一种利用藤黄球菌酶制剂强化微生物处理高盐含酚废水的方法

摘要

本发明公开了一种利用藤黄球菌酶制剂强化微生物处理高盐含酚废水的方法，该方法先采用酶制剂对活性污泥进行驯化，然后联合酶制剂对高盐含酚废水进行处理。酶制剂可加快活性污泥驯化速度、提高活性污泥性能，从而强化微生物处理废水的效能，延长膜使用寿命，具体为：活性污泥对盐的耐受浓度由100g/L提高至180g/L，对酚的耐受浓度由2500mg/L提高至3500mg/L，活性污泥中放线菌门和拟杆菌门的菌群相对丰度提高，MBR中苯酚去解率提高40‑60％，膜污染周期延长8‑10d。因此，藤黄球菌酶制剂不仅可以用于活性污泥的快速驯化，亦可用于提高废水生物处理系统中功能菌群的活性，延长膜使用寿命，为促进微生物技术结合MBR处理复杂工业废水的推广应用提供一种安全、廉价、高效的方法。

说明书

技术领域

本发明属于工业废水处理领域，尤其涉及一种利用藤黄球菌酶制剂强化微生物处理高盐含酚废水的方法。

背景技术

酚类物质属于芳香类化合物，主要排放种类包括苯酚、氯酚和对硝基苯酚，是化工生产中产生的一种难以降解的有毒有害污染物。由于酚类化合物种类繁多、难降解并具有“三致”效应，已被列入129种优先控制的污染物及65种有毒污染物之一。近年来，随着石油化工、制药、建材、农药、造纸、煤气、电子、纺织、染料、塑料和焦化等工业的迅速发展，含酚废水排放量大大增加，逐渐成为当前水体的主要污染源之一。同时，含酚废水成分非常复杂，除含有难降解有机污染外，常含有大量的盐分(Na⁺、Cl^-、Ca⁺等)，当总溶解固形物含量在3.5％以上的含酚废水为高盐含酚废水。这种含高盐、难降解有机污染物的工业废水不仅对环境造成严重污染，而且对人体、水生生物及农作物的危害日益加剧，严重破坏生态平衡。长期以来，高盐含酚废水的治理是污水处理领域亟待解决的一个难题。

虽然基于物理和化学原理的含酚废水处理技术，如吸附法、萃取法、膜分离法、高级氧化法等已得到一定程度的应用，但因不同废水中酚种类和含量具有相当宽的范围，具体应用时存在低效、成本高、二次污染等问题而很难达到预期的处理效果。由于微生物降解治理技术具有安全、高效、经济等特点而成为高盐含酚废水无害化处理的研究热点。但由于含酚废水中含有大量难生物降解且有生物毒性的化合物，可抑制微生物的生长存活，如苯酚对生物处理系统中脱氮除磷等相关功能菌产生了显著的抑制作用，同时含酚废水中的高含量盐抑制了生物处理系统中的微生物活性，导致传统的生物处理法很难达到治理目标。研究发现，传统分离方法能够培养的微生物数量仅占活性污泥微生物总量的1％-15％，且在处理含酚废水的工业装置中含有丰富多样的苯酚羟化酶基因类型，而利用传统的富集培养方法并不能获得编码低亲和常数的降酚菌。大量的潜在功能菌群因处于活的但非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态而未被研究。另外，大多数由实验室分离获得的高效降解菌株或富集培养体，由于受环境压力胁迫进入了VBNC状态，从而在实际废水处理的生物系统中表现出较低的降解活性。如何提高高盐含酚废水的生物处理系统中的微生物活性，以发挥其最优的效能是目前生物处理高盐含酚废水亟待解决的问题。

藤黄球菌复苏促进因子(resuscitation-promoting factor,Rpf)的发现被认为是复苏培养VBNC状态菌的最重要突破。藤黄球菌Rpf，是一种分泌蛋白，可通过自分泌或旁分泌方式分泌，其分子质量为16-17kDa。Rpf的作用机制普遍接受的是Rpf是一种溶菌酶具有肽聚糖溶解酶活性，在细胞壁溶解过程中发挥重要作用。它不仅能复苏促进近缘高G+C的革兰氏阳性(G+)菌的生长，对低G+C的G+菌及部分革兰氏阴性(G-)菌也有较好的复苏促进功能。而且，藤黄球菌Rpf作为一种高效生物强化剂，在皮摩尔浓度即可使细菌的可培养数量增长100倍以上且能促进可培养细胞的生长，利用Rpf复苏促进废水生物处理系统中的潜在功能菌群具有重要意义。但是，Rpf蛋白提取和纯化复杂、成本相对较高等限制因素，需建立经济可行的生物强化方法。研究表明纯Rpf蛋白易失活，同时，在藤黄球菌上清液中分离出至少两种具有Rpf功能(溶菌酶活性)的蛋白，其分子量均大于Rpf蛋白，可知，藤黄球菌胞外分泌物中含有至少3种具有溶菌酶活性的蛋白。因此，利用藤黄球菌酶制剂不仅可以复苏促进耐盐降解酚菌群的活性，提高生物反应器的效能，也可以为培养筛选高效耐盐降解酚菌株提供更广的分离菌源。同时，为打破微生物处理技术的应用瓶颈提供新的思路。

发明内容

本发明的目的是针对现有高盐含酚废水的生物处理系统中存在的菌群活性低、生长速度慢、降解效率低的不足，提供一种利用藤黄球菌酶制剂强化微生物处理高盐含酚废水的方法。此方法具有安全、廉价、高效的特点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用藤黄球菌酶制剂强化微生物处理高盐含酚废水的方法，该方法包括：

(1)将藤黄球菌(Micrococcus luteus)接种于LMM培养基发酵培养，获得胞外分泌物，进一步制备活性为1-2U/mL的藤黄球菌酶制剂；

(2)将步骤(1)获得的酶制剂按体积分数为3-4％添加至以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中，对活性污泥进行驯化；

(3)将步骤(2)驯化后的污泥按照MLSS为1-2g/L的量接种至MBR中，并以体积分数0.5-1.0％加入酶制剂，处理含高盐含酚废水。

进一步地，所述步骤1具体为：

(1.1)将藤黄球菌接种于LMM培养基，30℃，160r/min培养24-36h，获得发酵种子液。取种子培养液按2-4％(v/v)的接种量接入LMM培养液中，30℃，160r/min培养48-72h，获得藤黄球菌发酵液；

所述LMM培养基的组成为：4.0g/L>4Cl，1.4g/L>2PO₄，0.005g/L生物素，0.02g/L>4，8.75g/L>4·5H₂O，0.785g/L>2·4H₂O，0.18g/L>4·7H₂O，0.029g/L>2MoO₄·2H₂O，0.089g/L>4·7H₂O)，pH为7.5；

(1.2)将步骤1.1所获得的发酵液离心(8000-10000r/min)10-15min去除菌体，经0.22μm过滤膜进行无菌过滤，获得藤黄球菌胞外分泌物；

(1.3)将胞外分泌物至30KDa超滤离心管，7500r/min离心10min，收集管内膜下部分的液体(液体1)，然后取液体1至10KDa超滤离心管，7500r/min离心10min，收集管内膜上部分的液体(液体2)，将固体硫酸铵加入液体2，使得固体硫酸铵的质量分数为饱和状态下的80％，冰水浴搅拌1h，8000r/min离心20min收集沉淀；然后再向沉淀中加入与液体2相同体积的磷酸盐缓冲液，至10KDa超滤离心管，7500r/min离心10min，收集管内膜上部分的液体，即为藤黄球菌酶制剂。

本发明与现有的强化微生物处理高盐含酚废水方法相比，其有益效果是：

1、本发明所用藤黄球菌酶制剂，具有成本低廉、操作简便、安全无毒、绿色环保等特点。

2、本发明利用藤黄球菌酶制剂可以实现耐盐降酚活性污泥的高效驯化，它不仅可以复苏活性污泥中潜在的功能菌群，也可以阻止功能菌群进入VBNC状态，从而缩短活性污泥驯化时间，并发挥活性污泥的最优耐盐降酚性能。

3、本发明中利用藤黄球菌酶制剂可以保持MBR中土著微生物的最优性能，缩短废水处理时间，减少膜污染，延长膜使用寿命，从而降低废水处理成本。

4、本发明中将藤黄球菌酶制剂添加至耐盐降酚活性污泥的驯化培养基中，通过与未添加酶制剂的对照组进行对比，表明藤黄球菌酶制剂能显著提高耐盐降酚活性污泥的驯化效率，促进耐盐降酚微生物的生长繁殖。

5、本发明中在活性污泥驯化阶段酶制剂的添加量为体积分数的3-4％，在废水处理的MBR中，其添加量仅为体积分数的0.5-1％，即可有效的提高活性污泥驯化及废水处理效率，充分体现出其具有快速性、可持续性、经济型、实用性等特征，极具推广应用价值。

6、本发明中的藤黄球菌酶制剂不仅可以用于快速驯化耐盐降酚菌群，提高微生物处理高盐含酚废水效能，亦可用于促进其它工业废水中功能菌群的复苏生长，为实现微生物技术应用于难降解有机废水及复合污染废水的生物处理，提供一种快速高效、安全环保、成本低廉方法。

综上所述，本发明符合绿色安全的环保理念，实现了强化微生物处理难降解及复合污染废水，充分有效发挥废水生物处理系统中土著微生物的降解性能，为促进微生物技术处理复杂工业废水的推广应用提供一种安全、廉价、高效的方法。

附图说明

图1是添加藤黄球菌酶制剂对活性污泥耐盐性能的影响图；

图2是添加藤黄球菌酶制剂对活性污泥耐酚性能的影响图。

具体实施方式

本发明一种利用藤黄球菌酶制剂强化微生物处理高盐含酚废水的方法，包括以下步骤：

1、藤黄球菌酶制剂的制备

藤黄球菌活化培养：所用的藤黄球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)可购于日本理化学研究所微生物菌种保藏中心。将LMM培养基(4.0g/L>4Cl，1.4g/L>2PO₄，0.005g/L生物素，0.02g/L>4，8.75g/L>4·5H₂O，0.785g/L>2·4H₂O，0.18g/L>4·7H₂O，0.029g/L>2MoO₄·2H₂O，0.089g/L>4·7H₂O)，pH为7.5)注入含有藤黄球菌粉末的安瓿瓶中，室温放置20min，用接种环划线至LMM固体平板。

藤黄球菌发酵培养：挑取LMM固体平板上的藤黄球菌菌苔1环接种至20mL LMM液体培养基的100mL三角瓶中，30℃，160r/min，培养32h。然后，取种子培养液按3％(v/v)的接种量接入LMM培养液中，30℃，160r/min培养52h，获得藤黄球菌发酵液。

藤黄球菌酶制剂的制备：将藤黄球菌发酵液离心(8000r/min，15min)去除菌体，经0.22μm过滤膜进行无菌过滤，获得的藤黄球菌胞外分泌物。取一定体积胞外分泌物至30KDa超滤离心管，7500r/min离心10min，收集管内膜下部分的液体(液体1)，然后取液体1至10KDa超滤离心管，7500r/min离心10min，收集管内膜上部分的液体(液体2)，将一定量固体硫酸铵加入液体2，使得固体硫酸铵的质量分数为饱和状态下的80％，冰水浴搅拌1h，8000r/min离心20min收集沉淀；然后再向沉淀中加入同液体2相同体积的磷酸盐缓冲液，至10KDa超滤离心管，7500r/min离心10min，收集管内膜上部分的液体，即为藤黄球菌酶制剂，保存至-20℃条件下备用。

2、藤黄球菌酶制剂活性的检测

葡萄糖胺标准曲线的绘制：分别取葡萄糖胺标准溶液(浓度50μg/ml)0、0.5、1.0、1.5、2.0mL至比色管中，分别加蒸馏水至5mL，再加乙酰丙酮溶液1mL溶液，置沸水浴反应25min，用冰迅速冷却后，再加入3mL无水乙醇及1mL对二甲氨基苯甲醛，强力振荡，20～25℃放置1h，以未加入葡萄糖胺标准溶液管为空白对照，用其他含量的葡萄糖胺标准溶液的A₅₂₇绘制标准曲线。所获得的葡萄糖胺标准曲线为Y＝0.247X-0.0418(R²＝0.970)。

藤黄球菌酶制剂活性的测定：将2mg肽聚糖分别加入15μL的藤黄球菌酶制剂(试验组)和蒸馏水(空白组)中，30℃，作用2h后，将两组分别移至10mL容量瓶中，加1.5mL浓度为6mol/mL的HCl，沸水浴中水解1h，冷却后用氢氧化钠中和至pH＝7.0，用水稀释至刻度；然后取2mL，加蒸馏水2mL，再加入乙酰丙酮1mL，置沸水浴中反应25min后，用冰迅速冷却；再加入3mL无水乙醇及1mL对二甲氨基苯甲醛，强力振荡，20～25℃放置1h，分别测定其试验组和空白组在A527处的吸光值分别为0.089和0.112，通过标准曲线计算出葡萄糖胺的含量分别为26.5μg和31.13μg，可知葡萄糖胺的减少量为4.63μg，经公式：酶活(U/mL)＝(样品稀释度×葡糖糖胺含量)/(反应时间×葡萄糖胺的摩尔质量×样品体积)＝(20×4.63)/(25×221.21×15×10^-3)＝1.116U/mL，获得藤黄球菌酶制剂的活性为1.116U/mL。

3、高效耐盐降酚活性污泥的驯化与培养

活性污泥驯化：将藤黄球菌酶制剂按体积分数为3％添加至以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中，获得处理组的驯化培养基，其中无机盐培养基的组成是：0.5g/L>2PO₄，0.5g/L>2HPO₄，0.2g/L>4，1g/L>4Cl，微量盐溶液10mL/L(4mg/L>3，28mg/LZnSO₄·5H₂O，0.02mg/L>4·5H₂O，4mg/L>3BO₃，4mg/L>4·5H₂O，4mg/L>2·6H₂O)，苯酚和NaCl浓度根据实验要求而定，pH为7.0。对照组同样采用以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基进行驯化，不添加酶制剂。

活性污泥驯化过程分为四个阶段：苯酚浓度按照200mg/L，500mg/L，1000mg/L，1500mg/L的梯度不断增加，同时同步提高盐度负荷，按照5g/L，10g/L，15g/L，30g/L的NaCl梯度递增，定期测定泥水上清液中的苯酚浓度并观察活性污泥絮体和颜色的变化。在不同驯化阶段，当苯酚去除率达到100％，活性污泥平衡2d后排出上清液，更换新鲜的培养基，提高酚浓度和盐度后进入下一阶段驯化。处理组和对照组分别驯化获得在30g/L盐度下可完全降解1500mg/L苯酚的活性污泥1号和2号所需时间分别为65d和76d。

4、藤黄球菌酶制剂对活性污泥耐盐与耐酚性能的影响

酶制剂对活性污泥耐盐性能的影响：将上述所驯化的两组活性污泥按照2g/L的接种量分别接种至含相同苯酚浓度(1500mg/L)，不同盐含量(20、60、100、140、180g/L)的合成废水中，30℃、160-180r/min，培养100h后，分别测定废水中的苯酚残留量，计算苯酚去除率。结果表明，采用酶制剂对污泥进行驯化，能显著提高活性污泥的耐盐性能，活性污泥对盐的耐受浓度由100g/L提高至180g/L，见图1。

酶制剂对活性污泥耐酚性能的影响：将上述所驯化的两组活性污泥按照2g/L的接种量分别接种至含相同盐浓度(30g/L)，不同苯酚浓度(1500、2000、2500、3000、3500、4000mg/L)的合成废水中，30℃、160-180r/min，培养100h后，分别测试废水中的苯酚残留量，计算苯酚去除率。结果表明，采用酶制剂对污泥进行驯化，能显著提高活性污泥的耐酚性能，活性污泥对酚的耐受浓度由2500mg/L提高至3500mg/L，见图2。

苯酚含量的测定：苯酚测定采用4-氨基安替比邻法：取100μL样品，分别加入100μL缓冲液、200μL4-氨基安替比邻溶液、200μL铁氰化钾溶液，最后定容至10mL并静置15min，在510nm处用紫外分光光度计测定吸光值。绘制标准曲线：分别精密量取苯酚标液5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0mL至50mL容量瓶中，加入1.0m L缓冲溶液(称取20g氯化铵NH4Cl溶于100mL氨水)，混匀，再依次加入4－氨基安替比林溶液2.0m L，铁氰化钾溶液2.0mL，重蒸水定容50mL，510nm波长下测定不同苯酚浓度的吸光度。所获得的苯酚标准曲线为Y＝0.1373X+0.0009(R²＝0.9998)。将所测吸光度带入此标准曲线即可获得苯酚浓度，从而计算苯酚的去除率。

5、藤黄球菌酶制剂对驯化活性污泥菌群结构的影响

将上述两组驯化活性污泥样品1号(添加酶制剂)和2号(未添加酶制剂)进行16SrRNA基因的高通量测序分析。活性污泥样品的DNA采用FastDNA^TM>

表1不同菌门的相对丰度

菌门(相对丰度％)原始污泥处理组-活性污泥对照组-活性污泥Proteobacteria77.9547.3959.56Bacteroidetes12.2742.0131.06Actinobacteria2.646.173.41Firmicutes4.391.602.11Spirochaetes0.650.730.92Tenericutes0.390.300.36Chrysiogenetes0.230.230.14Synergistetes0.200.190.10Saccharibacteria0.160.160.15Others1.121.222.19

6、酶制剂强化MBR处理高盐含酚废水的效能

将上述驯化活性污泥样品1号(添加酶制剂)和2号(未添加酶制剂)分别按照MLSS为1g/L的量接种至4组相同膜生物反应器(MBR)，处理组投加体积分数(v/v)为0.8％的藤黄球菌酶制剂，对照组不投加酶制剂，获得4套处理高盐含酚废水装置：

第1套：1号活性污泥+MBR+添加0.8％酶制剂；

第2套：1号活性污泥+MBR+未添加0.8％酶制剂；

第3套：2号活性污泥+MBR+添加0.8％酶制剂；

第4套：2号活性污泥+MBR+未添加0.8％酶制剂；

处理含30g/L NaCl、1000mg/L苯酚，COD为2450mg/L、氨氮为212.5mg/L的废水，控制温度为30℃，pH为8，HRT为24h，进水流速为6mL/min；

第1套出水苯酚浓度为0mg/L，COD为46mg/L，氨氮浓度为0.8mg/L；第2套出水苯酚浓度为56mg/L，COD为145mg/L，氨氮为7.2mg/L；第3套出水苯酚浓度为93mg/L，COD为237mg/L，氨氮为10.6mg/L；第4套出水苯酚浓度为124mg/L，COD为302mg/L，氨氮为13.7mg/L；且在最大跨膜压差20KPa范围内，第1套和第2套相比，TMP降低9KPa，第1套和第4套相比，TMP降低13KPa，第1套需要清洗膜的周期为25d，第2套为14d，第3套为11d，第4套为7d；结果表明酶制剂添加可明显减慢膜污染速度，延长膜使用寿命。由此可知利用藤黄球菌酶制剂强化MBR反应器处理高盐含酚废水的效果显著。

此外，在保证驯化污泥的接种量为1-2g/L，酶制剂的加入量为0.5-1.0vol％，即可实现高效的废水初稿处理能力。