一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法

摘要

本发明公开一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法，发现直接通过获得冻存脐血的总有核细胞数，并将其铺于人纤维黏连蛋白包被的培养皿中培养，即可获得内皮祖细胞；获得内皮祖细胞的方法高效、简便，无外源性培养物质便于细胞调整并可用于临床；可得到大量纯化的内皮祖细胞；使用本发明方法85%以上冻存脐血可以分离获得内皮祖细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及内皮祖细胞的分离技术领域，尤其涉及一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法。

背景技术

心血管疾病(cardiovascular disease ，CVDs)，包括动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞，在世界范围内是导致死亡的主要原因。血管内皮急性损伤是心血管疾病的病理基础，血管内皮的再生对血管修复起着至关重要的作用。内皮重建需要周围成熟的内皮细胞的迁移与增殖。然而，成熟的内皮细胞是一类终极分化细胞，其扩增能力低且受损内皮组织的修复能力有限。近年来，原位移植干细胞和祖细胞对损伤的组织起到了良好的治疗效果，凸显了干细胞疗法对缺血性心血管病的强大潜力。

内皮祖细胞EPCs （ Endothelial progenitor cells，EPCs）来源于骨髓，存在于骨髓、外周血、脐血，新研究表明在脂肪组织、心肌中也能发现 EPCs 的存在。EPCs是能够增殖、迁移、粘附并分化为血管内皮细胞潜能的一种原始细胞，参与出生后缺血组织的血管发生和血管损伤后的修复。流式细胞检测发现成人外周血中单个核细胞表达的CD34⁺细胞仅为脐血单个核细胞中CD34⁺细胞的1/10，因此脐血是体外分离获得EPCs细胞的最佳来源。较成人外周血来源的EPCs，脐血来源的EPCs细胞具有更强的分化能力与增殖能力。体内研究发现，外周血内皮祖细胞形成的新生血管稳定性差，3周后出现退化现象，然而脐血来源内皮祖细胞能够产生正常具有功能的新生血管，并能够持续存在至少4月。因此临床治疗中使用脐血来源的EPCs可能会获得更意想不到的治疗效果，移植后血管形成速率可能会更高。

世界范围内多个国家与地区均建立脐血库，截止日前共储存了几十万份冻存的脐血，旨在将来能够用于临床治疗。脐血被作为非恶性疾病、获得性或者遗传性骨髓衰竭综合征的治疗手段。目前公共脐血库利用率不足10%，为拓展脐血的临床应用，越来越多的学者开始关注脐血中内皮祖细胞在血管相关性疾病中的应用前景。

日前，内皮祖细胞临床应用治疗心脑血管病的仅限制于自体内皮祖细胞移植，即骨髓来源的内皮祖细胞。脐血来源的内皮祖细胞输注至具有正常骨髓功能的病人体内，为避免诱发严重的移植物抗宿主反应（graft-versus-hostdiseases，GVHDs)，需要进行HLA配型，而脐血库中冻存的脐血均具有详细的HLA分型信息，因此探索从异体冻存脐血中成功分离培养内皮祖细胞能够充分利用公共库脐血资源，具有巨大的市场需求及重要的临床意义。94%新鲜脐血中能够成功分离到内皮祖细胞，然而仅有约55%冻存脐血中能够分离到内皮祖细胞。

发明内容

为提高从冻存的脐血中分离EPCs的效率与纯度，以及体外扩增获得高纯度具有肢体缺血损伤修复功能性的EPCs，本发明提供了一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法。该方法高效、简便，可以利用脐血库丰富的冻存脐血资源，可得到大量纯化的内皮祖细胞。

本发明所提供的一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法，包括以下步骤：

（1）自液氮罐中迅速取出30~50ml冻存脐血，37℃复苏，将融化后的脐带血，转入离心管中，添加100ml含0.5%人血清白蛋白的PBS缓冲液，充分混匀，室温下1500rpm/min离心10min，升速9，降速7，弃上清，获得总有核细胞（TNCs）沉淀；

（2）将步骤（1）中TNCs沉淀用100ml含0.5%人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬后，室温下1000rpm/min离心5min，升速9，降速9，弃上清，重复两次，获得总有核细胞TNCs沉淀。

（3）将步骤（2）中的总有核细胞TNCs沉淀，用15ml EGM-2& Single Quots培养液重悬，获得总有核细胞悬液，接种至预先包被人纤维黏连蛋白的培养皿中，用内皮祖培养液培养，获得内皮祖细胞；

优选地，所述步骤（2）中内皮细胞培养液为为Lonza EGM-2 培养液添加10% FBS，即EGM-2& Single Quots培养液。

优选地，所述步骤（3）中内皮祖细胞培养液诱导培养方法：用内皮祖培养液培养，置于37℃、5%>2及饱和湿度的条件下，3天更换培养液一次，贴壁筛选培养2-3周，获得鹅卵石状内皮祖集落，细胞消解传代，扩增培养。

优选地，所述步骤（3）中内皮祖细胞培养至第4代次，可获得2×10⁸以上内皮祖细胞。

本发明的优点：1、可以利用脐血库丰富的冻存脐血资源；2、获得EPCs方法高效、简便，无外源性物质便于细胞调整并可用于临床；3、可得到大量纯化的内皮祖细胞；4、提高冻存脐血内皮祖细胞的分离效率，使用本发明方法85%以上冻存脐血可以分离获得EPCs；5、本发明所提供的冻存脐血中内皮祖细胞的分离培养方法中所使用的试剂及仪器均可由市场购得。

附图说明：

图1：分离获得的内皮祖细胞集落。A为培养2-3周后出现的内皮祖细胞集落；B为培养3-5周后内皮祖细胞集落生长状态；C为第一代内皮祖细胞生长状态。

图2：分离培养的第一代内皮祖细胞流式分析细胞表型。

图3：免疫荧光法测定内皮祖细胞标志性Marker的表达情况：CD34、CD133、VEGFR、v-WF检测均为阳性。

图4：分离获得的内皮祖细胞形成基质胶毛细管，该细胞能够形成毛细管样结构。

图5：分离获得的内皮祖细胞体外吸收低密度脂蛋白功能鉴定：如图所示，红色为标记的Dil-Ac-LDL，蓝色标记为细胞核，因此可以得出内皮祖细胞对低密度脂蛋白有较好的吸收作用。

具体实施方式：

本发明公开一种从冻存脐血中分离内皮祖细胞的方法，直接通过获得冻存脐血的总有核细胞数，并将其铺于人纤维黏连蛋白包被的培养皿中培养，即可获得内皮祖细胞，方法简单有效。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1冻存脐血EPCs的分离与培养

冻存脐血取自山东省脐血造血干细胞库，经检测合格的正式入库的脐血。

（1）自液氮罐中迅速取出一份（30-50ml）冻存脐血，置于37℃水浴锅中，边孵育边摇晃冻存袋，快速复苏，将融化后的脐血，转入250ml离心管中，并添加100ml含0.5%人血清白蛋白的预冷的PBS缓冲液，充分混匀，室温下1500rpm/min离心10min，升速9，降速7，弃上清，获得总有核细胞（TNCs）沉淀；

（2）将步骤（1）中TNCs沉淀用100ml含0.5%人血清白蛋白的预冷的PBS缓冲液重悬后，室温下1000rpm/min离心5min，升速9，降速9，弃上清，重复两次，获得总有核细胞TNCs沉淀，然后使用15ml EGM-2& Single Quots培养液重悬，获得总有核细胞悬液，计数，一份冻存脐血可获得共2-6×10⁸>

（3）将步骤（2）中的TNCs接种至预先包被人纤维黏连蛋白的培养皿中，用EGM-2&Single Quots培养液培养，该培养液中包含多种因子如rhEGF、rhFGF-B、VEGF、Herparin、R3-IGF-1等，置于37℃、5%>2及饱和湿度的条件下培养；

（4）培养3d后，将未贴壁细胞吸弃，添加新鲜EGM-2& Single Quots培养液培养，以后3天更换培养液一次；

（5）培养3周后，出现1~4个鹅卵石铺路石样内皮祖细胞集落（图1A），继续培养2周后，内皮祖细胞集落中心细胞，细胞间紧密接触，细胞沿边缘向外快速增殖（图1B），使用0.25%胰酶传代培养至T75培养瓶中，每个细胞集落细胞数目超过1-2×10⁵细胞，即一份冻存脐血可分离获得原代（P0）内皮祖细胞2-8×10⁵个EPCs细胞；

（6）第一代（P1）内皮祖细胞接种至T75培养瓶中，继续使用EGM-2& Single Quots培养液培养，每3天更换一次新鲜培养液，内皮祖细胞形态均一，分布均匀（图1C）。传代后培养5天，细胞密度接近90%，使用0.25%胰酶继续进行传代培养，每次传代比例为1:4，本发明方法分离获得的原代内皮祖细胞，培养之第4代（P4）次，可获得2×10⁸以上内皮祖细胞。

实施例2对比例：现有技术的冻存脐血EPCs的分离与培养

冻存脐血取自山东省脐血造血干细胞库，经检测合格的正式入库的脐血。

自液氮罐中迅速取出一份冻存脐血，37℃水浴锅快速复苏，边孵育边摇晃冻存袋，融化后的脐血与PBS 1:1混合均匀，取该混合液与Ficoll分离液1:1混合后梯度密度离心法离心（2000rpm/min，升速1，降速1，离心20min），吸取白膜层（单个核细胞）。

单个核细胞（MNCs）沉淀使用PBS缓冲液重悬后，1000rpm/min，离心5min，升速9，降速9，弃上清，共两次。最终获得单个核细胞MNCs，使用10ml EGM-2& Single Quots培养液重悬，计数，一份冻存脐血可获得共1-2×10^{7>MNCs，接种至预先包被人纤维黏连蛋白的培养皿中培养。}

使用EGM-2& Single Quots培养液培养，该培养液中包含多种因子如rhEGF、rhFGF-B、VEGF、Herparin、R³-IGF-1等，置于37℃、5%>2及饱和湿度的条件下培养。培养3d后，将未贴壁细胞吸弃，添加新鲜培养液培养，以后每3天换液一次。培养2-3周后，未出现或出现1-2个鹅卵石铺路石样内皮祖细胞集落,一般用该方法自冻存脐血中分离获得内皮祖细胞的成功率为55%左右。

与实施例2相比，本发明实施例1方法能够自冻存脐血中分离获得内皮祖细胞，收获量大，成功率高，85%以上冻存脐血可以分离获得EPCs。

实施案例3 内皮祖细胞表面抗原流式检测

采用流式细胞术对实施例1中培养的第一代内皮祖细胞（P1-EPCs）进行表型分析，Fitc标记的anti-CD31、PE标记的anti-CD144和anti-CD309以及显示干细胞特性的anti-CD34与细胞表面标志性Marker结合，结果如图2显示，所分离的 细胞CD31、CD34、CD144、CD309阳性率分别为93.88%、65.03%、88.69%、70.77%，分离获得的细胞确定为内皮祖细胞，具有干细胞特性。

实施案例4 内皮祖细胞表面抗原免疫荧光检测

为进一步鉴定实施例1中所分离培养的细胞为内皮祖细胞， CD34、CD133、v-WF以及VEGFR免疫荧光抗体对第一代内皮祖细胞特异性标志物进行免疫荧光检测，结果如图3所示，各标志物检测结果均为阳性，进一步说明分离培养的细胞为内皮祖细胞。

实施案例5 内皮祖细胞体外血管生成功能鉴定

将Matrigel matrix（基质胶）使用EGM-2& Single Quots培养液1:1稀释后，60μl/孔添加至96孔板中，避免气泡，37度包被2h。将实施例1中培养的内皮祖细胞使用0.25%胰酶消化并用PBS洗涤两次，获得细胞沉淀后，使用EGM-2& Single Quots培养液重悬，调整细胞浓度为2×10⁶/mL，取50μL细胞悬液，共1×10⁵细胞/孔接种于96孔板中，并加入30μL>2培养箱中培养6-8h后，在显微镜下，观察并拍照细胞是否形成毛细管结构。结果如图4所示，所分离的内皮祖细胞可形成基质胶毛细管。

实施案例6 内皮祖细胞释放VEGF因子功能鉴定

将实施例1中培养的内皮祖细胞使用0.25%胰酶消化并用PBS洗涤两次，获得细胞沉淀后，使用内皮祖培养液重悬，调整细胞浓度为5×10⁵/mL后接种至六孔板中，各孔加2mL，置于37℃，5%CO₂培养箱中过夜培养后，更换为>2培养箱中培养3d后收集培养基上清，利用VEGFR检测试剂盒检测该上清液中VEGFR含量，检测结果显示冻存脐血内皮祖细胞释放低浓度的VEGF35.89pg/ml，即每1×10⁶细胞释放70-80pgVEGF因子）。

实施案例7 内皮祖细胞体外吸收低密度脂蛋白功能鉴定

将实施例1中培养的内皮祖细胞使用0.25%胰酶消化并用PBS洗涤两次，获得细胞沉淀后，使用EGM-2& Single Quots培养液重悬，调整细胞浓度为2×10⁵/mL后接种至12孔板中，12孔板中放置盖玻片，各孔加1mL，置于37℃，5%CO₂培养箱中过夜培养。第二天，使用EGM-2&Single>2培养箱中培养4h后，收取盖玻片，置于4%多聚甲醛中，固定15分钟，PBS漂洗后，使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的mount溶液封片，显微镜下观察。如图5所示，显示红色荧光的为Dil-Ac-LDL的内皮祖细胞。说明内皮祖细胞在体外可以吸收低密度脂蛋白。