高载锰量和高弛豫率的黑色素样纳米材料及制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种高载锰量和高弛豫率的黑色素样纳米材料及制备方法和应用，所述纳米材料以高锰酸钾作为锰源和氧化剂，由左旋多巴作为前驱体分子聚合而成，其为锰掺杂的黑色素样纳米颗粒MnEMNPs。该材料是具有良好水分散性的黑色素样纳米颗粒，具有高载锰量(>10％)和几何限制效应，表现出优异的T1‑T2双模式MRI对比增强能力。本发明所述制备方法简便、温和、绿色环保，为开发新型高效能MRI对比剂提供新思路和新途径。

说明书

技术领域

本发明属于功能化高分子聚合物的技术领域，具体涉及一种高载锰量和高弛豫率的黑色素样纳米材料及制备方法和应用。

背景技术

磁共振成像(MRI)是一种极具价值的临床成像技术。为了提高诊断特异性、敏感性和诊断精度，目前已有多种MRI纳米对比剂被开发，包括正性对比剂(T₁)和负性对比剂(T₂)。最近，T₁-T₂双模式MRI对比剂受到了极大关注，与单一模式MRI对比剂相比，它能够提供全面的协同诊断信息，提高诊断精度。几何限制可通过限制对比剂分子的自由翻转和邻近水分子的扩散，提高对比剂旋转相关时间和水分子扩散相关时间，从而提高对比剂的弛豫率，被认为是制备高性能MRI对比剂的有效策略。

与简单地将T₁对比材料和T₂对比材料混合在一起不同，将高浓度的T₁组分掺杂在非磁性介孔基质中(如聚合物、白蛋白纳米颗粒、介孔硅、金属有机框架、水凝胶等)，可同时获得T₁-T₂双模式MRI对比增强效果。在这种情况下，由于独特结构引起的几何限制效应，周围水分子的配位和化学交换受到限制，导致r₁弛豫率提高。同时，浓度效应可影响T₂弛豫的运动平均效应，提高r₂弛豫率。

传统纳米材料的构成成分非生物体本身所具有，在生物体内长期滞留，难以代谢，存在安全性问题。黑色素是一种具有优异金属离子螯合能力的天然聚合物，广泛存在于生物体各组织内，具有良好的生物相容性。目前已有多种顺磁性金属离子(如锰离子、铁离子、钆离子等)被螯合在黑色素样纳米颗粒表面，作为MRI对比剂。然而，目前报道的文献都是首先在有害的强碱环境中(如氢氧化钠、氢氧化铵等)通过化学或酶性氧化合适的前驱体分子(如盐酸多巴胺、酪氨酸、左旋多巴等)获得黑色素样纳米颗粒，然后再加入金属离子，将其螯合在已合成的黑色素样纳米颗粒表面，即聚合后掺杂策略。这种策略具有以下缺陷：(1)纳米颗粒合成、螯合及纯化步骤比较繁琐；(2)金属离子装载能力很低(通常＜1％)，导致MRI弛豫率较低；(3)螯合的金属离子具有从颗粒表面脱落的风险；(4)水分散性不好。因此，亟待开发简易的合成方法制备具有良好水分散性的高载锰量黑色素样纳米颗粒，这对于提高其生物应用性和MRI弛豫率具有重要的科学意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高载锰量和高弛豫率的黑色素样纳米材料，所述纳米材料是具有良好水分散性的锰掺杂的黑色素纳米颗粒(manganese doped eumelanin nanocomposites，MnEMNPs)，具有高载锰量(>10％)和几何限制效应，表现出优异的T₁-T₂双模式MRI对比增强能力。本发明所述制备方法简便、温和、绿色环保，为开发新型的高效能MRI对比剂提供新思路和新途径。

本发明的技术方案是：

高载锰量和高弛豫率的黑色素样纳米材料，由锰源和氧化剂，左旋多巴作为前驱体分子聚合而成，其为锰掺杂的黑色素样纳米颗粒MnEMNPs。

采用高锰酸钾作为锰源和氧化剂。

高载锰量和高弛豫率的黑色素样纳米材料的制备方法，有以下步骤：

将左旋多巴悬液水浴加热至50℃，取高锰酸钾溶液，在剧烈搅拌条件下快速加入到左旋多巴悬液中，反应6小时，离心重悬数次，获得的MnEMNPs分散于去离子水中。其制备过程如下所示：

所述左旋多巴：高锰酸钾的摩尔比为1：0.3。

所述高锰酸钾溶液为超声分散的高锰酸钾溶液。

所述离心重悬为4-5次，离心速度为17500转/分，离心15分钟。

高载锰量和高弛豫率的黑色素样纳米材料在制备用于磁共振成像对比剂中的应用。

所述成像剂为T₁-T₂双模式MRI对比剂。

本发明所述纳米材料(颗粒)以高锰酸钾作为氧化剂和锰源，左旋多巴作为前驱体分子，通过聚合内掺杂策略得到。所述纳米材料是水分散的高载锰量(>10％)和高弛豫率(1.5T场强下，r₁高达60.8mM^-1s^-1)的MnEMNPs。申请人实验证明，其在1.5T场强下，纵向弛豫率r₁值为临床钆剂的9倍左右。纳米颗粒的形成过程涉及氧化、重排、分子环化、聚合和锰螯合等多个步骤。在聚合过程中，由于黑色素分子表面具有丰富的金属离子螯合位点，被还原成低价的锰离子可连续不断地掺杂入纳米颗粒。所述制备方法简便、温和、绿色环保，重复性高，由于本发明所述材料中的锰离子是生物体生命过程所必需的一种微量元素，生物体可调控其稳态。黑色素也在生物体各组织细胞内广泛存在，可被有效代谢。因此，本材料完全由生物体的天然组分构成，避免了传统纳米材料的安全性问题，具有极大的临床转化价值。

附图说明

图1为MnEMNPs的合成及其作为T₁-T₂双模式MRI对比剂的应用示意图；

图2为合成过程中不同时间点反应液的紫外-可见光吸收光谱；

图3为MnEMNPs的物理化学性能表征；其中，图3a为透射电镜图；图3b为电子自旋共振谱图；图3c为拉曼光谱；图3d扫描电镜图及元素分析(碳，氧，锰)；图3e为Mn_2p1/2和Mn_2p3/2的X射线光电子能谱分析；图3f为电感耦合等离子质谱仪检测锰稳定性；

图4为MnEMNPs的磁学性能表征；其中，图4a为振动样品磁强计检测结果；图4b和4c为氢质子核磁共振分散结果；图4d为不同场强下MnEMNPs的T₁加权和T₂加权图像；图4e为不同场强下MnEMNPs的r₁弛豫率；图4f为不同场强下MnEMNPs的r₂弛豫率；

图5为不同场强下Mn²⁺标准品以及Gd-DTPA的MRI图像和r₁弛豫率；

图6为MnEMNPs的聚乙二醇化表征、胶体稳定性及血液相容性实验；其中，图6a为纳米颗粒的紫外-可见光吸收光谱；图6b为纳米颗粒的水合尺寸分布图。图6c为纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱；图6d为MnEMNPs在不同生理溶液中孵育24小时后的紫外-可见光吸收光谱；图6e为PMnEMNPs在不同生理溶液中孵育24小时后的紫外-可见光吸收光谱；图6f为纳米颗粒的血液相容性测试结果；图6f中的插图为相应图片；

图7为PMnEMNPs的细胞摄取实验及细胞成像；其中，图7a为50μg/mL PMnEMNPs孵育6小时后的U87MG细胞光学显微镜图。上排为对照组，下排为实验组。标尺：100μm(左)，50μm(右)；图7b为50μg/mL PMnEMNPs孵育6小时后的U87MG细胞透射电镜图，上排为对照组。下排为实验组。标尺：2μm(左)，1μm(右)；图7c为不同浓度PMnEMNPs孵育后的U87MG细胞活性检测；图7d为电感耦合等离子质谱仪定量检测细胞摄取PMnEMNPs；图7e为MRI检测不同浓度PMnEMNPs孵育后的U87MG细胞的T₁弛豫时间；图7e中的插图为相应的细胞T₁加权图像；图7f为MRI检测不同浓度PMnEMNPs孵育后的U87MG细胞的T₂弛豫时间；图7f中的插图为相应的细胞T₂加权图像；

图8为U87MG荷瘤鼠MRI；其中，图8a为U87MG荷瘤鼠平扫及经尾静脉注射PMnEMNPs后不同时间点的T₁加权图像(上)和T₂加权图像(下)；图8b为U87MG荷瘤鼠肿瘤部位平扫及注射PMnEMNPs后不同时间点的T₁弛豫时间变化；图8c为U87MG荷瘤鼠肿瘤部位平扫及注射PMnEMNPs后不同时间点的T₂弛豫时间变化；

图9为健康小鼠经尾静脉注射PMnEMNPs后不同时间点(3天、7天、14天)的血清生化检测结果；

图10为健康小鼠经尾静脉注射PMnEMNPs 15天后主要脏器(脑、心、肝、脾、肺、肾)的苏木精-伊红染色图；

图11为健康小鼠经尾静脉注射PMnEMNPs 15天内的小鼠体重变化图。

具体实施方式

本发明采用的试剂：左旋多巴、高猛酸钾、锰离子标准品购自阿拉丁试剂公司(上海，中国)。钆喷酸葡胺(Gd-DTPA，马根维显)购自康臣药业集团有限公司(广州，中国)。

去离子水通过密理博超纯化水系统获得。

1.MnEMNPs的制备：

参见图1，将60mL 10mM左旋多巴悬液水浴加热至50℃。取预先超声分散的1.8mL 100mM高锰酸钾溶液在剧烈搅拌条件下快速加入至左旋多巴悬液(左旋多巴/高锰酸钾投料摩尔比为1：0.3)。反应在剧烈搅拌条件下进行6小时。离心重悬4-5次(17500转/分，15分钟)，以去除多余的反应前驱体和副产物。最后，将获得的MnEMNPs分散于去离子水中。

2.MnEMNPs的物理化学表征：

在反应过程中的不同时间点，取20μL反应溶液，测量其紫外-可见光吸收光谱，对反应过程进行动态监测。通过冻干机冻干、称重，对MnEMNPs进行定量。王水消解样品，电感耦合等离子质谱仪检测锰含量。透射电镜观察MnEMNPs的尺寸和形貌。电子自旋共振仪检测MnEMNPs的电子自旋共振信号。拉曼光谱仪检测MnEMNPs的拉曼光谱信号。采用扫描电镜的X射线能谱分析对MnEMNPs的元素构成进行分析。X射线光电子能谱仪分析MnEMNPs中锰的价态。MnEMNPs中Mn的稳定性检测：将MnEMNPs溶液(100μg Mn mL^-1，一式三份)加入玻璃瓶中，室温静置。在不同时间点，离心(17500转/分，15分钟)，取200μL上清液，王水消解，电感耦合等离子质谱仪检测锰含量。

结果显示，与左旋多巴和高锰酸钾相比，反应溶液的吸收光谱展示出广泛的光学吸收，并且随着反应时间的延长，其吸光度不断增高，原因是左旋多巴氧化、聚合所致，参见图2。获得的MnEMNPs水溶液可保持六个月以上，而不出现肉眼可见的沉聚，表明其具有优异的水分散性。

MnEMNPs在透射电镜图上显示为近乎单分散的球形结构，尺寸较均一，大小在80-100nm左右。由于低聚物亚基之间的相互作用，高倍率透射电镜图显示MnEMNPs为高密度的紧密层状堆垛结构。电子自旋共振谱图上，MnEMNPs展示出与天然黑色素类似的特征性宽单行光谱。MnEMNPs的拉曼光谱在1387cm^-1和1590cm^-1处展示出与天然黑色素类似的特征性信号。以上结果共同提示成功合成黑色素样纳米颗粒。扫描电镜图及元素分析(碳，氧，锰)结果证实锰元素均匀分布于MnEMNPs中。X射线光电子能谱分析结果显示在653.65和641.5eV处出现两个特征性信号峰，分别为Mn_2p1/2和Mn_2p3/2，X射线光电子能谱分析结果提示，MnEMNPs中的锰以大部分的二价锰和小部分的三价锰形式存在。电感耦合等离子质谱仪检测结果显示，锰装载率高达10.2％，远高于之前文献报道。在室温静置一周后，锰含量基本无损失，提高螯合的锰离子具有高度稳定性。以上结果提示成功合成高载锰量的MnEMNPs。参见图3。

3.MnEMNPs的磁学性能表征：

振动样品磁强计在室温下检测MnEMNPs的磁化率。快速场循环核磁共振弛豫仪在室温下对MnEMNPs的质子1/T₁和1/T₂核磁共振分散(¹H>1)和横向弛豫率(r₂)，将MnEMNPs溶液按照浓度梯度倍比稀释至0-0.5mM，用Gd-DTPA和Mn²⁺标准品作为对照。在室温条件下采用7.0T小动物磁共振成像仪对溶液进行图像采集，参数如下：(1)T1RARE序列：重复时间/回波时间：1500/8ms；回波间隔：8ms；激励次数：4；层厚：1mm，视野：2.5×2.5cm；矩阵：256×256；(2)T1-map序列：重复时间：447ms-5500ms；回波间隔：8.5ms；回波间隔：8.5ms；回波图像：10；层厚：1mm；视野：2.5×2.5cm；矩阵：256×256；(3)Turbo>1和r₂弛豫率分别通过分析1/弛豫时间(s^-1)和金属离子浓度(mM)之间的线性关系获得。此外，分别采用9.4T小动物磁共振仪(Bio-Spec，布鲁克，德国)，3.0T临床磁共振仪(Magnetom>

振动样品磁强计检测结果显示MnEMNPs的磁化率在室温下随着应用场的场强升高而增加，无明显矫顽磁性和剩磁，提示MnEMNPs为顺磁性。MnEMNPs的饱和磁化率很低(0.66emu g^-1)，提示产生的局部磁场很微弱以及极小的T₂衰减效应。多种配位机制导致了不同的配位环境和不同的颗粒内磁相互作用，使得¹H>1弛豫率和r₂弛豫率分别在42.5和55MHz达到最大值。¹H>

当金属离子浓度固定时，在相同场强下MnEMNPs显示出比Gd-DTPA和Mn²⁺标准品更好的T₁对比。1.5T场强下，MnEMNPs的r₁弛豫率高达60.8mM^-1s^-1，为临床钆剂的9倍左右，为Mn²⁺标准品的8倍。MnEMNPs的r₁弛豫率远高于文献报道的绝大多数金属离子掺杂的黑色素样纳米颗粒和基于锰的MRI纳米对比剂。MnEMNPs在1.5，3.0和7.0T场强下的r₂弛豫率分别为52.2，82.1和145.4mM^-1s^-1。

表1为不同场强下MnEMNPs、Mn²⁺标准品以及Gd-DTPA的弛豫率分析。当磁场强度从1.5T增加到9.4T时，MnEMNPs的r₂/r₁比值从0.86增大到10.79。这些结果提示MnEMNPs可作为高性能T₁-T₂双模式MRI对比剂，参见表1。

表1

4.聚乙二醇修饰及表征、胶体稳定性及血液相容性检测。

聚乙二醇修饰的MnEMNPs(PMnEMNPs)的制备：将MnEMNPs和巯基末端的聚乙二醇在碱性溶液(pH＝9.8-10.3)中以投料质量比1:5进行混合，室温条件下搅拌过夜。去离子水离心洗涤三次，以去除多余的聚乙二醇。获得的PMnEMNPs重悬于去离子水备用。

采用全波长酶标仪检测MnEMNPs和PMnEMNPs的紫外-可见光吸收光谱。

动态光散射仪检测水合尺寸：取1mL MnEMNPs或PMnEMNPs溶液至样品池中，置于粒度分析仪检测腔体内。数据采集条件为衍射角173°，测试温度25℃。

傅里叶变换红外光谱仪检测化学基团：将真空干燥的溴化钾粉末用玛瑙研钵研磨，移取适量冷冻干燥后的待测样品，将样品和溴化钾按照约1：100的质量比在研钵中再次混匀、研磨。在红外烤灯照射下压片制样，将样品放置在傅里叶红外光谱仪上进行检测。

胶体稳定性检测：将100μg/mL MnEMNPs或PMnEMNPs分散在不同生理溶液(超纯水、磷酸盐缓冲液、生理盐水、5％牛血清白蛋白、无血清培养基)中，室温静置，孵育24小时。小心收集100μL上层液体，采用全波长酶标仪检测其紫外-可见光吸收光谱。

溶血实验：从健康Blab/c小鼠经眼眶取得新鲜血液，置于抗凝管中，室温静置30分钟。3000转/分钟，离心10分钟，小心吸取下层红细胞，用磷酸盐缓冲液稀释至0.25％体积浓度。将稀释液与不同浓度的MnEMNPs或PMnEMNPs在37℃条件下共孵育10小时。去离子水或磷酸盐缓冲液分别作为阳性对照和阴性对照。随后，15000转/分钟，离心5分钟，小心吸取200μL上层液体，采用全波长酶标仪检测541nm处吸光度值。

紫外-可见光吸收光谱显示，聚乙二醇修饰前后的纳米颗粒在近红外区的光学吸收无明显变化。动态光散射仪结果显示MnEMNPs和PMnEMNPs的平均水合尺寸分别为144nm和162.5nm。MnEMNPs的水合尺寸稍大于透射电镜尺寸，可能是由于聚合物的肿胀效应所致。傅里叶变换红外光谱结果显示，1082cm^-1处的特征峰源于聚乙二醇的C-O-C键，提示MnEMNPs表面成功修饰上聚乙二醇。在不同生理溶液(超纯水、磷酸盐缓冲液、生理盐水、5％牛血清白蛋白、无血清培养基)中孵育24小时后，MnEMNPs的紫外-可见光吸收光谱显示出不同程度的下降，而PMnEMNPs在这些溶液中的紫外-可见光吸收光谱基本保持一致，提示聚乙二醇化可提高纳米颗粒的胶体稳定性。溶血试验测试结果表明，200μg/mL>

5.细胞摄取实验、细胞活性检测及细胞MRI

细胞摄取实验：将人源性胶质母细胞瘤U87MG细胞接种于12孔细胞培养板，待细胞融合至80％左右时，加入50μg/mL PMnEMNPs，与细胞共孵育6小时。未进行处理的细胞作为对照。磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，倒置显微镜进行观察、拍照。

细胞透射电镜实验：将U87MG细胞接种于6cm细胞培养皿，待细胞融合至80％左右时，加入50μg/mL PMnEMNPs，与细胞共孵育6小时。未进行处理的细胞作为对照。消化、离心、收集细胞、固定、制样，透射电镜进行观察、拍照。

细胞摄取定量检测：将U87MG细胞接种于6cm细胞培养皿，待细胞融合至80％左右时，加入不同浓度的PMnEMNPs，与细胞共孵育6小时。未进行处理的细胞作为对照。消化、离心、收集细胞，王水消化过夜，0.22μm膜过滤，电感耦合等离子质谱仪对锰含量进行定量分析。

细胞活性检测：将5000个U87MG细胞接种在96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的PMnEMNPs，与细胞共孵育24小时。细胞活性实验检测PMnEMNPs对细胞活性的影响。

细胞成像实验：将U87MG细胞接种于6cm细胞培养皿，待细胞融合至80％左右时，加入不同浓度的PMnEMNPs，与细胞共孵育6小时。未进行处理的细胞作为对照。消化、离心、收集细胞。将细胞用1％低熔点琼脂糖分散，分别比较不同分组细胞的磁共振T₁、T₂弛豫时间。

参见图7，与50μg/mL PMnEMNPs孵育6小时后，光学显微镜图像显示U87MG细胞内可见大量的棕黑色颗粒，且细胞外背景非常干净。细胞透射电镜图显示在核内体结构内可见纳米颗粒存在，表明PMnEMNPs可被U87MG细胞有效摄取。与不同浓度PMnEMNPs孵育后，U87MG细胞活性无明显降低，表明PMnEMNPs具有良好的生物相容性。电感耦合等离子质谱仪显示，U87MG细胞可有效摄取PMnEMNPs，并显示出浓度依赖性。与不同浓度的PMnEMNPs孵育后，U87MG细胞同时展示出良好的正性和负性对比增强效果。细胞的T₁弛豫时间和T₂弛豫时间显著降低，并呈浓度依赖性，提示被摄取的PMnEMNPs可提高细胞可视化程度。

6.荷瘤小鼠MRI

将PMnEMNPs以20mg/kg小鼠体重剂量经尾静脉注入U87MG荷瘤鼠后，分别在注射前、注射后不同时间点对小鼠肿瘤部位行磁共振成像。具体成像参数如上所述。比较肿瘤部位不同时间点信号及弛豫时间变化情况。

参见图8，经尾静脉注射PMnEMNPs后，U87MG荷瘤鼠在T₁加权图像和T₂加权图像上分别表现出正性和负性对比增强效果，在注射后2小时达到峰值。为了消除不同荷瘤鼠之间的差异，将肿瘤部位的T₁弛豫时间和T₂弛豫时间进行量化分析，将注射PMnEMNPs之前的肿瘤部位弛豫时间定义为100％。结果显示，肿瘤部位的T₁弛豫时间和T₂弛豫时间显著降低，在注射后2小时达到峰值，此时间点的肿瘤部位的T₁弛豫时间和T₂弛豫时间分别为注射PMnEMNPs之前的70％和85％。此后，肿瘤部位信号及弛豫时间逐渐恢复，在注射后24小时，肿瘤部位的T₁弛豫时间和T₂弛豫时间分别为注射PMnEMNPs之前的86％和91％。体内MRI结果表明PMnEMNPs可通过高通透和高滞留效应在肿瘤部位有效富集，有效提高肿瘤部位对比度。

7.生物相容性检测

血清生化检测：将PMnEMNPs以20mg/kg小鼠体重剂量经尾静脉注入健康小鼠，未注射PMnEMNPs组小鼠作为对照。在注射后不同时间点(3天、7天、14天)，采用血清生化检测仪对血清生化指标进行定量检测。检测指标包括白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总蛋白、血肌酐、尿酸、尿素等。

组织切片苏木精-伊红染色：将PMnEMNPs以20mg/kg小鼠体重剂量经尾静脉注入健康小鼠，未注射PMnEMNPs组小鼠作为对照。在注射后第15天，10％水合氯醛麻醉小鼠。先用50mL生理盐水经心脏冲洗血液后，再用50mL 4％多聚甲醛灌注。迅速分离并获取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，浸泡于10％福尔马林中。24小时后进行石蜡包埋。以5微米的层厚进行切片，脱蜡。组织切片浸入苏木精染液中10分钟，伊红染色5分钟，倒置显微镜观察、拍照。

小鼠体重监测：将PMnEMNPs以20mg/kg小鼠体重剂量经尾静脉注入健康小鼠，未注射PMnEMNPs组小鼠作为对照。每隔一天称量一次小鼠体重，共监测15天。

参见图9，实验组和对照组的各检测指标无明显差异，提示PMnEMNPs无明显肝肾毒性。

参见图10，结果显示，实验组和对照组的各脏器细胞形态学未见明显差异，提示PMnEMNPs无明显体内毒性。

参见图11，结果显示，实验组和对照组的小鼠体重未见明显差异，提示PMnEMNPs无明显体内毒性。

以上结果提示PMnEMNPs具有良好的生物相容性。

结论：

本发明申请通过新型的聚合内掺杂策略成功合成具有良好水分散性的MnEMNPs。由于具有高载锰量(>10％)和几何限制效应，获得的MnEMNPs具出良好的T₁-T₂双模式MRI对比增强能力，在1.5T场强下，r₁高达60.8mM^-1s^-1。经尾静脉注入荷瘤鼠后，MnEMNPs展示出优异的肿瘤T₁-T₂双模式MRI效果，在提高肿瘤成像对比度方面具有广阔的发展前景。本发明制备过程简便、温和、绿色，重复性高，锰离子和黑色素均在生物体内天然存在，可被生物体有效代谢，具有极大的临床转化价值。