATTCTTTACAGGAGTCCAAATACCAGAGAATGTTTTAGATACACCATCAAAAATTGTATAAAGTGGCTCTAACTTATCCCAATAACCTAACTCTCCGTCGCTATTGTAACCAGTTCTAAAAGCTGTATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACTAAGAAAATAAATGCAGGGTAAAATTTATATCCTTCTTGTTTTATGTTTCGGTATAAAACACTAATATCAATTTCTGTGGTTATACTAAAAGTCGTTTGTTGGTTCAAATAATGATTAAATATCTCTTTTCTCTTCCAATTGTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATTTGATATGCCTCCTAAATTTTTATCTAAAGTGAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGCTTTCTTCATTAGAATCAATCCTTTTTTAAAAGTCAATATTACTGTAACATAAATATATATTTTAAAAATATCCCACTTTATCCAATTTTCGTTTGTTGAACCATTATATCACATTATCCATTAAAAATCAAACAAATTTTCATCAAGCTCTAGTTCGGTGGTCAATATCAATTATTTGTAGACGAAGTTAAAACCTTATAATATTTATTTTATAAAATTATTCATCTTATTTTTGCGATTTCAATAGTGATATGGTATATTTAAAGTAAGCTACGTATAGTTTTACCAGTCAGAAATAGTAAGGATGGTTGAGTATGAGAGAAACCGAAACACACGATCACCAAGCGCTAATTCAAAAATTGTTAGTCAGTATTCATTATTTAACCTTGTTTCGTGATGAAATTATATTAGTAGAAAAAACCCCATCTTTACTGGGGAAACATTTTTCTATTGCTATTGTGCAGAATGAACTAGGTGAGATACTTTCTAAAATAGAAGCTTTGAGTAAGCAAAAAAAACTGATTCGTTCTATTTATTGGTATGATGAATCGTCATTTAAAGTCATGAATAAGGCTCTGGCTATTGTAGAAGAATGGATTAAGGGCTTAGATAATCTTTTAGAATTCTGTCAATTACAGACGGTTTTTCAAGCAATTTTAGGTGATGAACGTGCACATGTATTTGGAATCCTTATTGATGTTTATACTTCTTTAAACATTATAAATACTTCTTTGAAAGAAGAAAATTCTAGACCAGTGTCCTTATCTGATTTGGCTCTAGGTCTTAAGGACGAAGATTAATAAAAAAACGTTACTGCTTTGAATGAATAAAGCAGTAACGTTTTTTATAAAATATTGCTATACTAGTAATACAGATATCTAAAAGTAAGGAGTTATAAATGAAACATTCTAGTTGGCATGATTTAATAAAAAGAGAACTACCCAATCATTACTACAATGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCT

cps-detection基因序列:

CTGACAACAATGGATTTTGGGTGAGGAATTTGAGACATCATTTCCTCAGAAAAGTAGAAAGAATTATGCAGGCCTTGATCATAACTCAGATAAGGATAATCTTCTAAATCTTTCATACTTAATTTTTTTCTATTAGCTAAGGGATTGGATTTGCTCACGAAAATATGAGGTGTAGTAGTAAAAAGAGTTGTGGCAATTAAGGAATTATCGTCTAATAATTTGGTTAATACATCTCTATTATAGCTATTAAGAAACAGAACACCAATCTCTGAACGGAAATTTTTAACATCATCAATAATTTCCCAAGTCCTAGTTTCACGTAAAAAAAGTTCGTATTGGGTCATGTCTGTGCCATTAAAGAGAGCTACAAAAGCGTTAACCACAAATGCATAGTGTTGTGAAGAAACGCTGAACAGCTCACGACTTGTATTATCACCCTTATAACGCTCTTCAAGAAGTGCTGTTTGTTCTAGAATTTGTCGCGCATATGACAGAAATTCCATACCATCTTTTGTTAACGTTATTCCTTTTGGATTTCGAATAAAAATTTGGATCCCCATCTCAGTCTCAAGGTTCCTAACAGCGTTTGAAAGTGAAGGTTGGGTAATGTAGAGTTGTTTAGCGGCTTCATTCATGCTACCAGTTTCTACAATCTTAATAACATATTGTAATTGTTGAATTCTCATAACTCTAGTTTAAACTAGAATGTAAATAAATTCAATTAGATCAGCTAAATTATCAATATAGATCAATTGAAAATGTTATTTAGCTAATATAATCAGATTATTCCAATATTATTTTCGTTGAATATTGTATTGAAAAATGATATAATATCCAAGTAAAATTAAGGTTTTTTAAGTATTGGAGAATTACAATGTCTAATCATTCGCGCCGTCAACAAAAGAAACACTCACATACACCTCTTAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAACGTCAATAAAGCAATTGGAATAAAGAAGCGAAAAAGGAGAAGTCGGTTCAGAAAAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGTAATATAAAAACCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAGTGACATTAGAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCATATTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTATCTGACAATTCCTGAATAGAGTTCATAAACAATCCTGCATGATAACCATCACAAACAGAATGATGTACCTGTAAAGATAGCGGTAAATATATTGAATTACCTTTATTAATGAATTTTCCTGCTGTAATAATGGGTAGAAGGTAATTACTATTATTATTGATATTTAAGTTAAACCCAGTAAATGAAGTCCATGGAATAATAGAAAGAGAGAAAGCATTTTCAGGTATAGGTGTTTTGGGAAACAATTTCCCCGAACCATTATATTTCTCTACATCAGAAAGGTATAAATCATAAAACTCTTTGAAGTCATTCTTTACAGGAGTCCAAATACCAGAGAATGTTTTAGATACACCATCAAAAATTGTATAAAGTGGCTCTAACTTATCCCAATAACCTAACTCTCCGTCGCTATTGTAACCAGTTCTAAAAGCTGTATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACTAAGAAAATAAATGCAGGGTAAAATTTATATCCTTCTTGTTTTATGTTTCGGTATAAAACACTAATATCAATTTCTGTGGTTATACTAAAAGTCGTTTGTTGGTTCAAATAATGATTAAATATCTCTTTTCTCTTCCAATTGTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATTTGATATGCCTCCTAAATTTTTATCTAAAGTGAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGCTTTCTTCATTAGAATCAATCCTTTTTTAAAAGTCAATATTACTGTAACATAAATATATATTTTAAAAATATCCCACTTTATCCAATTTTCGTTTGTTGAACCATTATATCACATTATCCATTAAAAATCAAACAAATTTTCATCAAGCTCTAGTTCGGTGGTCAATATCAATTATTTGTAGACGAAGTTAAAACCTTATAATATTTATTTTATAAAATTATTCATCTTATTTTTGCGATTTCAATAGTGATATGGTATATTTAAAGTAAGCTACGTATAGTTTTACCAGTCAGAAATAGTAAGGATGGTTGAGTATGAGAGAAACCGAAACACACGATCACCAAGCGCTAATTCAAAAATTGTTAGTCAGTATTCATTATTTAACCTTGTTTCGTGATGAAATTATATTAGTAGAAAAAACCCCATCTTTACTGGGGAAACATTTTTCTATTGCTATTGTGCAGAATGAACTAGGTGAGATACTTTCTAAAATAGAAGCTTTGAGTAAGCAAAAAAAACTGATTCGTTCTATTTATTGGTATGATGAATCGTCATTTAAAGTCATGAATAAGGCTCTGGCTATTGTAGAAGAATGGATTAAGGGCTTAGATAATCTTTTAGAATTCTGTCAATTACAGACGGTTTTTCAAGCAATTTTAGGTGATGAACGTGCACATGTATTTGGAATCCTTATTGATGTTTATACTTCTTTAAACATTATAAATACTTCTTTGAAAGAAGAAAATTCTAGACCAGTGTCCTTATCTGATTTGGCTCTAGGTCTTAAGGACGAAGATTAATAAAAAAACGTTACTGCTTTGAATGAATAAAGCAGTAACGTTTTTTATAAAATATTGCTATACTAGTAATACAGATATCTAAAAGTAAGGAGTTATAAATGAAACATTCTAGTTGGCATGATTTAATAAAAAGAGAACTACCCAATCATTACTACAATAAAATTAATACATTTATGGATGCAGTTTACGAAAGCGGAATCGTTTATCCTCCAAGAGATAAGGTGTTCAATGCCATACAGATAACACCACTAGAAAACGTAAAAGTAGTGATTATTGGCCAAGATCCTTACCATGGCCCTCAACAAGCTCAAGGACTCTCATTTTCTGTTCCAGACAATTTACCAGCTCCTCCTTCACTTCAAAATATTCTAAAAGAATTAGCAGAAGATATTGGGTCACGTTCACATCATGACTTAACATCATGGGCGCAACAAGGAGTGCTGCTATTGAATGCTTGTTTAACAGTTCCAGAACACCAAGCTAATGGTCATGCTGGGCTTATATGGGAACCTTTTACTGATGCTG

cps基因簇缺失片段:

ACGGGTGATTAATTTATTTCTTTTGGTGATTTTTATTTTGTTAAGTGTAGTCTCATTATTTCTTATGTAT

CGTCACCATTTTTTGGCATTTAGACACCTGAACGTCATTTATGGAGTTGTAATTGTTTTAATCATTTT

AGCAAGTTTATTTCTTTGTATCAAGAATAAAGCTAGAATTTTTACAACTATAATTTTAGTATTAGCTT

CTATTTTCGTTGCTACTACTTTATATGGATTTAAGTCAACCATTGATTTGACAAATAATCTAAATAAAA

CTGCTTCATACTCTGAAATTGAGATGAGTGTAATTGTACCAAAAGATTCTAAAATAACCAATATAGA

AGCTGTCAGCAAATTAGCCGCACCAGTTAAAAACGATACTTCAAATATTACTGATTTGATAGAACAT

ATAAAATCAGAAAAAGGAATCTCTATTACACCACAAAAAACAGATTCTTACCAGGATGCATACAAT

AGAATTAAAAATGGTGATAGTCAGGCTATGGTTTTAAATAATGCTTATGTTAGCTTAATTGAACTTA

GCACCCCTGATTTTAAATCGCAGATAAAAACGATTTATACTTACAAAATTAAGAAAAAAATTAATCG

TAAAAATACTAATCATAAAGAAGGGGTATTTAATATCTATATTAGCGGTATTGATACTTTTGGCTCTAT

ATCAACAGTATCAAGATCTGATGTAAATATTATTATGACGGTTAATACCAATACCCACAAAGTATTGT

TAACGACAACACCACGAGATGCCTATGTAAAAATTCCAGATGGTGGGGGCAATCAATATGATAAAT

TAACCCATGCAGGTTTGTATGGCGTTGAGACATCAATGAAAACACTTGAAAACCTTTACGACATCA

ACCTTGATTATTATGCTAGAATTAATTTTTCATCATTTTTAAAATTAATAGACCTCTTGGGAGGAGTG

ACAGTTTATAACGATCAAGCTTTTACAAGTAAACATGGTAATTTTGACTTCCCTGTTGGTCAAGTAA

CATTGAATTCTGAGCAGGCTTTGGGCTTTGTTAGAGAACGTTATTCTCTACAAGGAGGCGATAAC

GATAGAGGTAGAAATCAAGAAAAAGTGATTGCAGCTATTATAAATAAGTTAGCTTCTAGTCAGTCA

GTAACAAAATTAAATAGCATTACCTCACAGCTCCAAACGTCCGTTCAAACTAATATGACTATTGATAA

TATTAATGATTTGATTAACAATCAATTGTCAACTGGACAACGCTTCACTGTCGAGTCACAAGCATTA

ACTGGTCATGGTTCAACGGGTGAACTCCCTTCATATGCAATGCCAGGAGCTCAACTTTATATGATGT

CAATTGATCAATCTAGCTTATCTAATGCAAAATCAAAAATTAAGAACACAATGGAGGAATAACAAG

AATGATTGATATTCATTCTCATATCGTTTTTGATGTAGATGATGGGCCTAAAACGCTTGAAGAGAGT

TTATCTTTAATAGAAGAAAGTTATCGACAAGGTGTTAGAATAATTGTTTCGACATCACATAGAAGAA

AAGGTATGTTTGAAACACCTGAAGATATTATCTTCAAAAACTTTTCTATAGTTAAACACGAAGCGG

AAAAAAGATTTGAACATCTTCAAATCTTATATGGTGGAGAATTGTACTATACAAGTGATATGTTAGA

AAAACTGAAGTTAAAGCAAATTCCAACTTTAAACAATACGAAATTTGCTTTAATTGAATTTTCTATG

CAAACTTCTTGGAAAGATATTCATACAGCTTTGTCAAATGTTTTAATGCTTGGTATTACACCAGTCG

TTGCGCATATAGAGAGGTATAACGCTTTAGAGAATCAAAAAGAACGGGTGAAGGAAATTATTAATA

TGGGGTGTTACACACAAATAAATAGTTCCCATATTTTGAAACAAAAACTTTTTAATGATAAGCATAA

ACGCTTTAAGAAAAGAGCCCGTTATTTTTTAGAGGAAAATTTAGTGCATTTTGTAGCGAGTGATAT

GCATAACCTTGATGTTAGACCGCCATTTTTAGCAGAAGCTTATAAGATTATCTGTAGAGATTTCGGT

AAAGAACGTGCTAACCAACTTTTTATTGAAAATGCTCAATCTATATTAAAAAACCATTACATTTAGG

AGATTTCATGAATAAAATAGCTAATACAGAAGTTGAAATAAATATATTCAACCTTTTAAAAAAATTGT

GGAAAAAGAAATTTTTAATCACATTTGTTGCCATTGCATTTGCAACAGCTGGACTTTTCTATAGTCT

TTTTATTGTTACGCCACAATATACTTCTTCAACAAGGATATATGTCATTAACCCTAATACCCCTAATAAT

AGTATTACTGCACAAGATCTACAAGCGGGGAGTTTTCTTGCAAATGACTATAAGGAGATTATTACG

TCTACTGACGTTCTAGAAAAAGTTATTTCTTCTGAAAAATTGAATTATCCTTCGTCTCAGTTGTTGC

AAAAAATAACAGTTTCTATTTTAAAAGATACACGTGTTATTTCAATATCGGTCGAAGATGCTAATCC

AAAAATGTCTCAAAAATTAGCAAATTCAGTTAGAGAAGCAGCAGTTTCAAAAATCAAGGCAGTTA

CTCAAGTAGAGGATATCACTACTCTTGAGAAGGGAAATTTACCTAAAGCACCATCTTCTCCTAATAT

TAAAAAGAATGTACTAATCGGGTTTATTGTTGGTGCAGGATTATCAACTATTGTTTTAGGTATTATG

GGTATTTTGGATGATCGTGTTAATACTGAAGAAGATATTGAAAAGGCCCTAGGACTTACTTCTTTA

GGTATAGTACCAGATTTGAATAAACTTTAAGGAGAATATAATGACTCGTTTAGAAATAGTTGATAGC

AAGTTAAGACAAGCAAAAAAAACAGAAGAATACTTCAATGCGATCCGTACAAACATACAGTTTAG

TGGAAAGGAAAATAAAATTCTTGCAATTACCTCTGTTAGGGAAGGGGAAGGAAAATCCACTACTT

CAACAAGTTTAGCTTTATCTTTAGCTCAAGCAGGATTTAAAACATTATTAATTGATGCGGATACTAG

GAACTCTGTTATGTCTGGAACCTTTAAAGCAACTGGAACTATTAAAGGCTTGACGAATTATTTATCA

GGTAATGCAGATCTTGGAGATATTATCTGTGAAACCAATGTTCCTAGACTGATGGTCGTTCCTTCAG

GGAAAGTACCACCAAATCCAACAGCATTACTTCAGAACGCTTATTTTAATAAGATGATTGAAGCTAT

TAAAAATATATTTGATTATATTATCATCGATACTCCACCTATTGGTTTAGTTGTTGATGCCGCAATAATC

GCTAATGCTTGCGATGGTTTTATTTTAGTAACCCAAGCAGGTAGAATAAAACGTAATTATGTTGAAA

AAGCAAAAGAACAGATGGAACAAAGTGGTTCAAAGTTCTTAGGTATTATTCTTAATAAAGTTAGTG

AATCTGTTGCTACTTACGGCGATTATGGAAATTACGGAAAAAGGGATAGAAAAAGGAAGTAAGG

GGCTCTTGTATTGAAAGAAAAAGAAAATATACAAAAGATTATTATAGCGATGATTCAAACAGTTGT

GGTTTATTTTTCTGCAAGTTTGACATTAACATTAATTACTCCCAATTTTAAAAGCAATAAAGATTTAT

TGTTTGTTCTATTGATACATTATATTGTCTTTTATCTTTCTGATTTTTACAGAGACTTTTGGAGTCGTG

GCTATCTTGAAGAGTTTAAAATGGTATTGAAATACAGCTTTTACTATATTTTCATATCAAGTTCATTAT

TTTTTATTTTTAAAAACTCATTTACAACGACACGACTTTCCTTTTTTTCTTTTATTGCTATGAATTCGA

TTTTATTGTATCTATTGAATTCATTTTTAAAATATTATCGAAAATATTCTTACGCTAAGTTTTCACGAG

ATACCAAAGTTGTTTTGATAACGAATAAGGATTCTTTATCAAAAATGACCTTTAGGAATAAATACGA

CCATAATTATATTGCTGTCTGCATCTTGGACTCCTCTGAAAAGGATTGTTATGATTTGAAACATAACT

CATTAAGGATAATAAACAAAGATGCTCTTACTTCAGAGTTAACCTGCTTAACTGTTGATCAAGCTTT

TATTAACATACCCATTGAATTATTTGGTAAATACCAAATACAAGATATTATTAATGACATTGAAGCAAT

GGGAGTGATTGTCAATGTTAATGTAGAGGCACTTAGCTTTGATAATATAGGAGAAAAGCGAATCCA

AACTTTTGAAGGATATAGTGTTATTACATATTCTATGAAATTCTATAAATATAGTCACCTTATAGCAAA

ACGATTTTTGGATATCACGGGTGCTATTATAGGTTTGCTCATATGTGGCATTGTGGCAATTTTTCTAG

TTCCACAAATCAGAAAAGATGGTGGACCGGCTATCTTTTCTCAAAATAGAGTAGGTCGTAATGGTA

GGATTTTTAGATTCTATAAATTCAGATCAATGCGAGTAGATGCAGAACAAATTAAGAAAGATTTATT

AGTTCACAATCAAATGACAGGGCTAATGTTTAAGTTAGACGATGATCCTAGAATTACTAAAATAGG

AAAATTTATTCGAAAAACAAGCATAGATGAGTTGCCTCAATTCTATAATGTTTTAAAAGGTGATATG

AGTTTAGTAGGAACACGCCCTCCCACAGTTGATGAATATGAAAAGTATAATTCAACGCAGAAGCG

ACGCCTTAGTTTTAAGCCAGGAATCACTGGTTTGTGGCAAATATCTGGTAGAAATAATATCACTGAT

TTTGATGAAATCGTAAAGTTAGATGTTCAATATATCAATGAATGGTCTATTTGGTCAGATATTAAGAT

TATTCTCCTAACACTAAAGGTAGTCTTACTTGGGACAGGTGCTAAGTAAAGGTAAGGTTTGAAAG

GAATATAATGAAAATTTGTCTGGTTGGTTCAAGTGGTGGTCATCTAGCACACTTGAACCTTTTGAA

ACCCATTTGGGAAAAAGAAGATAGGTTTTGGGTAACCTTTGATAAAGAAGATGCTAGGAGTATTC

TAAGAGAAGAGATTGTATATCATTGCTTCTTTCCAACAAACCGTAATGTCAAAAACTTGGTAAAAA

ATACTATTCTAGCTTTTAAGGTCCTTAGAAAAGAAAGACCAGATGTTATCATATCATCTGGTGCCGC

TGTAGCAGTACCATTCTTTTATATTGGTAAGTTATTTGGTTGTAAGACCGTTTATATAGAGGTTTTCG

ACAGGATAGATAAACCAACTTTGACAGGAAAATTAGTGTATCCTGTAACAGATAAATTTATTGTTCA

GTGGGAAGAAATGAAAAAAGTTTATCCTAAGGCAATTAATTTAGGAGGAATTTTTTAATGATTTTT

GTCACAGTGGGGACACATGAACAGCAGTTCAACCGTCTTATTAAAGAAGTTGATAGATTAAAAGG

GACAGGTGCTATTGATCAAGAAGTGTTCATTCAAACGGGTTACTCAGACTTTGAACCTCAGAATTG

TCAGTGGTCAAAATTTCTCTCATATGATGATATGAACTCTTACATGAAAGAAGCTGAGATTGTTATC

ACACATGGCGGTCCAGCGACGTTTATGAATGCAGTTTCTAAAGGGAAAAAAACTATTGTGGTTCC

TAGACAAGAACAGTTTGGAGAGCATGTGAATAATCATCAGGTGGATTTTTTGAAAGAGTTATTCTT

GAAATATGAATTAGATTATATTTTGAATATCAGTGAATTAGAGAATATTATTAAGGAAAAAAATATAT

CTACTAGTAAAGTAATATCACAAAACAATGATTTTTGTTCCTCTTTCAAAAATGAACTTTCTAAACTA

TTTGAATAAATATATTTTGTTGGAGAAAAAAATTGAAATTAACTATCAATCCAAAGTATTTGTTAATA

GGAGGAATTTTCGCTTTAACCCTATTTTCAAAGCCAATGCAACTTTTGTTACTTTTAGCATTAATAG

TTTTACTTATTTGTAGTAGTTATAATGAAAAAATGAAATTTTTAAATATGGCTGAAATTTTTTTCATTG

TATTTTATATTATTTATTTAACTTCAATATTGCTACATTCTTTGTTTAAAAATCCTGATTTTGATAGAAT

TTTAGCAGCTTTTAACTCGTTGATTATCGGTATAGTATCATTGGCTTTTTATCATTATTATAAGAATAC

AACTTTGGAGTTAGATAAAATATTAAAAGCATTTTTATTTAATGGGTTAATCCTATTTTTTTTAGGGG

GAACATATTATTATTGTTTGCATAATAATATTCAAAATATCAGTATTTTTGGTAGAGATTTGATTGGGT

CAGACTGGATTAATGGTATGCATACTCAAAGAGCAATGGGATTTTTTGAATATTCAAACCTTATAAT

TCCTATTACAGTGGTAACTAACTTATATATATATATATATATGAAGTTAAGAAACTATTCAATTATGACC

ATAGGTGTTGTATTATTATTTACCTTTATTTTACCTATTGGATCGGGCTCCAGGGCTGGAATAGTAGC

TATATTGGCGCAGATGTTTATTCTTCTTCTAAATACAGTTGTCGTAAAGAAGAAAACTATAAAATTTT

TATTGTACATACTTCCGTTTCTACTAGTAATAGTAATGATGTTATATTTTGATAACTTACTATCTATATAT

TATCGTATAATTAATTTGCGATCCGGGAGTAGTGAATCCAGATTTTCTTTATATAAAGATACAGTAAA

CATCGTTATAAATAATTCTTTATTATTTGGAGAAGGAGTTAAAGAGTTATGGTTAAATAGTGATCTAC

CTTTGGGGTCGCATTCAACGTATATAGGCTATTTCTACAAAAGTGGCCTGCTGGGATTAATGAATAT

AGTTCCAGGTTTGCTTTTAATTTTTACTAATATTGGTAGGAAAGCTAAACAATCAGCTTTTTATTATG

AGATAGTAGGAACACTTATAACTTTATTCTCATTTTTTGCACTTGAAGATCTTGACGGAGCTAATTG

GCTTATTGTTTTTATTTTTACAGTGTTAGGAATTTTAGAAAATAAGGATTTTTATAGTCAACTTAAAA

GGTGGAAAAGTTAATGGAAAAACGAATACTTGTTTCTATCATTATACCTATATACAACTCAGAAGCA

TACCTTAAAGAATGTGTGCAATCCGTACTACAACAGACTCATCCATTGATAGAAGTTATACTAATTGA

TGATGGATCCACTGATAATAGTGGAGAAATTTGTGATAATTTATCTCAAGAAGATAATCGCATACTT

GTATTTCATAAAAAAAATGGAGGGGTCTCTTCGGCAAGGAACCTAGGTCTAGATAAATCCACAGG

AGAATTCATAACATTTGTGGATAGTGATGATTTTGTAGCACCGAATATGATTGAAATAATGTTAAAA

AATTTAATCACTGAGAATGCTGATATAGCAGAAGTAGATTTTGATATTTCGAATGAGAGAGATTATA

GAAAGAAGAAAAGACGAAACTTTTATAAAGTCTTTAAAAACAATAACTCTTTAAAAGAATTTTTAT

CAGGCAATAGAGTGGAAAATATTGTTTGTACAAAATTATATAAAAAAAGTATAATTGGCAACTTGA

GGTTTGATGAGAACTTAAAAATTGGTGAGGATTTACTTTTTAATTGTAAACTCTTATGTCAAGAGC

ACCGTATAGTCGTAGATACGACTTCTTCCTTATATACTTATCGAATTGTAAAAACTTCCGCAATGAAT

CAGAAATTCAACGAAAACTCATTAGATTTTATAACAATTTTTAATGAAGTAAGTAGTTTGGTTCCTG

CCAAATTGGCTAATTATGTTGAAGCGAAATTTTTAAGAGAAAAGATAAAGTGTCTCCGAAAAATGT

TTGAATTAGGTAGTAATATTGACAATAAAATCAAAGTACAACGAGAGATTTTTTTCAAAGACATTAA

ATCATACCCGTTCTATAAAGCGGTAAAATACTTATCATTAAAGGGATTATTAAGCTTTTATTTAATGA

AATGTTCACCTAAACTATATGTTATGGCATATAGAAGATTTCAAAAACAGTAGCTGGAGAAATTGG

GAAAGAGAATTTATAACTTCATGATAAAGAAAATTGAAAAGGATTTAATAAGTGTAATTGTACCTAT

TTATAATGTTGAAGATTATTTAGTTGAATGTATAGAAAGCCTTATTGTTCAAACATATCGAAATATTG

AAATATTATTGATTAATGATGGTTCGACGGATAATTGTGCGACAATTGCCAAAGAATTTTCTGAAAG

AGATTGTAGAGTTATCTATATAGAAAAGTCGAATGGTGGGTTGTCAGAAGCTAGAAACTATGGAAT

TTATCATTCAAAGGGAAAATACTTAACTTTTGTTGATTCAGATGATAAAGTTTCCTCTGATTACATAG

CGAATTTGTATAATGCTATTCAAAAACATGATTCGTCTATAGCTATCGGTGGCTATTTAGAATTTTATG

AAAGACATAATAGCATAAGAAATTATGAATATTTAGACAAAGTGATACCAGTTGAAGAAGCACTAC

TAAACATGTATGACATTAAAACTTATGGTTCAATTTTTATTACTGCATGGGGAAAATTATTCCATAAA

TCTATATTCAATGATTTAGAATTTGCATTAAATAAGTATCATGAGGATGAATTCTTTAACTATAAAGCA

TACTTAAAAGCTAATTCTATAACATACATAGACAAGCCTCTCTATCATTATCGTATACGAGTAGGTAGT

ATCATGAATAATAGTGATAATGTTATAATTGCTAGAAAGAAACTTGATGTTTTATCAGCATTAGACGA

GCGAATAAAACTTATAACAAGTTTACGTAAGTATTCCGTTTTTTTACAAAAAACAGAAATATTTTAT

GTCAATCAATATTTTAGGACTAAAAAATTTTTAAAACAACAATCTGTAATGTTTAAAGAAGATAACT

ATATCGATGCTTATAGAATGTATGGACGGTTACTTAGAAAAGTGAAGTTAGTTGATAAATTAAAACT

TATAAAAAATAGGTTTTTCTAGAAATGGCTGTTTAATAGTTGTAATGTGAGTGACCACGAATTGTTG

GATAACTATCAAAAAGACTAATTTAGGGGAAAAATAAAATGACTAATTTTGTTTGTCATACTTTATA

CCATCTACTGATTACTATAATAAAGTTAAAAGATAAAGAAAATACTAGAATATTTATTTGTGACACTA

TCACGGATTATGAAACTTGGGTAAAGATATTAAATGATCAGGGAATAAGAACTGAATCATTTAAAG

AGTTTGCTTATCGGGAGCAGTTACAAAATAAAAATATTGAAGAAGTGATGGAGCTTGTAGATTCA

GACTTAAATCACTACTTTGAGAGAGTAGATACACAAGTCTATCTATTTAATGATGATACTTTAATAGG

TCGCTATATGGTGTATTTAGGTAAAAATTATCATCTAATTGAAGATGGTTATAACTGTTTTCAAGCCA

AGTTATTCTTGGGTGGTTCTGTCGTAAAACGAGTAATTAAAACTTACTTATTTAAAAAGTATGTTCC

GTATGGTTTTTCAAAATATTGTCTCTCAATTGAGGTTAATTCTTTAGTGGGGTTACCTCATGACATAA

GGAGTAAGAAATATAAAGAACTACCGAGAAAAAAATTATTTGATAGTCTTAACAAAGAACAAAAA

TCACTGATTTTCAAAATATTTAAAACAAAACCATTAACTATAACTCCAAAGTCAGTATTATTGTTGAC

ACAGCCACTTGCACAAGATAAATGGTATAAAACACCTACAGAGAGGTTTCAAAGTATTCAAGAGC

AATACGATTATTTTGACGATATTGTCCAGGAATATAGAACGTTAGGGTACAATGTTTATTTAAAAGTT

CATCCTAGAGATGTAGTAGATTATTCCAAATTGCCGGTAGAGCTATTACCATCAAATGTTCCTATGGA

AATTATAGAGTTGATGTCAACAGGTCGGTTCGAATGTGGGATAACACATTCGTCCACTGCGCTGGA

TTCTTTAACTTGTGTTGATAAAAAAATAACTTTAGTAGATCTGAAGGATATTAAATGAATACTAAGA

AATTACTTCAATCTGGTTTTATTTATACACTCGGTAATTTATTGGTGCAAGGATTAGCCTTTATCACA

CTTCCCATCTATACTCGGGTTATCTCAACAGAAGTTTATGGCCAATATAGTTTATATGTCGCTTGGAT

GAATATTATTATGCTTTTTATTGGCCTTCAGACGAGCGGTTCTTTAAGTTCAGCCCGGGTCAAATAC

GGAGAAGAATTTAAAAGCTATTCAGGGAGTGCCTTTTCTGTAGGTAATATATGGTTTCTTATTATAC

TTTTGATAGCTTTTCTATTTAGAAGTTTTCTTGCACCATTAGTTGGTTTTTCTGAATCTATTTTTTTAT

TAATGGTGTGTCAAAGTTACGCTAGCTATGTGGTGACTTTCTTTGGTCAGTATTTTATACAACAACA

GAGGAGTTTGGCTAATTTAATATTATCCTTAGCCAATGCAGTTTCATCTGTTGCACTATCTCTATTTTT

AATTTTTCATTGGTCCGATGACTTTTTATCTAGGGTTTTTGGAGCTTTTGTTCCTACTATAATAACTG

GAATAGTTGCCTTTGCTTATATTTATTATCATAGCAAATCTTTTTACAATCCTAAGTATTTTCGGTTCA

TTGTCACTGTGTCTGTTCCTTTGATTTTTCATTTGTTAGGACACCAGTTGTTGGGGCAATTAGATAG

AATTATGCTAGCTCGTTTATACAATACTAAAGAAGTTGCAATGTATAGTTTCGGTTATTCGCTTGGAA

TGATTATTCAGATTGTTTTGAATAGTATTAATATGGCTTGGATTCCATGGTTTTTTGATGCTAGAAAA

GAAAAATTACTGCAACTTTCAACTTATATTAGCCGTTATCTCTATTTAGGAGTTTTCTTAACATTAGG

TTATTTGACTGTTTTTCCTGAGTTAGCTCAAATAATGGGAGGAGACAAGTATAGTAGTAGTGTTCAA

TTTATTTCTTTAATTATTGTCAGCTACTTTTTAGTTTTTCTCTATACATTTCCTGTAAATATCCAATTCTT

CTATGCTAATACGACATGGATTCCTATTGGGACATTATTAGCTGCTGGTGTAAATTGGTTACTAAACC

TTGTATTAATTCCTCATTATGCAGCCTATGGCGCTGCTATGGCTACAATAATATCTTATTTAGCCTTGT

TGATTTTTCATCATATTGTTTCGAAAGTTAAATACCATTATTCAGATGTCTCAGTTAGGCAGTACATC

ATTTTAAGTGGTATAGTATTTAGTTATGCTATGTTAATGAACATGTTCCTAGATAATATCGTTATTAGAT

GGAGTTTAGGAATAATTATTCTTATAGTATATAGCATTGTTTTTCAAAAAGTCATTTTAGACTTATTG

AGTAAAAAAAGAAGGAGAAGATAATGGTTTATATTATTGCAGAGATTGGTTGCAATCATAATGGAG

ATATTAATCTTGCGAAAAAAATGGTAGATGTTGCGGTGTCTTGTGGTGTTGATGCTGTTAAATTTCA

GACTTTTAAAGCTGAGAAACTTATTTCTAAATTTGCTCCCAAAGCTGAATATCAAAAAGAAACTAC

AGGAACAGCAGACAGTCAACTTGAGATGACGAAACGTTTAGAGTTAAGCTTTGAAGAATACTTA

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