一种用于离体细胞水溶性代谢物的二维核磁共振检测方法

摘要

本发明公开了一种用于离体细胞水溶性代谢物的二维核磁共振检测方法。方法具体为：1)将培养好的细胞用冰冻的磷酸盐缓冲液冲洗离心后收集细胞沉淀；2)向细胞沉淀中加入含硅酸钠的磷酸盐缓冲液提取细胞系水溶性代谢物；3)取步骤2)水溶性代谢物提取液进行二维核磁共振检测，得到水溶性代谢物相对含量。该方法通过对细胞预处理、提取水溶性代谢物、核磁共振检测等步骤进行合理优化，从而提高对水溶性代谢物的提取效率和检测，实现对离体细胞水溶性代谢物水平变化的准确测定。

说明书

技术领域

本发明属于核磁共振检测技术领域，具体涉及一种用于离体细胞水溶性代谢物的二维核磁共振检测方法。

背景技术

通常情况下，一项实验成果的临床应用首先要经过实验室细胞实验、动物实验证实，之后进入临床试验阶段；为保证实验结果的可靠性，细胞实验必须完全等同或接近于临床应用条件。而对于核磁共振波谱的检测，由于现有临床型核磁共振仪场强及线圈的设计限制，细胞系代谢物的核磁共振波谱的检测很难直接获得。

目前直接获取细胞中代谢物核磁共振波谱的方法可以通过高分辨率魔角核磁共振仪直接检测获得，即将培养好的细胞系收集起来，在4℃条件下用重水进行漂洗，漂洗后放入直径为4mm的专为魔角实验设计使用的石英管中。每个样品装样时间不超过5分钟，采集时间不超过20分钟。魔角线圈在对样品的磁共振波谱检测过程中，由于提取代谢物过程中离子浓度过高导致核磁共振和质谱检测结果分辨率下降，以及原子核的化学位移作用、核之间的偶极-偶极作用及样品内部磁化率的不均匀性等因素影响，进而导致了频谱内各代谢峰宽度增加，互相重叠，难以辨别，直接影响了物质结构的有效分析，同时，由于受机体生理活动的影响，无法获得良好的谱线，而且不能获得离体细胞代谢物的绝对含量。因此有必要对上述检测方法做进一步改进，从而能够准确测定细胞内代谢物的水平变化。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种用于离体细胞水溶性代谢物的二维核磁共振检测方法。该方法通过对细胞预处理、提取水溶性代谢物、核磁共振检测等步骤进行合理优化，从而提高对水溶性代谢物的提取效率和检测，实现对离体细胞水溶性代谢物水平变化的准确测定。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种用于离体细胞水溶性代谢物的二维核磁共振检测方法，所述方法具体为：

1)将培养好的细胞用冰冻的磷酸盐缓冲液冲洗离心后收集细胞沉淀；

2)向细胞沉淀中加入含硅酸钠的磷酸盐缓冲液提取细胞系水溶性代谢物；

3)取步骤2)水溶性代谢物提取液进行二维核磁共振检测，得到水溶性代谢物相对含量；

优选的，所述步骤1)中磷酸盐缓冲液浓度为0.4～0.5M，pH7.0～7.4；

优选的，用水配制步骤2)中所述含硅酸钠的磷酸盐缓冲液，所用水中重水含量为50-100％(v/v)，优选为100％；所用TMSP(三甲基硅基丙酸盐)内标含量为0.001-0.01％(w/v)，优选为0.001％；所述硅酸钠含量为0.001～0.005％(w/v)，优选为0.0003％；NP-40(乙基苯基聚乙二醇)含量为0.5-2％(v/v)，优选为1％；配置后的磷酸缓冲液的pH值为6.8-7.5，优选为7.2；

优选的，所述细胞沉淀和含硅酸钠的磷酸盐缓冲液的质量体积比为1g:3～8ml(优选为1g:5ml)；

优选的，所述步骤2)具体方法为：

按质量体积比为1g:3～8ml(优选为1g:5ml)向细胞沉淀中加入含硅酸钠的磷酸盐缓冲液，冰浴中进行超声破碎，离心去除细胞碎片，分离得上清液即为所需细胞系水溶性代谢物提取液；

其中，用水配制所述含硅酸钠的磷酸盐缓冲液，所用水中重水含量为50-100％(v/v)，优选为100％；所用TMSP(三甲基硅基丙酸盐)内标含量为0.001-0.01％(w/v)，优选为0.001％；所述硅酸钠含量为0.001～0.005％(w/v)，优选为0.0003％；NP-40(乙基苯基聚乙二醇)含量为0.5-2％(v/v)，优选为1％；配置后的磷酸缓冲液的pH值为6.8-7.5，优选为7.2；

超声波功率为300～400W，超声程序为：超声7～9秒，间隔6～8秒，超声15～20次；

优选的，所述步骤3)核磁共振探头采用超低温探头，工作频率为600.13MHZ，扫描序列选用含抑水脉冲的zgpr序列，机器自动匀场。

由于以往针对细胞水溶性代谢物提取往往采取冰冻高氯酸法直接进行提取，然而上述方法中，由于高氯酸的强酸性和高离子浓度，对后续进行氢核磁共振时代谢物化学位移产生不利影响，主要是增大了代谢物的质子化学位移偏差；同时，采用高氯酸提取法提取水溶性代谢物效率不高，需要耗费较多的细胞，而在细胞的频谱研究中，细胞培养过程耗时耗力，显然使用细胞数量越大，其前期细胞培养付出越大，因此利用较少的细胞高效地获得较多的代谢物以供检测并能够获得尽可能全面的水溶性代谢物特征信息是频谱研究所希望的。有鉴于此，本发明创新性地提出一种新的提取液，本发明采用磷酸盐缓冲液控制pH值环境，从而使得绝大多数带有可电离基团的水溶性代谢物的化学位移偏差被控制在0.001ppm以内，但是仍有部分水溶性代谢物如乳酸、组氨酸等水溶性代谢物的质子化学位移偏差仍然较大，发明人通过添加一定量的硅酸钠，导致核磁共振谱图上的乳酸、组氨酸等水溶性代谢物的质子化学位移向高场移动，同时，细胞提取液中的金属离子如镁离子、钙离子等可以和部分水溶性化合物发生络合作用，而通过该加入硅酸钠使得细胞提取液中的镁离子、钙离子形成溶解度较低的硅酸镁和硅酸钙，从而消除钙镁离子对水溶性代谢物的络合作用，从而使得原来被掩盖的水溶性代谢物信号得到显示和获取，从而避免了后续工作产生的误差；而通过加入一定量的NP-40，加速了细胞裂解过程，减少后续采用超声破碎时的超声功率和使用次数，减少了前处理工艺，同时也减少了高功率和高频次使用超声破碎对细胞水溶性代谢物的影响。

而且，本发明在提取过程中直接加入重水和TMSP内标，避免了后续检测过程中的二次加入，减少工作流程，同时使得重水与TMSP内标与水溶性代谢物混合更加均匀，提高了检测结果的准确性。

本发明的第二个方面，公开了上述含硅酸钠的磷酸盐缓冲液在对离体细胞水溶性代谢物进行二维核磁共振检测中的应用。

本发明的第三个方面，公开了上述检测方法在对离体细胞水溶性代谢物进行检测中的应用。

本发明所述方法不仅对细胞内水溶性代谢物进行很好的提取，保证检测结果的还原性和准确性，同时也将核磁谱峰漂移减小到最低程度，提高了核磁共振谱图的质量，同时极大简化了提取工艺流程，本发明通过对对细胞预处理、提取水溶性代谢物、核磁共振检测等步骤进行合理优化，从而提高对水溶性代谢物的提取效率和检测，实现对离体细胞水溶性代谢物水平变化的准确测定。

附图说明

图1为U87细胞显微镜图；

图2为本申请实施例1得到的水溶性代谢物谱峰图；

图3为本申请对照例1得到的水溶性代谢物谱峰图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一种具体实施方式中，提供一种用于离体细胞水溶性代谢物的二维核磁共振检测方法，所述方法具体为：

1)将培养好的细胞(胶质瘤细胞系U87)用冰冻的磷酸盐缓冲液冲洗离心后收集细胞沉淀；

2)向细胞沉淀中加入含硅酸钠的磷酸盐缓冲液提取细胞系水溶性代谢物；

3)取步骤2)水溶性代谢物提取液进行二维核磁共振检测，得到水溶性代谢物相对含量；

本发明的又一具体实施方式中，公开了所述步骤1)中磷酸盐缓冲液浓度为0.4～0.5M，pH7.0～7.4；

本发明的又一具体实施方式中，公开了用水配制步骤2)中所述含硅酸钠的磷酸盐缓冲液，所用水中重水含量为50-100％(v/v)，优选为100％；所用TMSP(三甲基硅基丙酸盐)内标含量为0.001-0.01％(w/v)，优选为0.001％；所述硅酸钠含量为0.001～0.005％(w/v)，优选为0.0003％；NP-40(乙基苯基聚乙二醇)含量为0.5-2％(v/v)，优选为1％；配置后的磷酸缓冲液的pH值为6.8-7.5，优选为7.2；

本发明的又一具体实施方式中，所述细胞沉淀和含硅酸钠的磷酸盐缓冲液的质量体积比为1g:3～8ml(优选为1g:5ml)；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤2)具体方法为：

按质量体积比为1g:3～8ml(优选为1g:5ml)向细胞沉淀中加入含硅酸钠的磷酸盐缓冲液，冰浴中进行超声破碎，离心去除细胞碎片，分离得上清液即为所需细胞系水溶性代谢物提取液；

其中，用水配制所述含硅酸钠的磷酸盐缓冲液，所用水中重水含量为50-100％(v/v)，优选为100％；所用TMSP(三甲基硅基丙酸盐)内标含量为0.001-0.01％(w/v)，优选为0.001％；所述硅酸钠含量为0.001～0.005％(w/v)，优选为0.0003％；NP-40(乙基苯基聚乙二醇)含量为0.5-2％(v/v)，优选为1％；配置后的磷酸缓冲液的pH值为6.8-7.5，优选为7.2；

超声波功率为300～400W，超声程序为：超声7～9秒，间隔6～8秒，超声15～20次；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤3)核磁共振探头采用超低温探头，工作频率为600.13MHZ，扫描序列选用含抑水脉冲的zgpr序列，机器自动匀场。

本发明的又一具体实施方式中，公开了上述含硅酸钠的磷酸盐缓冲液在对离体细胞水溶性代谢物进行二维核磁共振检测中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，公开了上述检测方法在对离体细胞水溶性代谢物进行检测中的应用。

下面通过实例，并结合附图，对本发明的操作，作进一步具体的说明。

实施例1

选取胶质瘤细胞系U87进行实验，检测细胞内水溶性代谢物的变化

1.培养细胞系，使细胞数量达到1.0×10⁷；

细胞系来自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，由山东大学心血管实验室传代保存。细胞购买时存放在25cm²的培养瓶中，细胞贴壁生长，细胞形态呈长梭形，细胞间隙清晰可见，细胞间可见多个突触连接如附图2。

置于含20％胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5％CO₂条件下培养，观察细胞生长状态及培养基pH值变化。由于培养基内有酚红作为pH值指示剂，所以当细胞增殖较快时，可见培养基颜色由玫红色变为杏黄色或黄色，此时要及时更换培养基，保证细胞生长环境内pH值在7.35-7.45之间，使之接近于体内生长环境。每天在光学显微镜下观察细胞生长状态，观察细胞密度的变化，待细胞密度增长较快，即处于对数生长期时，对细胞进行放疗处理。

根据以往研究资料显示，U87细胞系在高糖型(低于4500mg/L)DMEM内生长良好。DMEM培养基内氨基酸、维生素含量较高；含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；含有糖酵解途径中的重要物质-丙酮酸；含有微量的铁离子。利用DMEM培养基有利于细胞系的贴壁生长。DMEM培养基内含有酚红作为指示剂，可以随时观察细胞生长环境中的PH值变化，对监测细胞生长状态提供有利条件。

胎牛血清：胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自天津康源生物技术有限公司，储存在-20℃条件下，配制培养基时在常温下放置，使之溶解。胎牛血清取自剖腹产的胎牛，是一种性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。胎牛血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其内含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对调节细胞生长或抑制活动的生理平衡起到重要作用。

配制培养基在生物安全柜内操作，保证细胞培养过程中处于无菌条件，避免细胞污染。在50ml离心管内用巴氏吸管吸取45ml高糖DMEM培养基，吸取5ml血清，充分吹打混匀。

酚红是一种深红色结晶性粉末。1g本品溶于1300ml水，约350ml醇，500ml丙酮，几乎不溶于醚和氯仿，溶于氢氧化碱或碳酸碱溶液中呈深红色，在空气中稳定。用于微生物及细胞培养中的鉴别培养基。颜色由黄到红，变色范围pH值为6.8-8.0。

2.利用含硅酸钠的磷酸盐缓冲液从细胞中提取水溶性代谢物

细胞从液氮罐中取出，放到无菌手套内，快速放到37℃水浴锅中迅速摇动，使细胞快速解冻，然后将解冻的细胞放置生物安全柜内进行操作。用冰冻的磷酸盐缓冲液冲洗细胞(磷酸盐缓冲液0.4～0.5M，pH7.0～7.4)；将细胞悬液移到15ml离心管中进行离心(800-1000rpm，37℃，4-6min)，离心后去上清收集细胞沉淀。

按质量体积比为1g:5ml向细胞沉淀中加入含硅酸钠的磷酸盐缓冲液，冰浴中进行超声破碎(超声波功率为300～400W，超声程序为：超声8秒，间隔8秒，超声30次)，离心(13000rpm，0℃，20min)去除细胞碎片，分离得上清液即为所需细胞系水溶性代谢物提取液；

其中，含硅酸钠的磷酸盐缓冲液具体配置方法为：用水配制含硅酸钠的磷酸盐缓冲液，所用水中重水含量为100％；所用TMSP(三甲基硅基丙酸盐)内标含量为0.001％(w/v)；所述硅酸钠含量为0.0003％(w/v)；NP-40(乙基苯基聚乙二醇)含量为1％(v/v)；配置后的磷酸缓冲液的pH值为7.2；

3.利用BRUKER AVANCE 600型核磁共振波谱仪获取提取物的二维核磁共振波谱图像进行检测，得到水溶性代谢物相对含量；

取0.8ml上清液加入加入5mm核磁管备用。置于核磁共振仪内进行检测。1H MRS检查采用BRUKER AVANCE 600型核磁共振频谱仪，探头为超低温探头，工作频率为600.13MHZ。扫描序列选用含抑水脉冲的zgpr序列，机器自动匀场。获取的氢质子频谱原始数据，经过傅里叶转换，相位及基线校正之后得到频谱图像见附图2。采用机器自带的含水抑制作用的zgpr序列，它能很好地抑制水峰，同时不会对周边代谢峰和基线产生干扰。zgpr序列：回波时间(TE)1秒、重复时间(TR)、采集次数32、数据点32768、波谱采集时间15分钟。

利用MestReNova软件对二维图谱进行处理，得到代谢物相对含量值。

对照例1

选取胶质瘤细胞系U87进行实验，检测细胞内水溶性代谢物的变化

1.培养细胞系，使细胞数量达到1.0×10⁷；

细胞系来自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，由山东大学心血管实验室传代保存。

置于含20％胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5％CO₂条件下培养，观察细胞生长状态及培养基pH值变化。由于培养基内有酚红作为pH值指示剂，所以当细胞增殖较快时，可见培养基颜色由玫红色变为杏黄色或黄色，此时要及时更换培养基，保证细胞生长环境内pH值在7.35-7.45之间，使之接近于体内生长环境。每天在光学显微镜下观察细胞生长状态，观察细胞密度的变化，待细胞密度增长较快，即处于对数生长期时，对细胞进行放疗处理。

根据以往研究资料显示，U87细胞系在高糖型(低于4500mg/L)DMEM内生长良好。DMEM培养基内氨基酸、维生素含量较高；含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；含有糖酵解途径中的重要物质-丙酮酸；含有微量的铁离子。利用DMEM培养基有利于细胞系的贴壁生长。DMEM培养基内含有酚红作为指示剂，可以随时观察细胞生长环境中的PH值变化，对监测细胞生长状态提供有利条件。

胎牛血清：胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自天津康源生物技术有限公司，储存在-20℃条件下，配制培养基时在常温下放置，使之溶解。胎牛血清取自剖腹产的胎牛，是一种性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。胎牛血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其内含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对调节细胞生长或抑制活动的生理平衡起到重要作用。

配制培养基在生物安全柜内操作，保证细胞培养过程中处于无菌条件，避免细胞污染。在50ml离心管内用巴氏吸管吸取45ml高糖DMEM培养基，吸取5ml血清，充分吹打混匀。

酚红是一种深红色结晶性粉末。1g本品溶于1300ml水，约350ml醇，500ml丙酮，几乎不溶于醚和氯仿，溶于氢氧化碱或碳酸碱溶液中呈深红色，在空气中稳定。用于微生物及细胞培养中的鉴别培养基。颜色由黄到红，变色范围pH值为6.8-8.0。

2.利用含硅酸钠的磷酸盐缓冲液从细胞中提取水溶性代谢物

细胞从液氮罐中取出，放到无菌手套内，快速放到37℃水浴锅中迅速摇动，使细胞快速解冻，然后将解冻的细胞放置生物安全柜内进行操作。用冰冻的磷酸盐缓冲液冲洗细胞(磷酸盐缓冲液0.4～0.5M，pH7.0～7.4)；将细胞悬液移到15ml离心管中进行离心(800-1000rpm，37℃，4-6min)，离心后去上清收集细胞沉淀。

按质量体积比为1g:5ml向细胞沉淀中加入浓度为12％的冰冻高氯酸，冰浴中进行超声破碎(超声波功率为300～400W，超声程序为：超声8秒，间隔8秒，超声30次)，离心(13000rpm，0℃，20min)去除细胞碎片，分离得上清液即为所需细胞系水溶性代谢物提取液；

3.利用BRUKER AVANCE 600型核磁共振波谱仪获取提取物的二维核磁共振波谱图像进行检测，得到水溶性代谢物相对含量；

取0.8ml上清液加入加入5mm核磁管备用。置于核磁共振仪内进行检测。1H MRS检查采用BRUKER AVANCE 600型核磁共振频谱仪，探头为超低温探头，工作频率为600.13MHZ。扫描序列选用含抑水脉冲的zgpr序列，机器自动匀场。获取的氢质子频谱原始数据，经过傅里叶转换，相位及基线校正之后得到频谱图像见附图3。采用机器自带的含水抑制作用的zgpr序列，它能很好地抑制水峰，同时不会对周边代谢峰和基线产生干扰。zgpr序列：回波时间(TE)1秒、重复时间(TR)、采集次数32、数据点32768、波谱采集时间15分钟。

利用MestReNova软件对二维图谱进行处理，得到代谢物相对含量值。

由附图2、3可知，采用本发明技术方案谱图中水溶性代谢物谱峰明显多于对照组，经检测，本发明技术方案共检测出乳酸、谷氨酸、苏氨酸、肌酸等45种水溶性代谢物(对照组仅检测出28种)，且附图3中谱图基线平滑度低，谱线质量不佳；且发明人发现，即是将对照组待检细胞水溶性代谢物提取液加量提高1倍进行检测，其谱线质量仍然不如本申请技术方案。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。