免疫质粒及用于检测抗穆勒氏管激素的单抗、杂交瘤细胞及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种免疫质粒以及用于检测抗穆勒氏管激素的单克隆抗体、杂交瘤细胞及其制备方法和应用。本发明创造性地应用proAMH与Mature AMH构成的耐受原对小鼠进行免疫，制备免疫耐受小鼠，并利用合适的免疫原，通过DNA免疫的方式获得高免疫应答的小鼠，并最终筛选得到可分泌用于检测抗穆勒氏管激素的单克隆抗体的杂交瘤细胞，通过该杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体或者有该免疫原通过其他方式得到的单克隆抗体，均可以直接用于检测原始AMH中proAMH与Mature AMH的连接部位，无需加入表面活性剂等成分对样本进行解离等预处理，操作简便，并且可以适应多种不同的免疫学检测平台，可快速准确地检测出样本中的原始AMH蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种免疫质粒及用于检测抗穆勒氏管激素的单抗、杂交瘤细胞及其制备方法和应用。

背景技术

抗穆勒氏管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)是转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员之一。AMH是由两个相同的70kd亚基通过二硫键连接组成的二聚糖蛋白，相对分子质量为140kd。人类AMH编码基因位于19号染色体短臂。AMH是由睾丸未成熟的睾丸支持细胞及卵巢窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞分泌。AMH是卵泡生长发育的调节因子，参与生理性卵泡形成过程中的两次重要募集：始基卵泡募集和优势卵泡募集。AMH不受月经周期以及激素避孕药影响，是评估卵巢储备功能的客观准确指标、能够更敏感更准确反映年龄相关卵巢储备功能的下降。

经过多年的努力，目前对AMH蛋白的代谢及其在血液中的存在形式已有较清晰的了解。然而，在众多的存在形式中，哪些具有诊断学意义，目前尚无明确的结论。研究表明，AMH的N端区域对保持蛋白完整活性起关键作用，在代谢运输过程中，AMH的特定位点(451位氨基酸)可以被切开，形成前体片段(proAMH，26-451aar)以及成熟片段(Mature AMH，452-560aar)，而切开的两个片段能够再通过非共价键的形式连接在一起。

Ansh公司通过研究，获得一系列针对蛋白线性表位的配对抗体，可测定不同形式的AMH分子。针对原始AMH的检测，Ansh公司采用一个proAMH单体和一个Mature AMH单抗配对，配合试剂盒工艺，可测定样本中原始的AMH浓度，但由于AMH蛋白存在酶切的两个片段可通过非共价键再次连接形成复合物，而被该配对抗体检测，因此，会造成错误的结果。在试剂中加入表面活性剂进行处理可以解离复合物，提高检测准确性，但操作复杂，并且不同检测平台对高浓度的表面活性剂耐受情况不同，表面活性剂同样可能对检测结果造成较大影响。

发明内容

基于此，有必要提供一种操作简便且能够提高检测结果准确性的用于检测抗穆勒氏管激素的单克隆抗体、杂交瘤细胞及其制备方法和应用，以及一种可用于制备该杂交瘤细胞的免疫质粒。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下。

一种免疫质粒，所述免疫质粒中插入有AMH基因中proAMH与Mature AMH连接部位的基因片段。

在其中一个实施例中，所述基因片段以单拷贝的形式插入在所述免疫质粒中；

或者所述基因片段以多拷贝串联的形式插入在所述免疫质粒中，该多拷贝中各拷贝的长度相同或不同，且该多拷贝中各拷贝都含有所述基因片段。

在其中一个实施例中，所述基因片段的序列为SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的编码序列。

在其中一个实施例中，所述免疫质粒为插入有所述基因片段的pcDNA3.1质粒。

在其中一个实施例中，所述免疫质粒上所插入的片段为“X-AMH基因中proAMH与Mature AMH连接部位的基因片段”，X为起靶向作用的蛋白分子的编码序列，首选为β2m的编码序列。

一种可分泌用于检测抗穆勒氏管激素的单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：采用基因重组技术，以proAMH及Mature AMH重组蛋白作为耐受原，使用消减免疫法得到耐受的小鼠；

步骤二：通过DNA免疫的方式，以上述任一实施例所述免疫质粒作为免疫原注射所述耐受的小鼠，获得高免疫应答的小鼠；

步骤三：从所述高免疫应答的小鼠提取脾脏细胞，并与小鼠瘤细胞融合，筛选出阳性的杂交瘤细胞，即得。

在其中一个实施例中，所述削减免疫法包括高区带耐受消减免疫、新生期耐受消减免疫和药物耐受削减免疫，首选药物耐受削减免疫。

在其中一个实施例中，在所述步骤二中，还包括加入可促进DC细胞富集的质粒“pcDNA3.1-Y”以增强免疫效率，Y首选CCL20或FLT3L的编码序列。

在其中一个实施例中，在所述步骤三中，具体是从步骤二获得的所述高免疫应答的小鼠提取脾脏细胞，与骨髓瘤细胞按照脾细胞:骨髓瘤细胞＝5:1的数量比例混合，介导融合，筛选出目标杂交瘤细胞。

在其中一个实施例中，所述骨髓瘤细胞为SP2/0细胞。所述介导融合是以PEG介导进行融合。所述筛选出目标杂交瘤细胞是通过HAT和阻断ELISA来筛选出目标杂交瘤细胞。

一种由上述任一实施例所述的杂交瘤细胞的制备方法制备得到的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体。

该杂交瘤细胞的名称为“杂交瘤细胞株AMH-8F1”，已于2017年10月15日保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心(即中国典型培养物保藏中心)，保藏号是CCTCCNO：C2017200。

一种上述杂交瘤细胞或单克隆抗体在制备抗穆勒氏管激素检测试剂中的应用，如一种检测试剂盒，其含有所述杂交瘤细胞或所述单克隆抗体。

本发明创造性地以proAMH与Mature AMH重组蛋白构成的耐受原对小鼠进行免疫，制备得到免疫耐受的小鼠，并利用含proAMH与Mature AMH连接部位的编码序列的免疫质粒作为合适的免疫原，通过DNA免疫的方式获得高免疫应答的小鼠，并最终筛选得到可分泌用于检测抗穆勒氏管激素的单克隆抗体的杂交瘤细胞，通过该杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体或者由该免疫原通过其他方式得到的单克隆抗体，均可以直接用于检测原始AMH中proAMH与Mature AMH的连接部位，并且该单克隆抗体只能与完整的未酶切的AMH分子起免疫学反应，对于proAMH片段和Mature AMH片段或者proAMH片段与Mature AMH片段通过非共价键连接的复合物不会起反应，因而在对原始AMH检测时，无需加入表面活性剂等成分对样本进行解离等预处理，操作简便，并且可以适应多种不同的免疫学检测平台，可快速准确地检测出样本中的原始AMH蛋白。

附图说明

图1为proAMH PCR产物鉴定；

图2为pcDNA3.1+proAMH构建质粒鉴定图；

图3为pcDNA3.1+proAMH质粒酶切鉴定图；

图4为pro AMH蛋白表达与纯化鉴定，其中，1：marker；2：全菌；3：洗脱峰；4：洗脱峰；5：洗脱峰6：空白菌；

图5为Mature AMH PCR产物鉴定；

图6为pcDNA3.1+Mature AMH质粒鉴定；

图7为pcDNA3.1+Mature AMH质粒酶切鉴定；

图8为Mature AMH蛋白纯化鉴定，其中，1：marker；2：全菌；3：洗脱峰；4：洗脱峰；5：洗脱峰6：空白菌；

图9为β2m PCR产物鉴定；

图10为pcDNA3.1+β2m质粒构建鉴定；

图11为β2m蛋白表达与纯化鉴定，其中，1：marker；2：全菌；3：洗脱峰；4：洗脱峰；5：洗脱峰6：空白菌；

图12为β2m+proAMH PCR产物鉴定；

图13为pcDNA3.1+β2m+proAMH质粒鉴定；

图14为pcDNA3.1+β2m+proAMH蛋白纯化鉴定，其中，1：marker；2：全菌；3：洗脱峰；4：洗脱峰；5：洗脱峰6：空白菌；

图15为腹水单克隆抗体效价测定结果图；

图16为单抗的亲和力常数(Kaff)测定结果图；

图17为单抗的类型分析结果图；

图18为抗体特异性分析结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1AMH各抗原的DNA质粒以及蛋白的制备

1.基因的获取

由基因合成公司根据Genbank(Gene ID:268；NC_000019)外显子序列进行合成PCR扩增用模板。

2、质粒的构建：

2.1引物的设计

A、proAMH，根据proAMH(1～451aar)序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的DNA序列如SEQ ID NO:2所示)，设计一对碱基序列互补随机引物：

proAMH-F：5'-TATGATGCGTGATTTACCTTTGACTTCT-3'(SEQ ID NO:3)；

proAMH-R：5'-AATTCTTATCAACGCTGCGCCCTTC-3'(SEQ ID NO:4)。

B、Mature AMH，根据Mature AMH(452～560aar)序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，对应的DNA序列如SEQ ID NO:6所示)，设计一对碱基序列互补随机引物：

Mature AMH-F：5'-TATGTCTGCTGGTGCCACTGC-3'(SEQ ID NO:7)；

Mature AMH-R：5'-AATTCTCACTATCGACACCCGCACT-3'(SEQ ID NO:8)。

C、完整AMH，根据AMH(1～560aar)序列(编码序列如SEQ ID NO:9所示)，设计一对碱基序列互补随机引物：

proAMH-F：5'-TATGATGCGTGATTTACCTTTGACTTCT-3'(SEQ ID NO:3)；

Mature AMH-R：5'-AATTCTCACTATCGACACCCGCACT-3'(SEQ ID NO:8)。

D、β2m(β2微球蛋白)，根据β2m序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，对应的DNA序列如SEQ ID NO:11所示)，设计一对碱基序列互补随机引物：

β2m-F：5'-TATGCATATCCCGG TCCCAGTAAACGGT-3'(SEQ ID NO:12)；

β2m-R：5'-AATTCATGGCTCGTTCTGTTACTTTAGTCTTT-3'(SEQ ID NO:13)。

E、AMH、β2m互补随机引物，根据序列设计一对碱基序列互补随机引物，采用串联方式连接两序列：

proAMH-F：5'-TATGATGCGTGATTTACCTTTGACTTCT-3'(SEQ ID NO:3)；

β2m-R：5'-AATTCATGGCTCGTTCTGTTACTTTAGTCTTT-3'(SEQ ID NO:13)。

2.2 proAMH目的片段的PCR扩增

PCR扩增体系：

PCR运行程序：94℃预变性3min；94℃高温变性30s->60℃低温复性30s->72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃5min。

3、基因的克隆

3.1 PCR产物回收

1％凝胶电泳PCR产物，EB染色后，参图1，在紫外灯下切胶；向放入收集管中的吸附柱中央加入1ml平衡液BL，12000rpm，离心60s，滤液倒掉，吸附管重新放入收集管中；将目的片段胶条称重，并按重量加入3倍体积PN溶胶液(按胶重1g，等于1ml)37-50℃水浴进行溶胶，处理10min左右，溶胶过程中确保片段的有效释放，不断上下翻转离心管；吸取胶溶液到吸附柱中，RT反应2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，重新放入吸附柱；在吸附柱中加入1.2ml漂洗液PW，12000rpm离心1min，去掉收集管废液，放入吸附柱，重复一次；吸附柱12000rpm空离心2min；通风厨彻底干燥；吸附柱重新套入一个EP管，并在中央加入100μl EB洗脱液；2min后，12000rpm离心3min收集DNA片段，并定量。

3.2 pcDNA3.1-AMH重组表达载体的构建

proAMH和pcDNA3.1(+)连接反应：16℃连接过夜

结果见图2。

3.3感受态细胞的制备

将克隆菌DH5α在LB培养基中37℃，200rpm摇菌过夜活化；隔天按1％接菌量，37℃摇菌培养到OD＝0.5-0.6左右；快速分装培养基，并4℃350rpm低温心10min；沉淀菌体用100μl冰冷的0.1M CaCl₂重悬，并分装20μl每管-20℃备用。

3.4转化

取10μl连接产物加入到20μl感受态DH5a细胞中，并轻轻吹打均匀，冰浴30min；立即将离心管放入42℃水浴锅中静置90S；立即放入冰中60S；加入180μl LB培养基，37℃200rpm促菌体生长1h；取100μl培养菌液涂布到含100μg/ml Amp；0.8mg/ml X-Gal；0.1mMIPTG琼脂板中37℃培养过夜。计算白色、蓝色菌落。挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。检测插入片段，引物采用BcaBESTTM Sequencing Primers。阳性克隆子菌液送华大基因进行测序。

4、质粒的少量制备(以pcDNA3.1-proAMH为例)

挑取菌液接种至5ml含100μg/ml AMP的LB培养液中，37℃，200rpm摇床培养过夜；用质粒小提试剂盒抽提质粒，向吸附柱中加入500μl平衡液BL，12000rpm离心1min；收集管中的废液，将吸附柱放回回收管中备用；取过夜培养菌5ml菌液，装入1.5ml离心管中，12000rpm于室温离心1min沉淀菌体，弃除上清；加入250ml Buffer P1(已加入RNaseA放于4℃)，重悬细菌沉淀；加入250ml Buffer P2，轻轻颠倒离心管6～8次，室温放置2～3min，使细菌完全裂解，溶液透明，裂解时间不要超过5min；加入350ml Buffer P3，轻轻颠倒离心管4～6次，充分混匀，可见白色絮状物产生；室温12000rpm离心10min；将上一步上清小心吸出，转移至经平衡液处理过的离心柱内，于离心机上12000rpm离心45s，弃去废液；向离心柱内加入去蛋白液PD 500μl，12000rpm离心45s，弃去废液；向离心柱内加入BufferPW(洗涤液)700μl，高速离心30s，弃去废液；重复一次此操作；再次12000rpm离心1～2min甩干；室温静止几分钟，使乙醇完全挥发；小心取出离心柱，弃去套管；将离心柱插入一个新的1.5ml离心管，在离心柱内硅胶膜中心位置加入80μl洗脱液；12000rpm离心1min，离心管中即得纯化的质粒DNA溶液；使用超微量分光光度计检测所提质粒的浓度(ng/μl)。

5、基因鉴定

A、重组质粒鉴定

用NdeI和EcoRⅠ双酶切对所提质粒进行双酶切鉴定，见图3，将阳性克隆送华大基因测序。

B、菌落PCR鉴定

菌落扩增采用PCR法扩增，程序：94℃、5min；94℃、30s，62℃、30s，72℃、30s，共30个循环；2℃、7min；6℃、forever；PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

PCR反应体系如下：

6、重组蛋白在DC中的表达和鉴定

6.1 DC细胞的获取

6.1.1提取小鼠骨髓瘤细胞：将正常昆明小鼠处死，从后肢骨髓用PBS将骨髓从骨髓腔冲洗出来，收集骨髓细胞悬液于离心管中，1000r/min，离心10min，弃上清，收集沉淀的骨髓细胞。

6.1.2裂解红细胞：以1:10体积挤压比加入灭菌水，吹打细胞充分裂解红细胞，当膜状物出现时加入1.8％NaCl溶液终止反应，细胞悬液过200目筛网，以去除细胞碎片。滤液1000r/min，离心10min，弃上清，细胞沉淀再用PBS洗涤1遍(1000r/min，离心10min)，洗涤后弃上清。

6.1.3除杂细胞：加入含稀释的大鼠抗小鼠CD4单抗，大鼠抗小鼠CD8a单抗及大鼠抗小鼠CD45R单抗各0.5ml。置37℃、5％CO₂、湿度为100％的培养箱中反应30min，细胞悬液1000r/min，离心10min，弃上清，收集沉淀的细胞，加新鲜兔血清重悬，37℃水浴箱中作用30min，细胞悬液1000r/min，离心10min，弃上清，收集沉淀细胞，再用PBS洗涤2次(1000r/min，离心10min)，弃上清、收集沉淀细胞。

6.1.4 DC和单核细胞分离：将细胞放入含终浓度为100U/ml GM-CSF、100U/ml IL-4和10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基的培养瓶中，调细胞密度5*10⁵个/ml，置37℃、5％CO₂、湿度为100％的培养箱中培养。4h后，倒去上清，用新无血培养基清洗未贴壁细胞，重新加入100U/ml>

6.1.5 DC细胞成熟：单核细胞经与IL-4和GM-CSF的刺激，一周左右开始分化成DC细胞，但未成熟，更换等体积含IFN-a的RPMI-1640培养基，继续置5％CO₂中，37℃培养，一周后细胞成熟。

6.1.6 DC细胞鉴定：DC细胞培养一周后，吸取2ml细胞悬液于离心管中1000r/min，离心10min,弃上清。细胞以少量PBS重悬后涂于玻片，风干后用80％丙酮固定10min，自然干燥后再滴加大鼠抗小鼠CD25单抗及大鼠抗小鼠DC单抗各20μl，置37℃恒温箱中反应30min，用PBS液洗去单抗，室温下干燥。再滴加标有FITC的羊抗大鼠IgG 20μl，37℃恒温中作用30min，用PBS洗液去荧光抗体，干燥后于荧光显微镜下观察。

6.2脂质体法重组质粒转染DC细胞

6.2.1以5*10⁵个细胞/孔接种6孔板培养24h，使其达50％-60％板面积。

6.2.2配制DNA/脂质体复合物：

6.2.2.1在1ml无血清DMEM中稀释质粒DNA，旋转1s。加入脂质体悬液，旋转后，室温放置10min；

6.2.3弃细胞中的培养基，用1ml无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1ml DNA/脂质体复合物，37℃培养5h；

6.2.4每孔中加入20％FCS的DMEM，继续培养24h；

6.2.5吸取DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10％FCS的DMEM，2ml/孔，培养32h，用胰酶消化细胞、收集细胞，以备分析鉴定。

6.3 SDS-PAGE检测重组质粒pcDNA3.1+proAMH在DC细胞中的表达

重组质粒pcDNA3.1+proAMH转染DC细胞4天后，用吸管吹下细胞，收货细胞及培养液到10ml离心管，400rpm离心5min。离心获得的细胞用预冷PBS洗涤2遍，并与100μl细胞裂解液混匀，冰浴1h，12000rpm离心30min，取上清进行SDS-PAGE电泳。

将制备好的凝胶平板装进垂直平板电泳槽中，倒入1×电泳缓冲液，将4℃保存的样品每管取10μl小心加到样品槽中；对应好正负电极，接好电源开始电泳，开始时用80V，待溴酚蓝指示染料到达分离胶时改用120V进行电泳，直到溴酚蓝指示染料跑出凝胶底部结束电泳；电泳结束后，取出玻璃板，小心取下凝胶用水冲洗后加入考马斯亮蓝染色液，微波先加热30s，再加热15s，置于摇床上摇5min；回收考马斯亮蓝染色液；加入适量脱色液，摇床上脱色，直至背景无颜色；将脱色好的蛋白胶用扫描仪扫描至电脑。

重组蛋白的纯化：样品纯化(5ml层析柱)：A管路上样，见峰起收集流穿峰，取40μl制作电泳样品(即流穿峰)；Buffer A冲洗柱子，至基线平衡；阶段梯度洗脱：30％B咪唑冲洗，100％B咪唑冲洗15min，至CV基线平衡；流穿峰收样，取40μl制作电泳样品；在线洗柱：去离子水冲洗适当时间；1M NaOH冲洗至基线平衡；2M NaCl冲洗适当时间；去离子水冲洗至基线平衡，20％乙醇冲洗。结果见图4。

间接ELISA法检测AMH表达蛋白的活性：将AMH抗原以2μg/ml浓度加入酶标板中，100μl/孔，4℃包板过夜；次日PBST洗板3次；3％BSA37℃封闭2h；按照1:100,1:1000,1:10000,1:100000 100μl/孔加入抗AMH抗体，双孔对照加入酶标板中，37℃孵育30min；PBST洗板3次；加入1:20000羊抗鼠二抗，37℃孵育40min；PBST洗板3次；加入辣根过氧化物酶底物100μl/孔,显色10min；2M硫酸50μl/孔，终止反应，酶标仪上机OD450/630读数。

Mature AMH、AMH、β2m等其他目的片段的PCR扩增以及质粒构建、检测等操作步骤同proAMH，再次不再赘述，结果请参见图5～图14。

实施例2杂交瘤细胞的建立及单克隆抗体的制备

1.免疫耐受小鼠细胞

采用基因重组技术，以上述实施例1合成的proAMH(1～451aar)及Mature AMH(452～560aar)重组蛋白作为耐受原，以50μg/只小鼠的剂量进行动物免疫，共10只。并于免疫后10min、24h、48h以及6d注射环磷酰胺进行消减免疫，再于免疫后测定小鼠尾血效价，选择消减效果最佳的小鼠作为成功耐受的小鼠模型，进行DNA免疫。

2.通过DNA免疫的方式，获得高免疫应答的小鼠。

小鼠肌肉基因注射：以0.75％戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠，取腹位，调整腿姿暴露胫骨前肌。消毒后，用带有塑料套管的1mL注射器在肌肉的中部垂直进针，针尖插入深度由套管决定，约为2-3mm，缓慢推进，可见注射肌肉膨胀，完毕后将针头旋转90度，停留5s，缓缓拔出。

基因注射流程：0天时，以戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠后，在小鼠的左后腿注射100μl0.25％生物丁哌卡因，第1天时，以同样的方法麻醉小鼠后，在小鼠的左后腿分别注射“pcDNA3.1-β2m-“PGRAQRSA×4”和pcDNA3.1-CCL20(CCL20的氨基酸序列如SEQ IDNO:14所示)质粒，PGRAQRSA即AMH基因中proAMH与Mature AMH连接部位的氨基酸序列，其序列参序列表中SEQ ID NO:15，在本实施例的质粒中其编码序列共有四个拷贝，可理解，在其他实施例中，不限于四个拷贝，如也可以是一个、两个、三个、五个、六个等，且各拷贝的长度也可以不等，只要各拷贝都含有SEQ ID NO:15的编码序列即可。调节注射比例1：1～1：4，小鼠共免疫三次，间隔三周，每次免疫方式一样。第三次免疫结束后一周采集尾血，测效价，确定最佳免疫响应小鼠，以备融合。

3.杂交瘤细胞的制备

(1)饲养细胞的制备

将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75％酒精5分钟，随即放入超净工作台内，用眼科镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，用注射器吸取5ml RPMI-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，反复抽吸几次。将腹腔内液体，注入离心管。1000rpm离心10min，弃上清。用20～50ml完全培养液重悬细胞，100μl/孔滴加到培养板，置培养箱备用。

(2)免疫脾细胞的制备

取加强免疫的小鼠一只，眼眶采血后脱臼处死，在75％酒精中消毒后取脾脏，去除结缔组织，制备脾细胞悬液，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500～2000rpm离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，白细胞稀释液稀释20倍，计数，取1×10⁸个细胞待用。

(3)骨髓瘤细胞的制备

取3瓶生长状态良好的(活细胞数＞95％)骨髓瘤细胞，将之完全吹下，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500～2000rpm离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，RPMI1640稀释10倍，计数，取2×10⁷个细胞待用。

(4)细胞融合制备杂交瘤细胞

将脾细胞:骨髓瘤＝5:1混合，1500～2000rpm离心5分钟。将离心上清倒干，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，在1分钟内加入1ml融合剂，并搅拌细胞，37℃水浴放置45秒，缓慢加入1640，终止融合剂的融合作用，500rpm离心7分钟，弃上清。加入300ml含20％胎牛血清的1640及HAT中，进行铺板，每孔100μl。

(5)阳性杂交瘤细胞的筛选

通过阻断ELISA技术，采用天然纯化AMH蛋白直接筛选可能分泌目标抗体的阳性杂交瘤细胞株，具体是：采用间接捕获的方式，将天然AMH蛋白固定酶标板，并用AMH表位肽库配制成一抗稀释液，稀释细胞培养上清后进行ELISA检测。阳性孔即为目标细胞株。

得到的阳性杂交瘤细胞命名为“杂交瘤细胞株AMH-8F1”，已于2017年10月15日保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心(即中国典型培养物保藏中心)，保藏号是CCTCC NO：C2017200。

(6)腹水纯化得到单抗

借助proAMH和Mature AMH重组蛋白，对获得可能阳性细胞做进一步确认，选择阳性细胞株制备腹水，纯化得到单抗，具体是：收集杂交瘤细胞并用PBS洗细胞两遍，取100万到150万细胞注射于老鼠腹腔，一周后可见老鼠的腹腔肿大，断劲处死后采集到的腹水分装归类最后于-70℃冰箱保存。

(7)抗体的检测

腹水单克隆抗体效价测定

以间接ELISA法测定抗体效价，抗原为AMH，包被浓度0.25μg/ml，腹水做从1/10000倍开始做10倍稀释，反应30min后，加入二抗进一步反应，最终加入TMB显色液，测定其OD值，以阴性对照的3倍对应的稀释度作为抗体效价，结果如图15所示，在稀释到1000000倍后还可以检测出，说明本实施例得到的单克隆抗体对原始AMH蛋白具有较高的检测能力。

单抗的亲和力常数(Kaff)测定

以SPR法测定抗体亲和力常数，以GAM芯片捕获不同浓度待测抗体，加入相同浓度AMH抗原，测定其结合和解离常数，计算抗体的亲和力，结果如图16所示，其亲和力为1.52×10^-10M^-1。

单抗的类型分析

以间接ELISA法测定，抗原包被，分别加入待测抗体，以及分型二抗，结果如图17所示，阳性结果二抗所对应亚类即为抗体亚类，抗体亚类为IgG1。

抗体特异性分析

采用proAMH、Mature AMH以及原始AMH重组蛋白包被ELISA板，加入稀释到一定浓度的待测抗体，分析其余三种不同抗原的反应情况，结果如图18所示，结果表明该抗体至于原始AMH反应，即该抗体所识别表位外451位氨基酸所在序列。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广州万孚生物技术股份有限公司

<120>免疫质粒及用于检测抗穆勒氏管激素的单抗、杂交瘤细胞及其制备方法和应用

<160>15

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>451

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

Met Arg Asp Leu Pro Leu Thr Ser Leu Ala Leu Val Leu Ser Ala Leu

1 5 1015

Gly Ala Leu Leu Gly Thr Glu Ala Leu Arg Ala Glu Glu Pro Ala Val

202530

Gly Thr Ser Gly Leu Ile Phe Arg Glu Asp Leu Asp Trp Pro Pro Gly

354045

Ser Pro Gln Glu Pro Leu Cys Leu Val Ala Leu Gly Gly Asp Ser Asn

505560

Gly Ser Ser Ser Pro Leu Arg Val Val Gly Ala Leu Ser Ala Tyr Glu

65707580

Gln Ala Phe Leu Gly Ala Val Gln Arg Ala Arg Trp Gly Pro Arg Asp

859095

Leu Ala Thr Phe Gly Val Cys Asn Thr Gly Asp Arg Gln Ala Ala Leu

100 105 110

Pro Ser Leu Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Arg Asp Pro Gly Gly Gln

115 120 125

Arg Leu Val Val Leu His Leu Glu Glu Val Thr Trp Glu Pro Thr Pro

130 135 140

Ser Leu Arg Phe Gln Glu Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gly Pro Pro Glu

145 150 155 160

Leu Ala Leu Leu Val Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Glu Val Thr Val

165 170 175

Thr Arg Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gln Ser Leu Cys Pro Ser Arg Asp

180 185 190

Thr Arg Tyr Leu Val Leu Ala Val Asp Arg Pro Ala Gly Ala Trp Arg

195 200 205

Gly Ser Gly Leu Ala Leu Thr Leu Gln Pro Arg Gly Glu Asp Ser Arg

210 215 220

Leu Ser Thr Ala Arg Leu Gln Ala Leu Leu Phe Gly Asp Asp His Arg

225 230 235 240

Cys Phe Thr Arg Met Thr Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Arg Ser Glu

245 250 255

Pro Ala Pro Leu Pro Ala His Gly Gln Leu Asp Thr Val Pro Phe Pro

260 265 270

Pro Pro Arg Pro Ser Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Pro Ser Ala Asp

275 280 285

Pro Phe Leu Glu Thr Leu Thr Arg Leu Val Arg Ala Leu Arg Val Pro

290 295 300

Pro Ala Arg Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ala Leu Asp Pro Asp Ala Leu

305 310 315 320

Ala Gly Phe Pro Gln Gly Leu Val Asn Leu Ser Asp Pro Ala Ala Leu

325 330 335

Glu Arg Leu Leu Asp Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro

340 345 350

Thr Ala Ala Thr Thr Gly Asp Pro Ala Pro Leu His Asp Pro Thr Ser

355 360 365

Ala Pro Trp Ala Thr Ala Leu Ala Arg Arg Val Ala Ala Glu Leu Gln

370 375 380

Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Thr

385 390 395 400

Ala Pro Leu Leu Ala Arg Leu Leu Ala Leu Cys Pro Gly Gly Pro Gly

405 410 415

Gly Leu Gly Asp Pro Leu Arg Ala Leu Leu Leu Leu Lys Ala Leu Gln

420 425 430

Gly Leu Arg Val Glu Trp Arg Gly Arg Asp Pro Arg Gly Pro Gly Arg

435 440 445

Ala Gln Arg

450

<210>2

<211>1401

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

atgcgtgatt tacctttgac ttctcttgct ctcgttctat ccgccctggg tgcattattg60

ggcaccgaag cgcttcgcgc tgaggaaccc gccgtcggaa catcagggct catttttcga 120

gaggacctag attggccacc gggttcgcct caagaacccc tgtgtttagt agcattgggc 180

taatagggag acagtaatgg gagctcttcc ccacttcggg tggttggtgc gctctcagct 240

tatgagcagg ccttcctagg cgcagtccaa agagcgaggt ggggaccgcg tgatctggct 300

acgtttgggg tatgcaacac tggtgaccgc caggccgcat taccttcgtt gcgacggctt 360

ggcgcgtgat aatggctcag agatcccgga gggcaaaggc tagtggttct gcatttagaa 420

gaggtcacct gggaaccaac accgagtttg cgtttccagg agcctccccc aggtggcgct 480

ggaccgcctg aacttgccct cctagtactg taccccgggc caggtccgga ggtgacggtt 540

actcgcgcag gctagtgatt acctggagcg caaagcttgt gtccctctcg agacacccgg 600

tatcttgtcc tcgctgtaga tagaccagcc ggggcatgga ggggttccgg cctagcgctg 660

acattacagc cgcgtggaga agactcacgc ttgtcgacgg ctcgacttca agccctccta 720

tttggggatg accaccggta atagtgcttc actagaatga cccctgcact gttattgctt 780

cccaggagtg agccagcgcc gctccctgct catggtcagc tagatacagt gccctttcca 840

ccgcctcgtc ccagcgccga actggaggaa tctccaccgt ccgcagaccc tttcttagag 900

acgttgactc gccttgttcg agcgtgataa ctccgggtcc ccccagctag agcctcagca 960

ccgaggctag cgctggatcc tgacgcttta gccggctttc cccaaggatt ggtaaatctt1020

tcggatccag cagcgctcga acgtctactg gacggggagg aaccgttatt gcttctccta1080

cgccctaccg ctgccacaac gggtgatccc tagtgagcac cactgcacga cccgactagt1140

gcgccttggg ctaccgcctt agcacgacgg gtggcggctg agttgcaggc cgcagcggct1200

gaacttagaa gcctccccgg cctaccaccg gccacagcac ctctgttagc gaggttgctt1260

gctctctgtc ccggagggcc aggtggccta ggagattaat agccgctgcg tgccttattg1320

cttctcaaag cactacaagg gctgcgcgtt gagtggcgag gtcgggaccc tagaggcccc1380

ggaagggcgc agcgttgata a1401

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

tatgatgcgt gatttacctt tgacttct 28

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

aattcttatc aacgctgcgc ccttc25

<210>5

<211>109

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

Ser Ala Gly Ala Thr Ala Ala Asp Gly Pro Cys Ala Leu Arg Glu Leu

1 5 1015

Ser Val Asp Leu Arg Ala Glu Arg Ser Val Leu Ile Pro Glu Thr Tyr

202530

Gln Ala Asn Asn Cys Gln Gly Val Cys Gly Trp Pro Gln Ser Asp Arg

354045

Asn Pro Arg Tyr Gly Asn His Val Val Leu Leu Leu Lys Met Gln Val

505560

Arg Gly Ala Ala Leu Ala Arg Pro Pro Cys Cys Val Pro Thr Ala Tyr

65707580

Ala Gly Lys Leu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Glu Arg Ile Ser Ala His

859095

His Val Pro Asn Met Val Ala Thr Glu Cys Gly Cys Arg

100 105

<210>6

<211>345

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

tctgctggtg ccactgcagc ggatggccct tgtgctttac gtgaattgtc cgttgacctt60

cgcgccgagc gatcagtcct cattccctaa taggaaacct atcaagcaaa taactgccag 120

ggagtatgtg ggtggccaca atcggatcgg aatccgagat acggtaacca tgtggttcta 180

ctgttaaaaa tgcaggtcag gggcgcggct ttggcccgtc ctccctgctg tgtaccaaca 240

gcatatgcgg gaaagcttct catcagtcta agctgataag aggaacgcat atctgctcac 300

catgtgccga atatggttgc cacggagtgc gggtgtcgat agtga 345

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

tatgtctgct ggtgccactg c21

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

aattctcact atcgacaccc gcact25

<210>9

<211>2960

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>9

gcatgttgac acatcaggcc cagctctatc actggggagg gagataggct gccagggaca60

gaaagggctc tttgagaagg ccactctgcc tggagtgggg gcgccgggca ctgtccccca 120

aggtcgcggc agaggagata ggggtctgtc ctgcacaaac accccacctt ccactcggct 180

cacttaaggc aggcagccca gcccctggca gcacccacga tgcgggacct gcctctcacc 240

agcctggccc tagtgctgtc tgccctgggg gctctgctgg ggactgaggc cctcagagca 300

gaggagccag ctgtgggcac cagtggcctc atcttccgag aagacttgga ctggcctcca 360

ggcagcccac aagagcctct gtgcctggtg gcactgggcg gggacagcaa tggcagcagc 420

tcccccctgc gggtggtggg ggctctaagc gcctatgagc aggccttcct gggggccgtg 480

cagagggccc gctggggccc ccgagacctg gccaccttcg gggtctgcaa caccggtgac 540

aggcaggctg ccttgccctc tctacggcgg ctgggggcct ggctgcggga ccctgggggg 600

cagcgcctgg tggtcctaca cctggaggaa ggtatgtggg gcccagcccc aagcttggca 660

ccgccgtctt ccttcaggtg ggccgggtcc tcctagggaa gatcaggggc tggcagagcc 720

cccaccctgg gcagggaggc tgtggtcttg ttcctaggac tgggttgcgg gtccgtggcc 780

tggaaggtgg gcaccacact ctgtcctgtc cccgaagccc agctcttaga cttgcccctg 840

cctcggtgcc agggagagag ctgctgcctt ctccccaccc ctgaagacga cgcagggctc 900

ggggccagtg gaacccttct tcccacagcc ccagcctgtt ctcagggccg ctggcctaag 960

atactccctg cggggaaggg gcttcatcgg gcaccccaac ccagagaccc cagggcggca1020

gccccaccca cagcctcaga cgcagcccct gcctgcccct gccgtcaccg ctccctggct1080

gcaggaaggc agctaagagg ggcacccttg tcccccgctt gaggtcccct gcacagtggc1140

cagagcggca gggacagatc ccaaagattc ccggggggtg tggccttcaa tggctcaggc1200

gtcccctgct gtcccggctg cagtgacctg ggagccaaca ccctcgctga ggttccagga1260

gcccccgcct ggaggagctg gccccccaga gctggcgctg ctggtgctgt accctgggcc1320

tggccctgag gtcactgtga cgagggctgg gctgccgggt gcccaggtac cagggagttg1380

catggggcag tgcccgggcc gtggcggggg gcatggattt gttgcagggt ctgcagtact1440

gagaacagcg tagaaccagt ggcgatggga ggaaggggac cggtagagcg gggctgggta1500

agcctccatc cagccgggct gagccctggt ctccgcagag cctctgcccc tcccgagaca1560

cccgctacct ggtgttagcg gtggaccgcc ctgcgggggc ctggcgcggc tccgggctgg1620

ccttgaccct gcagccccgc ggagagggta ggtccgcgtg gagagggacg gggagccggg1680

tcgactgccc ccgggccccc agcccctgag ccagccgcgt gcccacccac cgcagactcc1740

cggctgagta ccgcccggct gcaggcactg ctgttcggcg acgaccaccg ctgcttcaca1800

cggatgaccc cggccctgct cctgctgccg cggtccgagc ccgcgccgct gcctgcgcac1860

ggccagctgg acaccgtgcc cttcccgccg cccaggtgcg cgcaggcacc gggacacggg1920

gcaggagcgg gcgggggcgg cgtggcctcg tggccgctct caactcctcc aattgcgggt1980

tccaggccat ccgcggaact cgaggagtcg ccacccagcg cagacccctt cctggagacg2040

ctcacgcgcc tggtgcgggc gctgcgggtc cccccggccc gggcctccgc gccgcgcctg2100

gccctggatc cggacgcgct ggccggcttc ccgcagggcc tagtcaacct gtcggacccc2160

gcggcgctgg agcgcctact cgacggcgag gagccgctgc tgctgctgct gaggcccact2220

gcggccacca ccggggatcc tgcgcccctg cacgacccca cgtcggcgcc gtgggccacg2280

gccctggcgc gccgcgtggc tgctgaactg caagcggcgg ctgccgagct gcgaagcctc2340

ccgggtctgc ctccggccac agccccgctg ctggcgcgcc tgctcgcgct ctgcccaggt2400

ggccccggcg gcctcggcga tcccctgcga gcgctgctgc tcctgaaggc gctgcagggc2460

ctgcgcgtgg agtggcgcgg gcgggatccg cgcgggccgg gtcgggcaca gcgcagcgcg2520

ggggccaccg ccgccgacgg gccgtgcgcg ctgcgcgagc tcagcgtaga cctccgcgcc2580

gagcgctccg tactcatccc cgagacctac caggccaaca attgccaggg cgtgtgcggc2640

tggcctcagt ccgaccgcaa cccgcgctac ggcaaccacg tggtgctgct gctgaagatg2700

caggtccgtg gggccgccct ggcgcgccca ccctgctgcg tgcccaccgc ctacgcgggc2760

aagctgctca tcagcctgtc ggaggagcgc atcagcgcgc accacgtgcc caacatggtg2820

gccaccgagt gtggctgccg gtgacccctg cgccgcgcgg actcctgccc cgagggtccg2880

gacgcgcccc agctcgcgcc ccttcccata tttattcgga ccccaagcat cgccccaata2940

aagaccagca agcaaccggc2960

<210>10

<211>119

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>10

Met Ala Arg Ser Val Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Thr

1 5 1015

Gly Leu Tyr Ala Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg

202530

His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys Tyr Val Thr

354045

Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys Asn Gly Lys

505560

Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser Lys Asp Trp

65707580

Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp

859095

Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Ala Ser Met Ala Glu Pro Lys Thr

100 105 110

Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met

115

<210>11

<211>357

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

atggctcgtt ctgttacttt agtctttttg gtacttgtgt ccctcaccgg tctatatgcc60

attcaaaaaa cacctcagat ccaagtttac tcacgccatc ccccagaaaa tggcaagccg 120

aacatactga attgttatgt cacgcagttc caccctcccc atattgagat ccaaatgtta 180

aaaaacggaa agaaaatacc aaaggtagaa atgtcggata tgagttttag caaagactgg 240

tctttctaca ttttggcaca cactgagttt accccgacag aaacggatac ttatgcgtgc 300

cgagtgaagc atgcttccat ggccgagcct aaaaccgttt actgggaccg ggatatg357

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>12

tatgcatatc ccggtcccag taaacggt 28

<210>13

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>13

aattcatggc tcgttctgtt actttagtct tt32

<210>14

<211>97

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>14

Met Ala Cys Gly Gly Lys Arg Leu Leu Phe Leu Ala Leu Ala Trp Val

1 5 1015

Leu Leu Ala His Leu Cys Ser Gln Ala Glu Ala Ala Ser Asn Tyr Asp

202530

Cys Cys Leu Ser Tyr Ile Gln Thr Pro Leu Pro Ser Arg Ala Ile Val

354045

Gly Phe Thr Arg Gln Met Ala Asp Glu Ala Cys Asp Ile Asn Ala Ile

505560

Ile Phe His Thr Lys Lys Arg Lys Ser Val Cys Ala Asp Pro Lys Gln

65707580

Asn Trp Val Lys Arg Ala Val Asn Leu Leu Ser Leu Arg Val Lys Lys

859095

Met

<210>15

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>15

Pro Gly Arg Ala Gln Arg Ser Ala

1 5