一种分离的RNASEK基因及其在制备抗血管衰老药物中的应用

摘要

本发明公开了一种分离的RNASEK基因及其在制备抗血管衰老药物中的应用，属于生物医药领域。本发明通过系统筛选促进血管细胞衰老的miRNA，发现miR‑92b*对血管细胞，尤其是血管内皮细胞衰老具有明显的促进作用。然后通过在其他类型的血管相关细胞模型中验证miR‑92b*，通过所得到的过表达miR‑92b*时其他衰老相关分子或表型的改变结果，确定了miR‑92b*具有促进血管细胞衰老的作用。在此基础上，进一步通过实验确定了miR‑92b*通过调控RNASEK基因的表达下调来促进血管细胞衰老，过表达RNASEK能够有效减缓血管细胞衰老。本发明为研发针对性的血管衰老预防及治疗提供新的科学依据，为发展新的抗血管衰老药物，尤其是抗血管细胞衰老药物及新的血管衰老分子机制提供了新线索。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种分离的RNASEK基因及其在制备抗血管衰老药物中的应用。

背景技术

衰老是生命的基本特征，衰老可以发生在个体、组织器官和细胞等不同层次，是由内在编程决定并受环境因素影响的过程。威廉·奥斯勒(William Osier)在完成大量人体解剖后指出“血管衰老，人即衰老”，说明了血管衰老在衰老中的重要作用。血管衰老与增龄相关的各类血管性疾病，例如高血压、冠心病、脑卒中、血管性老年痴呆、动脉粥样硬化和中风的发生密切相关。上述这些疾病严重影响着老年人的健康和生活质量，给患者和社会带来沉重的负担。所以，研究血管衰老是解析个体衰老以及衰老相关疾病发生发展机制的一个重要突破口，是通过延缓衰老控制衰老相关疾病的发生，提供康复、干预与保护措施及解决我国人口老龄化和衰老相关疾病所带来的一系列社会问题的重要基础和有效切入点。

研究发现，大部分引起衰老表型改变的分子能调节细胞衰老，这意味着细胞衰老与衰老之间紧密相关。而且，以衰老血管细胞为衰老模型，对血管衰老有关的重要分子信号通路的研究也验证了血管细胞衰老与上述与增龄相关的各类血管性疾病密切相关。

组织学上，血管包括内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。内皮细胞是血管的屏障，负责对外来刺激的应答，对平滑肌具有重要的调节作用；平滑肌是动脉的主要结构细胞，维持血管的收缩和张力；而成纤维细胞主要位于血管结缔组织中，对细胞外基质和损伤修复有重要作用。血管衰老是血管组成细胞衰老的综合效应。与其他细胞的衰老一样，血管组成细胞的衰老也是一个程序化的过程。随着时间的进行，细胞中的一组“衰老相关基因”有序启闭导致衰老的发生。目前已经发现多个衰老相关基因，其中包括非编码的microRNA(简称miRNA)基因。

miRNA是一类内源性非编码单链RNA，长度为21-25个核苷酸，在进化上具有高度保守性、时序性和组织特异性，几乎存在于所有多细胞生物体中。到目前为止，专门收录miRNA序列的数据库miRBase涵盖了包括植物、动物和病毒在内的超过8000种miRNA，其中，有超过800个人类miRNA存在于miRBase数据库中。据推测miRNA调节着人类三分之一的基因，参与机体诸多生理病理过程。miRNA主要作用于靶基因的3′非翻译区直接引起靶基因mRNA的降解或者抑制靶基因mRNA的翻译。可见miRNA能够参与调节细胞功能，在人类疾病的调控过程中具有重要的作用。

目前已有多篇文章报道了miRNA参与了多种细胞的衰老调控，例如人间质干细胞的复制型衰老、肺癌细胞的诱导型衰老等。然而，由于miRNA的调控具有细胞特异性。发明人发现系统评价miRNA及其靶基因在血管相关细胞，特别是血管内皮细胞衰老过程中的调控作用的报道较少。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供了一种分离的RNASEK基因及其在制备抗血管衰老药物中的应用。具体技术方案如下：

第一方面，本发明实施例提供了一种分离的RNASEK基因，所述RNASEK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

第二方面，本发明实施例提供了上述RNASEK基因在制备抗血管衰老药物中的应用。

第三方面，本发明实施例提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述的分离的RNASEK基因。

第四方面，本发明实施例提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：治疗有效量的分离的RNASEK基因或表达载体；以及药学上可接受的赋形剂。

作为优选，所述药物组合物还包括miR-92b*的抑制剂。

作为优选，所述药物组合物还包括RNASEK基因表达的正向调节剂。

第五方面，本发明实施例提供了一种体外调控组织或细胞中RNASEK基因表达的方法，所述方法包括：

抑制该组织或细胞中miR-92b*的表达，和/或

对RNASEK基因中的miR-92b*结合位点实施同义突变；和/或

施加上述分离的RNASEK基因或表达载体。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

本发明实施例提供了分离的RNASEK基因及其在制备抗血管衰老药物中的应用，首先，通过系统筛选促进血管细胞衰老的miRNA，发现miR-92b*对血管细胞，尤其是血管内皮细胞衰老具有明显的促进作用。然后通过在其他类型的血管相关细胞模型中验证miR-92b*，获取过表达miR-92b*时其他衰老相关分子或表型的改变现象，确定了miR-92b*具有促进血管细胞衰老的作用。进一步地，本发明实施例确定了RNASEK基因为miR-92b*的下游靶基因，过表达RNASEK能够有效抑制miR-92b*诱发的细胞衰老过程，进而能够有效减缓血管细胞衰老。可见，本发明为研发针对性的血管衰老预防及治疗提供新的科学依据，为发展新的抗血管衰老药物，尤其是抗血管细胞衰老药物及新的血管衰老分子机制提供了新线索。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1提供的HUVEC细胞、转染miR-34a的HUVEC细胞以及转染miR-92b*的HUVEC细胞中的β-gal染色结果示意图；

图2是本发明实施例2提供的HCAEC细胞、转染miR-34a的HCAEC细胞以及转染miR-92b*的HCAEC细胞中的B-gal染色结果示意图；

图3是本发明实施例2提供的HASMC细胞、转染miR-34a的HASMC细胞以及转染miR-92b*的HASMC细胞中的β-gal染色结果示意图；

图4是本发明实施例3提供的HUVEC细胞、过表达miR-34a的HUVEC细胞以及过表达miR-92b*的HUVEC细胞中的p21和p16蛋白的表达示意图；

图5是本发明实施例3提供的HUVEC细胞以及过表达miR-92b*的HUVEC细胞中G0/G1阻滞示意图；

图6是本发明实施例4提供的miR-92b*的13个下游靶标基因的双荧光报告系统检测结果示意图；

图7是本发明实施例4提供的在破坏RNASEK基因的microRNA结合位点后，miR-92b*对RNASEK基因的调控表达示意图；

图8是本发明实施例5提供的RNASEK表达敲低后的HUVEC细胞和HASMC细胞中β-gal染色结果示意图。

图9是本发明实施例5提供的通过过表达miR-92b*和RNASEK时，HUVEC细胞和HASMC细胞中β-gal染色结果示意图。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

第一方面，本发明实施例提供了一种分离的RNASEK基因，该RNASEK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

第二方面，本发明实施例提供了上述RNASEK基因在制备抗血管衰老药物中的应用。

研究发现，miR-92b*对血管细胞，尤其是血管内皮细胞衰老具有明显的促进作用。然后通过在其他类型的血管相关细胞模型中验证miR-92b*，获取过表达miR-92b*时其他衰老相关分子或表型的改变现象，确定了miR-92b*具有促进血管细胞衰老的作用。进一步地，本发明实施例确定了RNASEK基因为miR-92b*的下游靶基因，过表达RNASEK能够有效抑制miR-92b*诱发的细胞衰老过程，进而能够有效减缓血管细胞衰老。

第三方面，本发明实施例提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述的分离的RNASEK基因。

通过提供含有上述分离的RNASEK基因的表达载体，使其过表达RNASEK基因，进而能够有效减缓血管细胞衰老。本领域技术人员可以理解的是，该表达载体可以为纳米颗粒、脂质体、胆固醇、壳聚糖及病毒等。

第四方面，本发明实施例提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：治疗有效量的分离的RNASEK基因或表达载体；以及药学上可接受的赋形剂。

本发明实施例提供的药物组合物以RNASEK基因或含有RNASEK基因的表达载体作为活性物质，该药物组合物能够有效预防并减缓血管细胞，尤其是血管内皮细胞衰老。

其中，上述“治疗有效量”是指对人或动物体产生功能或活性，且可被人或动物所接受的量。上述的“药学上可接受的赋形剂”指的是适用于人活动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的赋形剂。该赋形剂可以选自本领域常见的赋形剂类型，本发明实施例在此并不对其作具体的限定。

进一步地，该药物组合物的剂型可以选自溶液剂、悬液剂、干粉剂、乳剂、控制释放剂或持续释放制剂。该药物组合物的给药方式可以选自注射给药(例如，静脉注射、关节腔局部注射或肌肉注射等)或经口给药。

进一步地，作为优选，该药物组合物还包括miR-92b*的抑制剂。

由上述可知，通过抑制miR-92b*的表达能够有效减缓血管细胞衰老。并且，miR-92b*抑制剂具有本领域公知含义。miR-92b*抑制剂的设计和制备方法也为本领域所公知。miR-92b*抑制剂可以包括拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可降低miR-92b*的活性及稳定性、(在细胞中)特异性抑制miR-92b*的表达、抑制miR-92b*对靶基因的调控作用、减少miR-92b*的有效作用时间或者特异性抑制miR-92b*的转录和加工的物质均可以用于本发明，作为用于抗血管衰老，尤其是抗血管的内皮细胞衰老的有效物质。

举例来说，本领域技术可以根据miR-92b*设计其反义RNA，即获取miR-92b*的反义核酸，亦即该miR-92b*抑制剂可以为miR-92b*的反义核酸，该miR-92b*的反义核酸能够有效抑制miR-92b*的表达。或者，本领域技术人员可以将miR-92b*与特定的物质接触，检测miR-92b*的表达，并选择特异抑制miR-92b*表达的候选物质，以得到miR-92b*抑制剂，亦即该miR-92b*抑制剂可以为特异性结合miR-92b*的蛋白。或者，该miR-92b*抑制剂可以为特异性干扰miR-92b*基因表达、加工的小干扰分子，例如为特异性干扰miR-92b*基因表达及加工的siRNA或者特异性干扰miR-92b*基因表达及加工的miRNA。

进一步地，上述miR-92b*抑制剂优选为miR-92b*的反义核酸，或者是其序列与该miR-92b*的反义核酸的序列具有80％，优选85％以上的相同性的反义核酸，该类反义核酸均具有与miR-92b*的反义核酸相同的功能。

更进一步地，第一方面，上述“反义核酸”还包括经修饰的反义核酸，该修饰基本不改变反义核酸的活性，更佳地，该修饰可以提高该反义核酸的活性、稳定性和治疗效果。上述对反义核酸的修饰至少包括甲氧基化修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、硫代修饰等。第二方面，上述“反义核酸”还包括其所含有的核苷酸被部分地替换或增减后的反义核酸，该部分地替换或增减基本不改变反义核酸的活性，更佳地，该部分地替换或增减可以提高该反义核酸的活性、稳定性和治疗效果。

miR-92b*为本领域公知的miRNA小分子，其对于调控RNA是有用的。miR-92b*的序列如下所示：AGGGACGGGACGCGGUGCAGUG，其可以来自被分离细胞或者通过人工合成的方式获得。

可以理解的是，在得知了miR-92b*的序列后，本领域技术人员可以容易地获得miR-92b*的反义互补序列，该miR-92b*的反义互补序列如下所示：CACTGCACCGCGTCCCGTCCCT。亦即，根据miR-92b*的特性，本领域技术人员可以容易地获得miR-92b*及多种miR-92b*抑制剂。

进一步地，上述miR-92b*的下游靶标基因为RNASEK。由于miRNA的作用是下调靶标基因的表达，所以，miR-92b*通过调节RNASEK基因的表达，使RNASEK表达下调来促进血管细胞的衰老。

作为优选，该药物组合物还包括RNASEK基因表达的正向调节剂。可见，通过该正向调节剂来促进RNASEK基因表达，进而赋予该药物组合物抑制血管衰老的效果。

第五方面，本发明实施例提供了一种体外调控组织或细胞中RNASEK基因表达的方法，所述方法包括：

抑制该组织或细胞中miR-92b*的表达，和/或

对RNASEK基因中的miR-92b*结合位点实施同义突变；和/或

施加上述分离的RNASEK基因或表达载体。

通过上述方法来体外调控组织或细胞中RNASEK基因，使其过表达，进而达到抑制血管细胞衰老的目的。

以下将通过具体的实施例进一步地描述本发明。

在以下具体实施例中未注明条件者，均按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商及规格者均为可以通过市购获得的常规产品。

在以下各实施例中，各阴性对照组中的HUVEC细胞或HCAEC细胞或HASMC细胞均为转染scramble miRNA的HUVEC细胞或HCAEC细胞或HASMC细胞，其中，该scramble为市购产品，具体来说，针对miRNA时，其所对应的scramble(即microRNA mimics N.C)的序列为UUGUACUACACAAAAGUACUG。

实施例1 系统筛选促进血管内皮细胞衰老的miRNA

1、本实施例中所使用的材料如下所示：

1.1细胞

用于本实施例的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein EndothelialCells，HUVEC)均为发明人实验室内自行分离。

1.2主要试剂

1.2.1细胞分离培养

内皮细胞培养基(Endothelial Cell Medium，ECM)(Sciencell公司)；

胰酶(Amresco公司)；

EDTA Na₂(北京化工厂)；

1.2.2细胞转染

Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(Invitrogen公司)；

1.2.3β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)检测

衰老相关β-gal检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

2、本实施例的具体操作步骤如下：

2.1 HUVEC细胞分离培养

1)将取来的实验用脐带迅速移入洁净操作台内，无菌条件下将其放入提前盛有预热D-hanks液的培养皿中，洗净。

2)剪去有钳夹痕及血肿的部分，挤出脐带中的血，用剪刀修齐两断面，分成20cm的一段。

3)找出脐静脉，用带平针头的注射器分别从两端插入脐静脉，血管钳固定。

4)再用预热的D-hanks液冲洗3次，将血迹完全冲洗干净。

5)从冲洗的针头中注入0.2％胶原酶II(在磷酸盐缓冲液(Phosphate BufferedSaline，PBS)中)使其充盈。取出针头，用止血钳夹住注入端，移入无菌烧杯中，置于37℃培养箱中孵育13min。

6)取出，松开注入端的血管钳，收集脐静脉内的消化液于离心管中，然后注入D-hanks液，再次冲洗管腔，将消化液与冲洗液一并收集于离心管，1000r/min，离心5min。

7)弃上清，加入ECM培养基(含5％胎牛血清)置于5％CO₂，37℃培养箱中培养，24h后更换培养基中的培养液去除未贴壁的细胞，然后每隔24h半定量换液1次至细胞生长铺满瓶底。

2.2 lipofectamine 2000转染HUVEC细胞

从现有的miRNA库中挑选约210条在人和大鼠中保守的miRNA，利用高通量的筛选系统，按照lipofectamine 2000转染试剂说明书，分别将上述miRNA转染HUVEC细胞，转染后5天，对HUVEC细胞进行衰老相关的β-gal检测。

2.3β-gal染色检测

1)吸除细胞培养液，用PBS或Hank′s平衡盐溶液(Hank′s Balanced SaltSolution，HBSS)洗涤1次，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。

2)吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟。

3)按照说明书配置染色工作液

3)吸除PBS，每孔加入1毫升染色工作液，放于37度进行β-gal染色。其中，β-gal染色越深，说明HUVEC细胞衰老程度越大。本实施例以miR-34a(促进内皮细胞衰老的已知miRNA)作为阳性对照。

3、实验结果

如附图1所示，转染miR-92b*后的HUVEC细胞，即miR-92b*转染组与阴性对照组(转染scramble miRNA的HUVEC细胞)相比，β-gal染色阳性细胞(见图1中的蓝色点状物)的比例明显增加，具有明显的β-gal深染；miR-92b*转染组与阳性对照组(即miR-34a转染组)相比，同样具有了类似的较深的β-gal染色。另外，由于高通量的筛选可能会有较高的假阳性，发明人在上述HUVEC细胞模型中单独进行了miR-92b*的转染，结果发现转染miR-92b*后的HUVEC细胞同样具有与前述实验一致的β-gal深染。可见，miR-92b*对HUVEC细胞的衰老具有明显的促进作用。

实施例2 在其他类型的血管相关细胞模型中验证miR-92b＊

由于内皮细胞具有很强的异质性，不同血管的内皮细胞特性可能完全不同。因此，发明人又分别选择了人冠状动脉内皮细胞(Human Coronary Artery Endothelial Cells，HCAEC)和人主动脉平滑肌细胞(Human Aortic Smooth Muscle Cells，HASMC)重复了上述如实施例1所述的实验。

除了所使用的HCAEC细胞和HASMC细胞均购于美国ScienCell公司，和用于培养上述HASMC的DMEM(dulbecco′smodified eagle medium)培养基购自Gibco公司之外，本实施例中所使用的主要实验试剂和试验方法均与实施例1中相同。在此不再赘述。

实验结果如下：

如图2所示，转染miR-92b*后的HCAEC细胞，即miR-92b*转染组与阴性对照组(转染scramble miRNA的HCAEC细胞)相比，β-gal染色阳性细胞(见图2中的蓝色点状物)的比例明显增加，具有明显的β-gal深染；miR-92b*转染组与阳性对照组(即miR-34a转染组)相比，同样具有了类似的较深的β-gal染色。可见，miR-92b*对HCAEC细胞的衰老具有明显的促进作用。

如图3所示，转染miR-92b*后的HASMC细胞，即miR-92b*转染组与阴性对照组(转染scramble miRNA的HASMC细胞)相比，β-gal染色阳性细胞(见图3中的蓝色点状物)的比例明显增加，具有明显的β-gal深染；miR-92b*转染组与阳性对照组(即miR-34a转染组)相比，同样具有了类似的较深的β-gal染色。可见，miR-92b*对HASMC细胞的衰老具有明显的促进作用。

实施例3 过表达miR-92b＊时其他衰老相关分子或表型的改变

由于β-gal染色只是衰老细胞的特征之一。为了进一步确认miR-92b*与血管衰老相关，发明人在HUVEC细胞模型上检测了miR-92b*对于其他衰老相关分子或表型的影响，同时在相同的操作条件下以过表达miR-34a作为阳性对照。

本实施中所使用的HUVEC细胞与主要试剂与实施例1相同。

本实施例所使用的主要试剂如下：

三羟甲基氨基甲烷(Tris(Hydroxymethyl)aminomethane，Tris)(购自Sigma-Aldrich)；

十二烷基硫酸钠英文名称(sodium dodecyl sulfate sodium salt，SDS)(购自Sigma-Aldrich)；

N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(N，N，N′，N′-Tetramethylethylenediamine，TEMED)(购自Sigma-Aldrich)；

蛋白酶抑制剂(购自Sigma-Aldrich)；

聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(购自Millipore)；

丙烯酰胺(北京化工厂)；

甲叉双丙烯酰胺(北京化工厂)；

过硫酸铵(北京化工厂)；

甲醇(北京化工厂)；

碘化丙啶(北京化工厂)；

具体操作步骤如下：

1、蛋白质印迹法(Western blot)

1.1 HUVEC细胞总蛋白提取

1)弃去培养基，用PBS洗转染后48小时后的HUVEC细胞2-3次，置于冰上。加入1mL预冷的PBS，用细胞刮刀将细胞刮下，将含有细胞的PBS全部洗入1.5mL离心管(EP管)中，13000rpm离心5分钟，弃去上清。2)沉淀加入60ul PBS(含1％蛋白酶抑制剂)及15ul蛋白裂解液(5×)重悬混匀，60％功率对蛋白进行3次超声，每次10秒，相邻两次间隔10秒。超声后-20度过夜裂解。

3)第二天，13000rpm 4度离心10分钟，吸取上清存入新的EP管。利用BCA试剂盒对蛋白浓度进行定量后，将蛋白存于-20度。

1.2 SDS-PAGE蛋白电泳

1)取30ug上述制备的蛋白，加入6ul 5×蛋白marker，用PBS补齐至30ul。混匀后煮沸5分钟，立即插于冰上冷却。

2)玻璃板间加入10％分离胶(其中该10％分离胶的具体成分如下：ddH₂O4mL、1.5MTris-HCl(pH>2O3.05mL、0.5M>

3)将电泳装置置于电泳槽中，加入1×running buffer，拔出梳子上样，100V定压电泳15-20分钟至蛋白marker泳动至分离胶与浓缩胶交界，提高电压至150V，定压电泳1小时。

1.3转膜及封闭

在1×transfer buffer中将蛋白胶上的蛋白利用湿转法，恒流250mA 2小时转到NC膜上，用5％BSA在脱色摇床上孵育p16和p21蛋白抗体1小时。

1.4杂交及成像

用5％BSA稀释一抗，4度过夜孵育NC膜。第二天用TBST缓冲液洗膜3次，每次15分钟。用TBST稀释二抗，常温孵育1小时，用TBST洗膜3次，每次15分钟。利用Odyssey(荧光发光)成像。

其中，该Western blot中以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)作为内参。

2、流式细胞术测定细胞周期

1)将需要检测细胞周期的细胞(每个样品至少2×10⁶个细胞)用胰酶消化，并用PBS洗涤两次，加入冰上预冷的75％乙醇固定细胞，4度至少24小时，7天内用流式细胞仪检测细胞周期。

2)检测前，用PBS洗涤细胞2次，重悬于1mL含有100ug/mL RNA酶PBS中，37度孵育1小时，碘化丙啶(50ug/mL)避光染色20分钟。

3)流式细胞仪检测各期DNA含量(激发波长：488nm，发射波长：610nm)，分析各样品细胞周期的分布。

实验结果如下所示：

实验结果1：

如图4所示，与阴性对照组(转染scramble miRNA的HUVEC细胞)相比，miR-92b*组(过表达miR-92b*)使HUVEC细胞中的p21蛋白水平明显升高，但p16蛋白分子的表达基本不变；且miR-92b*组(过表达miR-92b*)与阳性对照组(过表达miR-34a)中的HUVEC细胞中p21和p16蛋白水平基本一致。可见，miR-92b*可以明显引起p21蛋白表达升高，从而参与了HUVEC细胞衰老过程。

实验结果2：

通过使用流式细胞检测仪检测处在不同细胞周期的细胞数量，重复三次，取平均值。如图5所示，与阴性对照组(转染scramble miRNA的HUVEC细胞)相比，在细胞周期上，miR-92b*组(过表达miR-92b*)使HUVEC细胞产生G0/G1期阻滞现象。可见，miR-92b*可以明显引起细胞周期阻滞，从而参与了HUVEC细胞衰老过程。其中，图5中的星号“★”表示t检验P值小于0.05，图5中的纵轴表示G0/G1期细胞占细胞总数的百分比。

实施例4 鉴定miR-92b＊的下游靶标分子

在确定了miR-92b*促进血管细胞衰老的作用之后，发明人进一步确定miR-92b*的下游靶标基因分子。2013年，Aleksandra Helwak等人通过改进的CLIP-seq技术找到了miR-92b*的13个下游靶标基因，包括RNASEK、SMAD4B、DLST、CACNG8、ACOX1、HIST1H2AJ、HIST1H2BO、KIAA1671、NDE1、DDT、GPI、SRGAP1、USP6NL。发明人在此基础上，采用双荧光素酶报告系统逐个检测了miR-92b*对上述各靶标分子的调控作用，以筛选与miR-92b*促衰老相关的miR-92b*的下游靶标分子。

本实施例中所使用的实验材料如下：

本实施例具体操作步骤如下：

1、双荧光素酶报告载体的构建

psiCHECK-2载体是专门为定量检测miRNA及其靶标分子所设计的载体。将所测试分子的miRNA可能结合位点连接在荧光素酶之后；此时，当所测试的分子是miRNA的靶标分子时，转录的荧光素酶mRNA将被降解，无发光反应；反之，转录的荧光素酶mRNA将被翻译为荧光素酶，参与发光反应。因此，可以通过检测有无荧光的产生来鉴定miRNA的靶标分子。

1.1引物设计

1.1.1 13个miR-92b*候选靶标分子的报告基因引物设计，其设计路线如表1所示：

表1

1.1.2 RNASEK报告基因突变引物，其设计路线见表2

表2

1.2普通PCR反应

采用50ul的反应体系进行连接反应。反应体系中含有5ul的10×PCR buffer、0.2mM的dNTP、0.2uM的PCR正反向引物和适量的模板，以及2-5U的pfu DNA polymerase。PCR反应中的退火温度和延伸时间根据实际情况进行调整。PCR产物按照博迈德多功能DNA回收试剂盒说明书进行DNA回收。

1.3 DNA限制性内切酶反应及片段回收

根据质粒构建的需要选择适当的酶切位点进行酶切。按照NEB内切酶附带的说明书进行DNA酶切。按照博迈德多功能DNA回收试剂盒说明书进行DNA回收。

1.4 DNA连接反应

采用20ul的反应体系进行连接反应。反应体系中含有2ul的10×T4DNA连接酶(ligase)buffer、1-2U的T4DNA ligase、100ng的载体DNA和3-10倍与载体DNA摩尔数的插入片段DNA。16℃反应12个小时。

1.5外源DNA的转化

取100ul感受态细胞，加入10ng质粒DNA或者10ul连接反应产物，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，冰浴20分钟，加入100ul LB培养基，37℃活化40分钟。最后涂布在含有特定抗生素的培养板，37℃培养过夜。

1.6质粒DNA的提取

按照天根公司质粒小提试剂盒说明书提取质粒。

2、一步法定点突变PCR

采用50ul的反应体系进行连接反应。反应体系中含有5ul的10×PCR buffer，0.4mM的dNTP，0.2uM的PCR正反向引物和100ng的质粒模板(含有甲基化的位点)，以及2-5U的pfu DNA聚合酶(polymerase)。PCR反应中的退火温度根据引物序列进行调整；延伸时间由质粒长度决定，反应循环20圈。反应结束后直接在PCR产物中加入20U的DpnI内切酶消化2小时。消化后的产物可直接转化涂板。

3、双荧光素酶报告基因系统的检测

3.1裂解细胞

1)取适量5×Passive Lysis Buffer(PLB)，用ddH2O稀释至1×PLB并混匀。

2)吸取培养皿中的培养液，加入适量的1×PBS轻轻洗涤细胞后吸弃。

3)培养板中每孔加入100ul的1×PLB，混匀。培养板可在振荡器上震荡5-10分钟，然后将细胞悬液移入1.5ml离心管中。10000rpm离心1分钟，取上清做发光测定。

3.2测定荧光值

取待测样品20ul加入酶标板中，先加入50ul Firefly Luciferase Substrate(萤火虫荧光素酶底物)，测定Firefly荧光值。再加入50ul Renilla Luciferase Substrate(海肾荧光素酶底物)，测定Renilla荧光值。Renilla荧光值与Firefly荧光值的比值即为发光单位(RLU)。

上述实验重复四次，取平均值。

实验结果如下：

如附图6所示，在上述13个报告基因中，只有ACOX1、NDE1和RNASEK这三个基因对于转染scramble miRNA(即N.C，其作为阴性对照组)和转染miR-92b*(即miR-92b*组)后的发光单位存在明显的差异(P值小于0.05且倍数变化(fold change)大于1.2或小于0.8)；而且在这三种基因中，只有RNASEK基因受miR-92b*的调控而表达下调。考虑到microRNA经典的作用方式还是下调靶基因的表达，因此，本实施例确定RNASEK是miR-92b*的下游靶基因。

进一步地，本实施例还通过序列比对预测出RNASEK基因上3’UTR区域的microRNA结合位点，并对该结合位点进行了一个至三个的碱基突变。该碱基突变情况具体如下所示：

miR-92b* 3′-GUGACGUGGCGCAGGGCAGGGA-5′

RNASEK mRNA⁶²¹5′-GTGTCACCCAGGTCGCGTCCCA-3′

mutation-1 ⁶²¹5′-GTGTCACCCAGGTGGCGTCCCA-3′

mutation-2 ⁶²¹5′-GTGTCACCCAGGTGGCCTCCCA-3′

mutation-3 ⁶²¹5′-GTGTCACCCAGGTGGCCTCGCA-3′

结果如图7所示，在破坏了RNASEK基因的结合位点后，miR-92b*对RNASEK基因的调控作用也随之消失。这进一步说明了RNASEK基因为miR-92b*的下游靶标基因。

其中，在图6和图7中，纵轴均表示归一化的发光单位(RLU)，星号“★”表示t检验P值小于0.05，且fold change大于1.2或小于0.8。在图7中，WT表示未经碱基突变的野生型RNASEK，mutation-1表示RNASEK的microRNA结合位点存在一个碱基突变，mutation-2表示RNASEK的microRNA结合位点存在两个碱基突变，mutation-3表示RNASEK的microRNA结合位点存在三个碱基突变。

实施例5 验证RNASEK基因与血管细胞衰老之间的关系

在已经确定RNASEK基因为miR-92b*的下游靶标基因的基础上，本实施例对RNASEK基因与血管细胞衰老之间的关系进行了验证。

本实施例所用的实验材料如下：

siRNA合成 (上海吉玛制药技术有限公司)；

衰老相关β-gal检测试剂盒 (碧云天生物技术研究所)；

Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；

本实施例的操作步骤如下：

1、RNASEK的siRNA的设计，其设计路线见表3：

表3

实验结果如下：

实验结果1：

结果表明，RNASEK-siRNA-1组(转染了RNASEK-siRNA-1的细胞)和RNASEK-siRNA-2组(转染了RNASEK-siRNA-2的细胞)中，上述RNASEK-siRNA-1和RNASEK-siRNA-2能够在HUVEC细胞中有效敲低RNASEK的表达。如图8所示，与转染scramble siRNA的HUVEC细胞和HASMC细胞(即N.C组，其作为阴性对照)相比，RNASEK-siRNA-1组和RNASEK-siRNA-2组中有明显的β-gal深染，即β-gal染色阳性细胞(图8中的蓝色点状物)的比例增加。以上结果证实了RNASEK基因的表达下调能够促进HUVEC细胞和HASMC细胞衰老。

实验结果2：

发明人构建了RNASEK过表达腺病毒和作为对照的GFP病毒，并与miR-92b*共同转染HUVEC细胞和HASMC细胞。如图9所示，与N.C+Adv-GFP组(N.C组，其作为阴性对照)和miR-92b*+Adv-GFP组(过表达miR-92b*)相比，miR-92b*+Adv-RNASEK组(同时过表达miR-92b*和RNASEK)中HUVEC细胞和HASMC细胞仅仅具有非常浅的β-gal染色，即β-gal染色阳性细胞(图9中的蓝色点状物)的比例减少。由此可见，过表达RNASEK能够有效抑制miR-92b*诱发的细胞衰老过程，同时证明了miR-92b*通过调控RNASEK基因的表达下调来促进血管细胞衰老。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。