一种模拟实际环境下烟碱降解产生次要生物碱的检测方法

摘要

一种模拟实际环境下烟碱降解产生次要生物碱的检测方法，包括简单的样品制备，实际环境条件模拟方案，多时间点取样，气相色谱质谱及测定结果的数据分析等步骤。降解方案包含的两大变量综合考虑了真实环境条件的模拟以及烟碱化学稳定性质，操作简单，方案可行性和科学性高。本发明检测方法具有检测时间短、灵敏度高等优点。应用本发明技术方案可以综合考量多种来源烟碱的次要生物碱转化性质，获得可靠的烟碱及次要生物碱转化图谱，为烟草行业对烟草制品以次要生物碱为指标的鉴别方法提供科学支撑。

说明书

技术领域

本发明设计一种模拟实际环境下烟碱降解产生次要生物碱的检测方法，属于烟草制品理化鉴别检验技术领域。

背景技术

近年来，烟草制品呈现多元化发展态势，特别是新型烟草制品的出现，为我国烟草制品的管制带来了新的挑战。烟草制品形式及外观的多样性，要求我们掌握全面系统的烟草特征性鉴别指标，以实现我国烟草行业对不同类型烟草制品的准确鉴别和判定。

烟碱是烟草最重要的药理学成分，也是人们消费烟草的最重要原因之一。除烟草外，烟碱还有其他来源，如其他作物或人工合成等。在目前的技术条件下，人工合成烟碱的成本比提取烟碱高得多，市场调研售价相差数十倍以上。在经济角度考虑使用人工合成烟碱不可行，然而，从烟草制品鉴别的科学严谨性和对法律判定的支撑力考虑，仍需探索提取烟碱、人工合成烟碱鉴别指标。其中，次要生物碱和烟碱具有类似的结构和化学特性，在烟草提取过程中往往难以完全去除，有望作为判定烟碱来源的“指纹图谱”，为判定烟草制品的烟碱来源提供证据。然而，烟碱有可能在实际存放过程中发生降解，转化为不同种类的次要生物碱。因此，需要建立实际条件下烟碱降解检测方法，开展烟碱降解产物分析研究，为判定烟草制品的烟碱来源提供证据。

发明内容

本发明的目的旨在建立一种模拟实际条件下烟碱降解转化为次要生物碱的检测方法，为烟草制品鉴别提供科学证据。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

（1）降解样品准备：分别取1ml烟碱，放入2个2ml透明石英瓶(为允许紫外线通过的石英材质)以及2个2ml棕色避光玻璃瓶中，依次编号1,2,3,4号。其中，1号及3号瓶使用内含PTFE密封垫片的塑料盖旋紧，用以模拟封闭条件，2号和4号瓶敞口开放，用以模拟与空气接触条件。1号瓶模拟密封保存光照降解条件方案1，2号瓶模拟接触空气光照降解条件方案2，3号瓶模拟密封避光降解条件方案3，4号瓶模拟接触空气避光降解条件方案4。

（2）样品降解过程：将1号、2号样品瓶放置于适宜的具有通风条件的光照容器内，于25℃、照度为4500lx±200lx的条件下放置30天。光照条件容器，可采用输出相似与D65/ID65发射标准的光源条件，用以模拟国际认可的室外日光标准或者室内间接日光标准。样品均在0、10、20和30天取样检测。将3号、4号放置于适宜的具有通风条件的避光容器内，于25℃的条件下放置30天，用以模拟避光保存的实际环境条件。1,2,3,4号样品均在0、10、20和30天取样检测。

（3）降解样品配制：取10μg左右降解样品，加入50μl一定浓度烟碱内标，放入5-10ml的容量瓶，使用二氯甲烷定容，用以定量样品中烟碱含量；取50μg左右降解样品，加入50μl一定浓度烟碱内标，放入5-10ml容量瓶中，使用二氯甲烷定容，用以定量样品中次要生物碱含量。其中喹啉作为烟碱内标、(±)-降烟碱-2,4,5,6-d4作为降烟碱内标和2,2’-联吡啶-d8作为其他次要生物碱内标。

（4）标准溶液配制：分别准确称取烟碱、N-甲基假木贼碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、β-二烯烟碱、新烟草碱、2,3’-联吡啶、β-二烯降烟碱、可替宁、哈尔碱、烟台林，用二氯甲烷配制成混合标准储备液。由于烟碱降解样品中次要生物碱随着不同的降解条件，内含次要生物碱变化很大，推荐使用适用范围较宽的标准溶液。内标在待测样品及各级标准溶液中浓度相同。标准溶液存放在密闭棕色避光瓶并贮存于0℃～4℃条件下，有效期3个月。取用时放置并达到常温后方可使用。

（5）气相色谱质谱联用定量分析：

利用气相色谱质谱联用分别对标准溶液和样品溶液进行选择离子监测分析，采用气相色谱质谱选择离子监测图谱进行定量。用内标法计算待测样品中烟碱和次要生物碱的含量。

所使用的气相色谱质谱仪器条件如下：进样口温度：250 ℃；进样量：1 μL；载气：氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0 mL/min。

烟碱和11种次要生物碱分析分别采用两种不同的分析步骤，两针进样，分别按照两组升温程序运行：

烟碱检测柱升温程序：分流进样（分流比：100:1）；溶剂延迟：5 min；升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率至200 ℃，再以40 ℃/min的速率至250 ℃，保持5min。运行总时间为13.25 min。

次要生物碱柱升温程序：分流进样（分流比：10:1）；溶剂延迟：12 min；升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min，以8 ℃/min的速率至250 ℃，保持1 min，再以40 ℃/min的速率至280 ℃，保持5 min。运行总时间为29 min。

电离方式：电子轰击源（EI）；电离能量：70 eV；传输线温度：280 ℃；离子源温度：250 ℃；扫描离子范围：80～250amu；质谱扫描方式：选择离子监视方式（SIM）扫描。

所有放置降解样品的容器应具有必要的通风条件，保证空气暴露方案2和4（标号2和4）可与空气中的氧接触。所使用的降解箱应有换气风扇，瓶中放置的液体样品液面不宜过高，如0.5cm以下。

本发明的技术方法对有效模拟了烟碱在实际条件下向次要生物碱的转化，并对色谱质谱条件进行了优化，达到了以下效果：

（1） 环境条件模拟简单真实：建立了4种降解方案，模拟了实际烟碱及烟草制品在储存运输中较为真实的环境条件，可为实际烟碱向次要生物碱转化指纹图谱提供可靠的参考数据。环境模拟条件参考国家相关标准规定，降解实验方便易行。

（2）降解条件变量直接影响烟碱稳定性：经过大量查阅文献以及综合前期实验基础，发现烟碱稳定性即降解性最易收到紫外线光照和氧化影响，因此设定的4种方案在模拟实际环境条件的基础下，兼顾了烟碱的化学性质，降解方案科学有效。实际操作中，可根据实际情况选择不同的方案，对降解样品进行检测。

（3）检测方法简单快速：烟碱检测周期仅需13.25分钟，生物碱检测周期仅需29分钟，本发明方法的色谱条件使目标物色谱峰与杂质色谱峰分离较好，可以有效快速定量降解转化成分。

附图说明

图1为本发明的测定方法的流程图；

图2为样品的烟碱选择离子监测色谱图，

图2中：烟碱—6.670min，喹啉—6.285min）；

图3为样品的次要生物碱选择离子监测色谱图,

图3中：N-甲基假木贼碱—12.796min，降烟碱—13.027min，麦斯明—13.332min，假木贼碱—13.919，β-二烯烟碱—14.236min，新烟草碱—14.720min，2,3’-联吡啶—15.258min，β-二烯降烟碱—15.858min，可替宁—18.420min，(±)-降烟碱-2,4,5,6-d4—12.994min，2,2’-联吡啶-d8—13.398min。

图4 为某烟碱样品降解外观对比图，从左至右为降解实验前的烟碱，第30天无光无氧暴露烟碱，第30天有氧无光暴露烟碱，第30天有光无氧暴露烟碱，第30天有氧有光的暴露烟碱。

具体实施方式

本发明以下结合实施例（附图）做进一步描述。

实施例1：

本实例使用某进口提取烟碱，对其进行避光氧化降解检测试验，并分析其结果：

1.试剂与仪器

标准品：烟碱、N-甲基假木贼碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、β-二烯烟碱、新烟草碱、2,3’-联吡啶、β-二烯降烟碱、可替宁、哈尔碱、烟台林；

内标：喹啉、(±)-降烟碱-2,4,5,6-d4和2,2’-联吡啶-d8；

试剂：二氯甲烷；

容器： 2ml避光玻璃瓶带PTFE隔垫螺旋瓶盖，10ml避光容量瓶；

仪器：气相色谱质谱仪（安捷伦公司），AE163电子天平，感量：0.0001g（瑞士Mettler公司），THS500稳定性试验箱(作为本发明所用避光试验箱)；

2.样品降解：

分别取1ml烟碱放入避光瓶中，避光瓶开口放入避光试验箱中，设置温度为25℃放置30天，并分别在0、10、20、30天取样。

3.样品配制：

烟碱检测溶液配制：取10μl烟碱降解样品，称量后加入10ml容量瓶中，加入50μl内标溶液（喹啉，20 mg/mL），并使用二氯甲烷定容；

次要生物碱检测溶液配制：取50μl烟碱降解样品，称量后加入10ml容量中瓶，加入50μl内标溶液((±)-降烟碱-2,4,5,6-d4和2,2’-联吡啶-d8,0.4mg/mL)，并使用二氯甲烷定容。

4.样品定量分析：使用气相色谱质谱联用内标法定量烟碱和次要生物碱的变化，气相色谱质谱条件如前面。结果见表1：

实例2

对比考察某合成烟碱封闭降解条件下，光照对烟碱降解转化的结果。 烟碱降解条件采用方案1，检测方法同实例1，测量结果如下表2所示。

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