一种预示肺癌淋巴结转移的小分子标志物及在诊断方面的应用

摘要

本发明公开了一种预示肺癌淋巴结转移的小分子标志物及在诊断方面的应用，公开一种用于预示肺癌淋巴结转移的组合物，至少包括磷脂酰肌醇(18:3/0:0)；优选地，该组合物包括磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸。磷脂酰肌醇(18:3/0:0)单个用于诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的AUC为0.803，具有中等的准确性；血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸联合用于诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的AUC为0.937，具有较高的准确性，最佳诊断临界值处的灵敏度和特异性均在0.9以上。在独立样品集中的进一步验证证明血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸联合用于诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的准确度高达95％，具有较高的临床价值。

说明书

技术领域

本发明属于精准诊断领域，涉及诊断标志物和诊断试剂盒，具体涉及一种预示肺癌淋巴结转移的小分子标志物及在诊断方面的应用。

背景技术

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居各种恶性肿瘤之首，并呈持续上升趋势。肺癌晚期可出现各个不同脏器的转移，可引起相应的症状，常常给病人带来极大的痛苦，甚至威胁到生命。其中，肺癌淋巴结转移最为常见。肺癌淋巴结转移的隐匿性极强，早期无任何征兆，通过病理学诊断确诊时已错过最佳治疗时间窗。

肺癌淋巴结转移确诊的金标准是病理学检查，本方法特异性高，但具有创伤性，不易为患者接受，且取材存在一定难度。影像学检查是目前肺癌淋巴结转移诊断主要依靠的手段，但成本高，对微小病灶不易检出，不能满足肺癌淋巴结转移早期诊断的要求。

血清肿瘤标志物的异常往往早于影像学的异常，检测方便，可重复性强，费用低，对于无临床相关症状患者，任何一项标志物的异常都可能具有提示意义。因此，申请人旨在寻找可以用于预示肺癌淋巴结转移的标志物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种预示肺癌淋巴结转移的小分子标志物及在诊断方面的应用。

本发明上述目的是通过以下技术方案得以实现：

磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)或苯丙氨酸用于预示肺癌淋巴结转移的临床用途。

一种用于预示肺癌淋巴结转移的组合物，至少包括磷脂酰肌醇(18:3/0:0)。

优选地，所述的组合物包括磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸。

更优选地，所述的组合物还包括内标L-2-氯苯丙氨酸。

上述任一组合物在制备预示肺癌淋巴结转移的诊断试剂盒方面的应用。

本发明的有益效果：

ROC曲线分析中，ROC曲线下面积越大，其诊断价值越大。AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。磷脂酰肌醇(18:3/0:0)单个用于诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的AUC为0.803，具有中等的准确性；血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸联合用于诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的AUC为0.937，具有较高的准确性，最佳诊断临界值处的灵敏度和特异性均在0.9以上。在独立样品集中的进一步验证证明血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸联合用于诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的准确度高达95％，具有较高的临床诊断价值。

附图说明

图1为血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)单独诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的ROC曲线；

图2为血清溶血磷脂酰胆碱(18:1)单独诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的ROC曲线；

图3为血清苯丙氨酸单独诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的ROC曲线；

图4为血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)、苯丙氨酸联合诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。

实施例1：小分子标志物对预示肺癌淋巴结转移的准确性

一、材料和方法

1、研究对象

肺癌淋巴结转移组、肺癌非淋巴结转移组病例均为2015年3月至2016年12月在南京鼓楼医院住院治疗的患者，肺癌淋巴结转移组共60例，其中男34例，女26例，年龄38-72岁，平均年龄45岁；肺癌非淋巴结转移组病例共100例，其中男62例，女38例，年龄35-70岁，平均年龄43岁。所有病例均经临床和病理确诊。肺癌淋巴结转移组、肺癌非淋巴结转移组病例均随机均分为两组，一组为训练集，另一组为验证集，分组结果如下。

2、仪器与试剂

高效液相色谱-质谱仪：Agilent 1200(G6410A)，美国Agilent公司；超纯水系统：Milli-Q，美国Millipor公司；自动液体进样器：美国Agilent公司；甲醇、乙腈、甲酸、异丙醇，美国Sigma公司，均为色谱纯或质谱级别。

3、样本采集和预处理

采集入选人员空腹血标本3ml于含有肝素钠的采血管中静止1h凝固分层，离心(3000rpm10min)，取上清液分装至离心管，保存于-80℃冰箱待用。

将低温保存的血清样本室温解冻混匀，取100μL血清放入离心管，加入300μL乙腈摇晃混匀15s，室温静置15min，10000rpm离心10min(4℃)，取上清液200μL，在室温下用氮吹仪吹干，残渣用50μL乙腈/水溶剂(3:1)复溶，13000rpm离心10min(4℃)，取上清液加入50μL浓度为0.02mg/mL的L-2-氯苯丙氨酸内标后混匀备用。

质控(QC)样本的制备。为了观察试验方法的稳定性，在每6个血清后分别都加入一个QC样本。QC样本制备方法为：室温摇匀解冻的血清样本取5μL，加入甲醇和乙腈1:1混合液再加入L-2-氯苯丙氨酸作为内标。其余处理同上。

4、HPLC-MS分析条件

色谱条件：色谱柱选用ZorbaxSB-C18柱(4.6mm×100mm，3.5μm)。柱温维持在45℃，流动相组成是A为体积浓度0.1％甲酸水溶液，B为体积浓度0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件：0～3min为0～30％B相，2min内B相线性增加到60％，5～10min线性变化至90％B相，然后在10～12min线性增加至100％B相并保持3min；流速1.0mL/min；单次进样10μL。质谱条件：采用ESI，正离子模式下：毛细管电压4KV，电子能量3eV，延时溶液5min，离子源温度115℃，干燥气温度350℃，干燥气流速9L/min，参比荷质比(m/z)80-900，质量全扫描范围100-1000，扫描时间0.03s。

5、数据处理和统计学分析

计算各样本中磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸的质谱总离子流峰面积与内标L-2-氯苯丙氨酸的质谱总离子流峰面积的比值，该比值即为各样本中磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸的相对含量。应用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析，正态性分布检验用1-sampleK-S进行分析，各指标含量的组间比较用One-wayANOVALSD法检验，检测阳性率的比较采用χ2检验，用Logistic回归筛选变量并建立回归方程，对新变量及各单项指标进行ROC曲线分析。

二、实验结果

1、各组血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸的相对含量比较

组间差异比较发现，肺癌淋巴结转移组血清中3种肿瘤标志物水平显著高于肺癌非淋巴结转移组(P＜0.01)，肺癌淋巴结转移组样本中磷脂酰肌醇(18:3/0:0)上调6-8倍，溶血磷脂酰胆碱(18:1)上调1.5-2.5倍，苯丙氨酸上调2-3倍，磷脂酰肌醇(18:3/0:0)上调最为显著。

2、血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸的ROC曲线分析

ROC曲线下面积越大，其诊断价值越大。AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。运用SPSS 16.0软件在训练集中将肺癌淋巴结转移组与肺癌非淋巴结转移组血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸的相对含量分别作ROC曲线，如图1-3和表1所示。

表1血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸单独的ROC曲线分析

结果

检测标志物AUC标准误95％CIP磷脂酰肌醇(18:3/0:0)0.8030.0290.762～0.8450.03溶血磷脂酰胆碱(18:1)0.6350.0380.594～0.6760.00苯丙氨酸0.6820.0350.643～0.7280.01

从图1-3和表1可见，血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)单个用于预示肺癌淋巴结转移时具有中等的准确性，血清溶血磷脂酰胆碱(18:1)或苯丙氨酸单个用于预示肺癌淋巴结转移时具有较低的准确性。

3、三个标志物联合预示肺癌淋巴结转移模型构建及ROC曲线分析

在训练集中，以肺癌是否淋巴结转移为应变量，血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸的相对含量为自变量，建立Logistic回归模型。模型中各参数的拟合结果见表2。因此得到的模型可表示为Logit＝-3.562+2.694×磷脂酰肌醇(18:3/0:0)+1.319×溶血磷脂酰胆碱(18:1)+1.867×苯丙氨酸。

表2三个标志物联合预示肺癌淋巴结转移的Logistic回归模型拟合参数

变量系数标准误Wald检验P值OR值磷脂酰肌醇(18:3/0:0)2.6940.0923.5830.001.03溶血磷脂酰胆碱(18:1)1.3190.0517.9550.000.98苯丙氨酸1.8670.0720.1720.002.01截距-3.5620.4732.0850.010.22

该模型经过似然比检验，此回归模型具有统计学意义(P＜0.01)。用ROC曲线法对上述模型进行诊断价值分析，结果如图4所示。

从图4可见，该ROC曲线下面积为0.937，血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸联合用于预示肺癌淋巴结转移具有较高的准确性，最佳诊断临界值(1.474)处的灵敏度和特异性均在0.9以上。

4、验证集中进一步验证三个标志物联用预示肺癌淋巴结转移的准确度

在验证集中，分别将各样本中血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸的相对含量代入上述回归模型，得到各样本的回归值，回归值高于最佳诊断临界值1.474的预测为肺癌淋巴结转移，低于该最佳诊断临界值1.474的预测为肺癌非淋巴结转移，准确度为95％(76/80)。

综上可知，磷脂酰肌醇(18:3/0:0)单个用于诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的AUC为0.803，具有中等的准确性；血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸联合用于诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的AUC为0.937，具有较高的准确性，最佳诊断临界值处的灵敏度和特异性均在0.9以上。在独立样品集中的进一步验证证明血清磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)和苯丙氨酸联合用于诊断肺癌淋巴结转移与肺癌非淋巴结转移的准确度高达95％，具有较高的临床价值。

实施例2：诊断试剂盒

一种用于早期预示肺癌淋巴结转移的诊断试剂盒，包括磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)、苯丙氨酸和L-2-氯苯丙氨酸，磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)、苯丙氨酸作为对照品对待测血清中目标化合物进行定性定位，L-2-氯苯丙氨酸用作内标添加到待测血清样本中对溶血磷脂酰胆碱(18:1)、磷脂酰肌醇(18:3/0:0)、苯丙氨酸相对定量。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。