基于纳米磁珠的多酚类植物RNA的简化提取方法

摘要

基于纳米磁珠的多酚类植物RNA的简化提取方法，包括以下步骤，（1）、制取样品；（2）、细胞裂解；（3）、洗涤；然后重复洗涤步骤一次；（4）、解离。利用本发明的方法提取多酚类植物的总RNA回收率高，纯度高，片段完整，可以直接应用于后续检测。核酸提取时间较一般纳米磁珠提取更短，效率更高，操作简单，更容易实现自动化，所使用试剂环境友好，更安全。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于纳米磁珠的多酚类植物RNA的简化提取方法。

背景技术

RNA，即 Ribonucleic Acid，能够传递遗传信息，是调控蛋白质合成的重要媒介。任何基因功能的有效发挥均依赖于 RNA 的表达与调控，所以RNA 在分子生物学研究领域占有重要地位。从植物组织中提取到纯度高、完整性好的RNA是探究RNA调控机理的关键所在。高质量的 RNA 提取是进行分子生物学实验如cDNA （互补脱氧核糖核酸）文库的构建、荧光定量PCR检测、Northern 杂交等的重要前提。

目前，RNA 提取主要采用的是 Chomczynski 等提出的异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法，Trizol等方法，但在提取富含多酚类植物组织总RNA的过程中仍会被大量酚类物质所干扰。这些酚类物质通过苯酚、胍等都很难去除。酚类物质极易被氧化成醌类物质，在提取过程中与RNA不可逆转地结合，从而影响RNA的纯化。并且酚类物质残留在样品中易发生氧化产生深褐色的物质，所以使用传统方法提取的RNA往往带有很深的铁锈色，影响后续的分子实验。

常用的提取方法存在以下缺点：1.常规提取试剂中多含毒性较大的有机溶剂，对环境污染较大，且对操作人员的身心有一定影响；2.常规提取方法（非纳米磁珠法）操作耗时长，操作环境要求很高，稍不注意就会造成RNA的降解，功亏一篑；3.常规提取方法（非纳米磁珠法）提取样本之间质量差异较大，过程复杂，自动化程度低；4.目前常规的纳米磁珠法对对富含酚类的植物组织提取效率低，且通常采用两种洗液进行洗涤；5.目前常规的纳米磁珠法在洗脱后必须要将总RNA与磁珠分离后才能进行后续的荧光定量PCR反应。

发明内容

本发明为了解决现有技术中的不足之处，提供一种基于纳米磁珠的多酚类植物RNA的简化提取方法，该方法采用的试剂经过配方改良更适用于富含酚类的植物组织提取，使用范围更广泛；与两种洗液进行纯化的常规方式比较，本发明仅需一种洗液纯化，同时蛋白酶K的加入使纯化过程高效简便；洗脱后可以实现总RNA和磁珠不分离进行后续荧光定量PCR反应，使本发明的自动化程度更高；配方中不含酚氯仿等重污染的有机试剂，降低操作人员的不适心理和环境污染。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：基于纳米磁珠的多酚类植物RNA的简化提取方法，包括以下步骤，

（1）、制取样品：取0.2g多酚类植物的组织材料放入研钵中并加入过量液氮，迅速研磨成均匀的粉末，在研磨过程中，保证组织材料始终浸在液氮中；

（2）、细胞裂解：待液氮完全挥发之前，将材料转入1.5ml离心管中，依次添加300uL裂解液和20uL纳米磁珠，将混合溶液吸打混匀5次后25℃室温静置10min；

（3）、洗涤：转移1.5ml离心管至磁分离架上，静置1min后用移液枪弃上清液，然后撤掉磁分离架，添加洗液600uL，吸打混悬纳米磁珠5次，静置5min；

然后重复洗涤步骤一次；

（4）、解离：转移1.5ml离心管至磁分离架上，静置1min后用移液枪弃上清液，撤掉磁分离架，在离心管内添加65uL洗脱液，吸打混匀5次，80℃干浴 10min；然后在25℃室温状态下静置10min后加入反转录酶、Taq酶、引物和探针等进行后续的荧光定量PCR操作。

所述裂解液的PH值为6.5，裂解液由异硫氰酸胍、硼酸、牛血清白蛋白、硼氢化钠、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、乙二胺四乙酸和聚乙二醇辛基苯基醚混合而成；其中，高浓度盐包括以下成分：3-5M异硫氰酸胍、0.1-0.5M 硼酸、30-60mM 三羟甲基氨基甲烷、20-50mM氯化钠和20-50mM 乙二胺四乙酸；所述裂解液还包含以下成分：质量体积浓度0.1-0.5%牛血清白蛋白、0.1-0.6%硼氢化钠和2-5%聚乙二醇辛基苯基醚。

所述洗液的PH值为6.5，洗液由三羟甲基氨基甲烷、蛋白酶K、乙基苯基聚乙二醇和乙醇混合而成；所述洗液包含以下成分：30-50mM三羟甲基氨基甲烷、0.2-0.6mg/ml蛋白酶K、质量体积浓度0.3-0.8%乙基苯基聚乙二醇和50-70%乙醇。

所述洗脱液的PH值为8.8，洗脱液采用80-150mM三羟甲基氨基甲烷。

所述纳米磁珠的颗粒直径为200-500nm，纳米磁珠采用经过羟基包被的超顺磁性氧化硅纳米磁珠，纳米磁珠的浓度为10mg/mL。

采用上述技术方案，本发明主要采用四种原料：Lysis buffer(裂解液)、Washing(洗液)、RNase-buffer(洗脱液)和纳米磁珠。各原料中各组分的功能作用分别为：

1、裂解液

异硫氰酸胍能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的RNA酶；

硼酸可以与酚类化合物依靠氢键形成复合物,从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合；

牛血清白蛋白：原花色素类物质与牛血清白蛋白（BSA）间形成可溶性的或不溶性的复合物,减小了原花色素类物质与RNA 结合的机会,因此提高了RNA的产量；

硼氢化钠是一种可还原醌的还原剂,用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减,醌类化合物可被还原成多酚化合物；

三羟甲基氨基甲烷不仅起缓冲作用，还可防止RNA降解；

氯化钠维持核酸结构的稳定和提供缓冲反应环境；

乙二胺四乙酸抑制RNA酶的活性，防止RNA降解

聚乙二醇辛基苯基醚是一种非离子型表面活性剂。通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。

2、洗液

三羟甲基氨基甲烷不仅起缓冲作用，还可防止RNA降解；

蛋白酶K将蛋白质消化成小的片段，提高纯化效率同时可以抑制RNA酶的降解；

乙基苯基聚乙二醇与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定；

乙醇具有去除盐离子、残存的有机溶剂和水的作用。

3、洗脱液采用三羟甲基氨基甲烷，用于RNA的溶解和保存。

4、纳米磁珠与RNA形成RNA-磁珠复合体，有利于RNA的分离和纯化。

本方法针对富含酚类植物RNA提取中的问题进行配方改良，添加硼酸，牛血清白蛋白，硼氢化钠等试剂，可以有效减少植物组织中的酚、醌、原花色素、多糖等对提取过程的干扰，可以广泛应用于富含多酚多糖，醌等物质的植物组织的总RNA提取；蛋白酶K的加入，在抑制RNA酶的同时将大分子的蛋白质切割，使纯化效率大大提高；用时40min即可完成整个过程，操作时间短，大大降低提取过程中RNA降解的风险；结合纳米磁珠特性对提取配方和操作进行改进，操作过程简便，更适用于机械化、自动化操作；RNase-buffer将RNA洗脱以后，可不进行纳米磁珠分离，直接进行后续荧光定量PCR操作，提高试验效率；本发明所用的配方不含酚、氯仿等污染严重的有机试剂，配比单纯，大大消除了操作人员的不适心理和对环境的污染。

综上所述，利用本发明的方法提取多酚类植物的总RNA回收率高，纯度高，片段完整，可以直接应用于后续检测。核酸提取时间较一般纳米磁珠提取更短，效率更高，操作简单，更容易实现自动化，所使用试剂环境友好，更安全。

附图说明

图1中所示为葡萄果皮RNA提取液和阴性对照的WRKY基因进行荧光定量PCR结果示意图；

图2中所示为葡萄果皮WRKY基因PCR结果进行1%琼脂糖凝胶电泳示意图；

图3中所示为将烟草叶片RNA提取液进行1倍、10倍和100倍稀释后对Actin基因进行荧光定量PCR结果示意图。

具体实施方式

本发明的基于纳米磁珠的多酚类植物RNA的简化提取方法，包括以下步骤：

（1）、制取样品：取0.2g多酚类植物的组织材料放入预冷的研钵中并加入过量液氮，迅速研磨成均匀的粉末。在研磨过程中，保证组织材料始终浸在液氮中；

（2）、细胞裂解：待液氮完全挥发之前，将材料转入1.5ml离心管中，再依次添加300uL裂解液和20uL纳米磁珠，将混合溶液吸打混匀5次后25℃室温静置10min；

（3）、洗涤：转移1.5ml离心管到磁分离架上，静置1min后用移液枪弃上清液，然后撤掉磁分离架。再添加洗液 600uL，吸打混悬纳米磁珠5次，25℃室温静置5min；

然后重复洗涤步骤一次；

（4）、解离：转移1.5ml离心管至磁分离架上，静置1min后用移液枪弃上清液，撤掉磁分离架，在离心管内添加65uL洗脱液，吸打混匀5次后80℃干浴 10min；然后在25℃室温状态下静置10min后加入反转录酶、Taq酶、引物、探针等进行后续的荧光定量PCR操作。

所述裂解液的PH值为6.5，裂解液由异硫氰酸胍、硼酸、牛血清白蛋白、硼氢化钠、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、乙二胺四乙酸和聚乙二醇辛基苯基醚混合而成；其中，高浓度盐包括以下成分：3.5M异硫氰酸胍，0.1M 硼酸，50mM 三羟甲基氨基甲烷，30 mM氯化钠，30mM 乙二胺四乙酸；所述裂解液还包含以下成分：0.1%牛血清白蛋白，0.2%硼氢化钠，2%聚乙二醇辛基苯基醚。

所述的洗液的PH值为6.5，洗液由三羟甲基氨基甲烷、蛋白酶K、乙基苯基聚乙二醇和乙醇混合而成；所述洗液包含以下成分：50 mM三羟甲基氨基甲烷，0.5 mg/ml蛋白酶K，0.5%乙基苯基聚乙二醇，70%乙醇。

所述的洗脱液的PH值为8.8，洗脱液采100mM三羟甲基氨基甲烷。

所述的纳米磁珠的颗粒直径为300nm，纳米磁珠采用经过羟基包被的超顺磁性氧化硅纳米磁珠，纳米磁珠的浓度为10mg/mL。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将说明本发明的具体实施方式。显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以获得其他的实施方式。

案例1 以本发明方法提取葡萄果皮中的总RNA并扩增WRKY基因

包括以下步骤

（1）裂解与结合 取0.2g新鲜葡萄（赤霞珠）果皮放入液氮预冷的研钵中，快速研磨成均匀粉末，研磨过程中保证果皮始终浸在液氮中。在液氨完全挥发之前，将其转入液氮预冷的1.5ml离心管。再依次加入300uL裂解液和20uL纳米磁珠，将混合溶液吸打混匀5次后在25℃的室温静置10min。转移1.5ml离心管到磁分离架上，磁力分离1min。裂解分离出的葡萄果皮RNA与直径为300nm的纳米磁珠结合，纳米磁珠为经过羟基包被的超顺磁性氧化硅纳米磁珠，浓度为10mg/mL，在外部磁场的作用下，形成磁珠-核酸复合物；吸弃上清。

其中，裂解液中高浓度盐包括以下成分：3.5M异硫氰酸胍，0.1M 硼酸，50mM 三羟甲基氨基甲烷，30 mM氯化钠，30 mM 乙二胺四乙酸；所述裂解液还包含以下成分：0.1%牛血清白蛋白，0.2%硼氢化钠，2%聚乙二醇辛基苯基醚。

（2）洗涤 撤掉磁分离架后，再向离心管中添加洗液 600uL，吸打混悬纳米磁珠5次，静置5min后将离心管至磁分离架上，磁分离1min，吸弃上清，去除磁珠-核酸复合物上的杂质。重复上述操作步骤一次。

其中，洗涤缓冲液的成分为50 mM三羟甲基氨基甲烷，0.5 mg/ml蛋白酶K，0.5%乙基苯基聚乙二醇，70%乙醇。

（3）解离 转移1.5ml离心管至磁分离架上，静置1min后用移液枪弃上清液，撤掉磁分离架，向离心管中加入65uL洗脱液，然后吸打混匀5次，80℃干浴 10min；然后在25℃的常温状态下静置10min。后加入反转录酶、Taq酶、引物和探针等进行后续的荧光定量PCR操作。

（4）荧光定量PCR反应

本次试验所采用的PCR体系为： 65μLRNA提取液，8μL 10*RT-PCR Buffer，Taq酶0.25μL，MLV反转录酶0.05μL，上下游引物各0.25μL，探针0.125μL，dNTPs 0.5μL，超纯水5.575μL。其中，10*RT-PCR Buffer，Taq酶，MLV反转录酶均购自promega试剂公司。

WRKY基因（长度750bp）引物为：

WRKY-For:5'GCTAGGATCCCATGGATGGAAGATTCAAT3'

WRKY-Rev:>GGTACCTCAGCCCGTGGTCCCACAC3'

反转录程序为：

25℃ 10min，42 ℃50min，70 ℃10min

荧光定量PCR反应程序为：

50℃ 2min；95℃2min；95℃15s，52℃ 30s荧光，72℃ 25s ，40 Cycle

（5）实验结果

图1中所示为葡萄果皮RNA提取液和阴性对照的WRKY基因进行荧光定量PCR结果示意图。

图2中所示为葡萄果皮WRKY基因PCR结果进行1%琼脂糖凝胶电泳示意图。其中M为D2000>

（6）结果分析

从图1可以看出，阳性重复之间的扩增结果一致，阴性对照均未检出，说明本发明操作稳定且污染率较低。图2电泳结果目标条带清晰说明本方法提取的RNA质量较高。

案例2 将本发明方法提取烟草叶片的总RNA稀释为不同梯度扩增Actin基因

（1）提取步骤 取0.2g新鲜烟草叶片放入液氮预冷的研钵中，快速研磨成均匀粉末，研磨过程中保证叶片组织始终浸在液氮中。其余操作过程同案例1。将总RNA提取液稀释1倍，10倍和100倍后进行Actin基因的荧光定量PCR反应。

（2）荧光定量PCR反应

Actin引物序列为：

Actin-For:>

Actin-Rev:>

反转录程序：

25℃ 10min，42 ℃50min，70 ℃10min

荧光定量PCR反应程序为：

50℃ 2min；95℃2min；95℃15s，52℃ 30s荧光，72℃ 25s ，40 Cycle

（3）实验结果

图3中所示为将烟草叶片RNA提取液进行1倍、10倍和100倍稀释后对Actin基因进行荧光定量PCR结果示意图。

（4）结果分析

图3稀释1倍（未经稀释）的RNA扩增Actin基因的Ct值为27.55，稀释10倍和100倍的RNA扩增Actin基因的Ct值分别为32.29和37.64，具有比较均一的梯度。说明本发明方法过程较为稳定，总RNA纯度较高。

案例3 本发明与常规CTAB法和SDS法提取烟草叶片总RNA质量比较

（1）CTAB法操作步骤为：称取0.2g新鲜烟草叶片于液氮预冷的研钵中，加入液氮充分研磨成细粉末状，研磨中不断缓慢倒入液氮防止材料解冻；将研磨碎的材料移入预冷的1.5ml离心管中，加入600μl经65℃预热的CTAB提取液，立刻用力上下颠倒并涡旋震荡30s，于65℃水浴锅中温浴5min。

所用CTAB提取液包含以下成分：2%CTAB，0.1mol/L Tris-HCl(PH=8.0)，0.01mol/LNaCl，25mmol/L EDTA(PH=8.0)，使用前加入2%β-巯基乙醇。

冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋震荡1min使之充分混匀，室温10000r/min离心15min；取上清，重复氯仿/异戊醇抽提一次，取上清，用100μl 70%乙醇洗涤沉淀。沉淀微干后加入500μl SSTE缓冲液溶解沉淀，加入等体积氯仿/异戊醇再抽提2次；转移上清后加入0.25倍体积的异戊醇充分混匀后，于室温放置10min；4℃12000r/min离心10min，收集沉淀，用70%乙醇漂洗两次，重复上述离心；用一次性使用的洗头吸尽残存的乙醇，加50μlDEPC水溶解RNA。

所用SSTE缓冲液成分为：0.5% SDS，1mmol/L EDTA(PH=8.0)，1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl(PH=8.0)。

（2）SDS法所采用的步骤为：将0.2g烟草叶片液氮研磨成粉末，移入2ml离心管中，加入1ml提取缓冲液，室温下晃动10min；加入1/3体积5mol/L醋酸钾(PH=6.0)，冰上沉淀30min，4℃10000r/min离心15min；上清液转移到新离心管中，等体积酚/氯仿抽取，4℃10000r/min离心15min，重复此步；再用等体积氯仿抽提水相，4℃12000r/min离心15min；DEPC水溶解沉淀；用等体积的酚/氯仿抽提，4℃12000r/min离心25min；收集沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀2次，沉淀溶解于50μlDEPC水。

所用提取缓冲液成分为：0.1mol/LTris-HCL(PH=7.4)，0.5 mol/L NaCl，25 mol/LEDTA（PH=8.0），20g/L SDS，20g/LPVPP和2%β-巯基乙醇使用前加入

（3）本发明步骤方法参照案例1。在80℃干浴 10min后将1.5ml离心管置于磁分离架上1min，将总RNA提取液与磁珠分离后，上清转移至新的1.5ml离心管中，然后测定样品纯度。

（4）测定方式为：取3μlRNA溶液稀释至3ml，用紫外可见分光光度计测量A₂₃₀，A₂₆₀，A₂₈₀，并计算A₂₆₀/A₂₃₀，A₂₆₀/A₂₈₀的比值，确定其纯度，再计算回收率。

回收率计算公式：RNA得率（μg.g^-1.FW^-1）=（A₂₆₀*40*稀释倍数*原液体积）/提取样品质量（g）

（5）实验结果 表1为采用不同方法提取烟草组织叶片的RNA的纯度和得率

（6）结果分析

从表1中看出，本发明优于常规的SDS法，与常规的CTAB法得率相当，说明本发明提取的RNA基本排除了色素、多糖、多酚和蛋白质等物质的污染，纯度较高，获得的RNA产量也较高。但是本发明操作简便，是一种更为理想的提取RNA的选择。

表1 采用不同方法提取烟草组织叶片的RNA的纯度和得率

上述实施例并非对本发明的形状、材料、结构等作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。