一种黄疸、溶血、脂血的血清处理方法

摘要

本发明提供一种黄疸、溶血、脂血的血清处理方法，取血清100μL加入120μL 0.2moL/L高氯酸 + 80μL 0.1moL/L冰醋酸，混匀后在37℃水浴10min ，接着加入200μL 0.25moL/LNaOH及500μL 0.2moL/L磷酸盐缓冲液，接着通过细菌内毒素检测试剂盒测定内毒素含量。本发明处理液法成分含高氯酸，冰醋酸，氢氧化钠，检测程序上添加磷酸盐缓冲液，增强稳定性，用于黄疸、溶血、脂血样本，有效克服胆红素、血红蛋白或甘油三脂的干扰，提高回收率。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黄疸、溶血、脂血的血清处理方法。

背景技术

2015年版《中国药典》规定用的“细菌内毒素检查法”检测药品的热原的品种已达600多种。同时鲎试剂在临床上的应用也逐渐受到重视，全国每年感染革兰氏阴性菌的患者人数众多，大部分患者在革兰氏阴性细菌感染后，具有发病率高、病情进展快、死亡率高等特点，严重威胁人类健康。革兰氏阴性菌细胞壁主要成分为脂多糖（细菌内毒素），国内外学者研究发现能从体液或血液中检出内毒素水平可为诊断革兰氏阴性菌提供有效依据。

细菌内毒素检测试剂盒已经应用于大部分临床上多年，由于许多疾病会引起黄疸、溶血、脂血。黄疸会引起血清中胆红素升高；溶血会引起血清中血红蛋白升高；脂血会引起血清中甘油三酯升高。胆红素、血红蛋白、甘油三酯使血清分别显黄色、红色、浊度。该性状的血清影响结果观察，在利用仪器检测时，使检测OD值偏高，可能产生假阳性。这胆红素、甘油三酯、血红素三种物质也会会干扰鲎试验正常反应。目前医院使用试剂盒大多采用加热稀释法对样品处理，但该法使黄疸、脂血、溶血样本得不到有效处理，不适用于处理这三项特殊血清样本；另外，加热稀释法也很难完全除去血清中干扰物质（人血清中存在许多蛋白酶、凝血因子、球蛋白等），也会影响检测的准确性，致使检测结果呈假阴性或假阳性；其次，由于内毒素化学结构为含有3个截然不同的区域：O特异侧链、核心多糖、类脂A，核心多糖和类脂之间有KDO键相连，类脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖通过焦磷酸酯组成的糖脂化，加热稀释法处理血清样本，由于加热可能破坏内毒素的化学结构，从而影响检测结果，可能出现假阴性现象。鉴于此，为了消除这三种胆红素、血红蛋白、甘油三酯的影响，我们反复研究几种血清处理方法。我们最终发现了处理该三种黄疸、溶血、脂血血清处理方法，即是高氯酸-冰醋酸法处理血清能消除这三种物质（胆红素、三油甘脂、血红素）的干扰。而我们高氯酸-冰醋酸血清处理液，反复试验，研制出具有独特配方，成分含高氯酸，冰醋酸，NaOH，KCl,这些成分用于黄疸、溶血、脂血样本前处理，有效克服含有胆红素、血红蛋白或甘油三脂的呈黄色、红色、浊度的血清性状的干扰，得到理想的回收率；同时又能去除血清中存在许多蛋白酶、凝血因子、球蛋白，最大程度降低这些蛋白酶干扰鲎试剂试验，大力提高抗干扰能力；此外，高氯酸-冰醋酸血清处理液制备程序上添加磷酸盐缓冲液，使产品均一性及稳定性，最大限度保护了内毒素结构，使更为准确检测出内毒素浓度。

经前处理的血清样本再经以下反应原理进行反应，检测出人体血液的内毒素含量。细菌内毒素检测试剂盒（终点显色基质法）检测细菌内毒素（LPS）的原理是：细菌内毒素激活主试剂中的C因子，被激活的C因子又激活了B因子，具有活性的B因子随之将凝固酶原激活为凝固酶。凝固酶则水解显色基质（Boc-Leu-Gly-Arg-pNA），使之游离出pNA(黄色)，其经重氮偶合后形成红色的偶氮色素，在545nm的波长下测定吸光度，即可以测定细菌内毒素含量。

发明内容

本发明的目的在于提供提供一种黄疸、溶血、脂血的血清处理剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种黄疸、溶血、脂血的血清处理液，其特征在于：所述处理液包含以下成分：（1）0.2moL/L高氯酸，0.1moL/L冰醋酸，（2）0.25moL/L NaOH，（3）0.2moL/L 磷酸盐缓冲液。

所述的0.2moL/L 磷酸盐缓冲液即0.2mol/L磷酸二氢钾溶液+0.2mol/L氢氧化钠溶液。

一种黄疸、溶血、脂血的血清处理方法，取血清100μL加入120μL 0.2moL/L高氯酸+ 80μL 0.1moL/L冰醋酸，混匀后在37℃水浴10min ，接着加入200μL 0.25moL/LNaOH及500μL 0.2moL/L磷酸盐缓冲液，接着通过细菌内毒素检测试剂盒测定内毒素含量。

本发明的优点在于：

（1）本发明处理液法成分含高氯酸、冰醋酸、氢氧化钠，检测程序上添加磷酸盐缓冲液，增强稳定性，用于黄疸、溶血、脂血样本，有效克服胆红素、血红蛋白或甘油三脂的干扰，提高回收率。同时又能去除血清中存在许多蛋白酶、凝血因子、球蛋白，最大程度降低这些蛋白酶干扰鲎试剂试验，大力提高抗干扰能力。此外，高氯酸-冰醋酸血清处理液制备程序上添加磷酸盐缓冲液，使产品均一性及稳定性，最大限度保护了内毒素结构，使更为准确检测出内毒素浓度。

（2）由于高氯酸-冰醋酸血清处理液法操作简便，通过高氯酸法与高氯酸-冰醋酸操作流程比对，主要不同处，高氯酸法需要37℃水浴两次，共15min，也需要3000rpm离心10min ，而我们的高氯酸-冰醋酸法，只需水浴一次共10min，不需要离心，一方面，缩短了反应时间，另一方面简化了操作步骤，不易污染。

具体实施方式

1.配方：经过反复试验摸索，以硫酸、盐酸、硝酸、高氯酸、冰醋酸前处理黄疸、脂血、溶血的血清，再根据反复比对抗干扰能力及回收率试验结果，最终选定了高氯酸及冰醋酸作为血清处理液效果最佳，将高氯酸-冰醋酸血清处理液成分确立为以下成分配方（1）0.2moL/L高氯酸，0.1moL/L冰醋酸，（2）0.25moL/L NaOH，（3）0.2moL/L 磷酸盐缓冲液（即0.2mol/L磷酸二氢钾溶液+0.2mol/L氢氧化钠溶液）。

2.检测方法：

目前医院使用试剂盒大多采用加热稀释法对样品处理，主要处理流程为：取血清100μL+900μL检查用水→75℃水浴10min→细菌内毒素检测试剂盒测定内毒素含量；

根据现有国外文献现有前处理血清方法高氯酸法主要流程为：取血清100μL +100μL0.18N NaOH→37℃水浴5min →100μL 0.32N HClO4 →37℃水浴10min→200 μL 0.18NNaOH →500 μL 0.2N Tris-HCl（pH8.0）→3000rpm离心10min →细菌内毒素检测试剂盒测定内毒素含量；

本发明的高氯酸-冰醋酸法，主要流程为：取血清（黄疸、脂血、溶血）100μL +120μL0.2moL/L HClO4+ 80μL>

实施例1

1黄疸样品：

临床上健康人血清中胆红素浓度值为1mg/dL，一般黄疸病人中血清胆红素浓度是健康人血清中胆红素浓度的20倍左右，即20mg/dL左右。我们试验中用了数学级10倍加量法。试验血清样本为正常人血清胆红素浓度值的10倍、20倍、30倍，即胆红素浓度值10mg/dL、20mg/dL、30mg/dL。

1.1干扰偏差实验要求

所有与试剂直接接触的器具应无菌无热原污染。

1.2实验方法

每个健康人群血清样本制成三个测试样本（对照、添加胆红素、添加胆红素与内毒素。每个测试本分四次。

1.3样本

对照样本：用 0.9mL健康人群血清样本（1-6号）+0.1mL 生理盐水混合而成。

干扰样本1：用0.9mL健康人群血清样本（1-6号）+0.1mL 100mg/dL胆红素标准混合，添加浓度为10mg/dL。

回收样本1：取90μL干扰样本（1-6号）+10μL 0.500EU/mL 内毒素溶液→100μL内含外加0.050EU/mL 内毒素和10mg/dL胆红素的血清。

干扰样本2：用0.9mL健康人群血清样本（1-6号）+0.1mL 200mg/dL胆红素标准混合，添加浓度为20mg/dL。

回收样本2：取90μL干扰样本（1-6号）+10μL 0.500EU/mL 内毒素溶液→100μL内含外加0.050EU/mL 内毒素和20mg/dL胆红素的血清。

干扰样本3：用0.9mL健康人群血清样本（1-6号）+0.1mL300mg/dL胆红素标准混合，添加浓度为30mg/dL。

回收样本3：取90μL干扰样本（1-6号）+10μL 0.500EU/mL 内毒素溶液→100μL内含外加0.050EU/mL 内毒素和30mg/dL胆红素的血清。

1.4血清处理方法

方法1：加热稀释法

对照样本（1-6号）、干扰样本1（1-6号）、回收样本1（1-6号）、干扰样本2（1-6号）、回收样本2（1-6号）、干扰样本3（1-6号）、回收样本3（1-6号）各100μL +900μL检查用水→75℃水浴10min →细菌内毒素检测试剂盒测定内毒素含量。

方法2：高氯酸法

对照样本（1-6号）、干扰样本1（1-6号）、回收样本1（1-6号）、干扰样本2（1-6号）、回收样本2（1-6号）、干扰样本3（1-6号）、回收样本3（1-6号）各100μL +100μL0.18N NaOH→37℃水浴5min →100μL 0.32N HClO₄>

方法3：高氯酸-冰醋酸法

对照样本（1-6号）、干扰样本1（1-6号）、回收样本1（1-6号）、干扰样本2（1-6号）、回收样本2（1-6号）、干扰样本3（1-6号）、回收样本3（1-6号）各100μL +120μL 0.2moL/L HClO₄+80μL>

1.5结果（单位：EU/mL）

我们根据干扰学及回收率试验结果，总结表如下：

（注：一般临床上经验数据，黄疸中血清胆红素超过正常人20倍左右即：20mg/dL左右）。

结论：当血清的胆红素浓度10mg/dL以内值时，血清呈淡黄色。此时用加热稀释法和高氯酸法测定时，干扰偏差高达317%以上，回收率在50-200%区间以外，两种方法均不可使用；当血清的胆红素浓度10mg/dL以内值时，血清胆红素的浓度为20mg/dL值时，当血清胆红素为30mg/dL浓度值时，采用高氯酸及高氯酸-冰醋酸法干扰偏差均在8.81%以内，回收率仍在90-110%之间；因此，我们采用了高氯酸-冰醋酸法，回收率在较好的范围，始终可达90-110%之间，对于黄疸血清处理很彻底，不再干扰鲎试剂反应。通过三种方法比较，黄疸病人的血清采用高氯酸-冰醋酸法处理最好。

实施例2

1.脂血样品：

临床上健康人血清中甘油三脂浓度值为1.98mmol/L，一般脂血病人中血清甘油三脂是健康人血清甘油三酯的2倍浓度左右，即3.96mmol/L左右，一般严重脂血病人血清甘油三脂是健康人血清甘油三酯5-10倍浓度左右，即9.9mmol/L-19.8mmol/L。我们试验根据临床上一般脂血病人血清和严重脂血病人血清中甘油三酯含量。试验血清样本为正常人血清甘油三脂浓度数值的2倍，10倍，即甘油三脂浓度值为3.96mmol/L与19.8mmol/L。

2.1 实验要求

所有与试剂直接接触的器具应无菌无热原污染。

1.2实验方法

每个健康人群血清样本制成三个测试样本（对照、添加甘油三酯、添加甘油三酯与回收内毒素）。每个测试本分四次。

1.3样本

对照样本：用 0.9mL健康人群血清样本（1-6号）+0.1mL 生理盐水混合而成。

干扰样本1：用0.9mL健康人群血清样本（1-6号）+0.1mL 39.6mmol/L甘油三酯标准混合，添加浓度为3.96mmol/L 。

回收样本1：取90μL干扰样本+10μL 0.5EU/mL 内毒素溶液→100μL内含外加0.05EU/mL 内毒素和和3.96mmol/L甘油三酯的血清。

干扰样本2：用0.9mL健康人群血清样本（1-6号）+0.1mL 100mg/dL甘油三酯标准混合，添加浓度为10mg/dL。

回收样本2：取90μ1干扰样本+10μL 0.5EU/mL 内毒素溶液→100μL内含外加0.05EU/mL 内毒素和19.8mmol/L甘油三酯的血清。

1.4血清处理方法

方法1：加热稀释法

对照样本（1-6号）、干扰样本1（1-6号）、回收样本1（1-6号）、干扰样本2（1-6号）、回收样本2（1-6号）各100μL +900μL检查用水→75℃水浴10min→细菌内毒素检测试剂盒测定内毒素含量。

方法2：高氯酸法

对照样本（1-6号）、干扰样本1（1-6号）、回收样本1（1-6号）、干扰样本2（1-6号）、回收样本2（1-6号）各100μL +100μL 0.18N NaOH→37℃水浴5min →100μL 0.32N HClO₄>

方法3：高氯酸-冰醋酸法

对照样本（1-6号）、干扰样本1（1-6号）、回收样本1（1-6号）、干扰样本2（1-6号）、回收样本2（1-6号）各100μL +120μL 0.2moL/L HClO₄ + 80μL>

1.5结果（单位：EU/mL）

我们根据干扰学及回收率试验结果，总结表如下：

（注：临床上经验数据，脂血中血清甘油三脂一般为：3-5mmol/L左右）。

从目测来看，一般脂血血清甘油三脂的浓度1.98-3.96mmol/L范围值时血清呈轻微浑浊泛白，此时用加热稀释法和高氯酸法测定时，干扰偏差低于-28%以下，回收率在50-200%区间外，两种方法均不可用。在般脂血血清甘油三脂的浓度1.98-3.96mmol/L范围值时与甘油三脂浓度值为19.8mmol/L时，采用我们的高氯酸-冰醋酸法干扰偏差为7.72%以内，回收率依然在90%-110%区间。这证明，检测脂血病人血清时采用高氯酸-冰醋酸法最好。

实施例3

1 溶血样品：

临床上健康人血液中血红蛋白值为120g/L，健康人血清中不含血红蛋白，轻微溶血的血清中血红蛋白值为1.2g/L,中度溶血的血清中血红蛋白值为2.4g/L，严重溶血的血清中血红蛋白值为4.8g/L。从目测来看，轻微溶血的血清中血红蛋白浓度1.2g/L以内值时血清为淡红色。我们试验中用了数学级2倍加量法，试验用血清样本为轻微溶血血清的血红蛋白浓度数值的1倍，2倍，4倍，即浓度值为1.2g/L、2.4g/L、4.8g/L。

1.1 实验要求

所有与试剂直接接触的器具应无菌无热原污染

1.2实验方法

取六个健康人血清样本。每个健康人群血清样本制成三个测试样本（对照、添加血红蛋白、添加血红蛋白与内毒素）。每个样本测试四个平行管。

1.3样本

对照样本：用 0.9mL健康人群血清样本（1-6号）+0.1mL 生理盐水混合而成。

干扰样本1：用0.9mL健康人群血清样本（1-6号）+0.1mL 12g/L血红蛋白标准混合，添加浓度为1.2g/L。

回收样本1：取90μL干扰样本+10μL 0.500EU/mL 内毒素溶液→100μL内含外加0.050EU/mL 内毒素和 1.2g/L血红蛋白的血清。

干扰样本2：用0.9mL健康人群血清样本（1-6号）+0.1mL 24g/L血红蛋白标准混合，添加浓度为2.4g/L。

回收样本2：取90μL干扰样本2+10μL0.500EU/mL 内毒素溶液→100μL内含外加0.050EU/mL 内毒素溶液和2.4g/L血红蛋白的血清。

干扰样本3：用0.9mL健康人群血清样本（1-6号）+0.1mL 48g/L血红蛋白标准混合，添加浓度为4.8g/L。

回收样本3：取90μL干扰样本3+10μL 0.500EU/mL 内毒素溶液→100μL内含外加0.050EU/mL 内毒素溶液和 4.8g/L血红蛋白的血清。

1.4血清处理方法

方法1：加热稀释法

对照样本（1-6号）、干扰样本1（1-6号）、回收样本1（1-6号）、干扰样本2（1-6号）、回收样本2（1-6号）、干扰样本3（1-6号）、回收样本3（1-6号）各100μL +900μL检查用水 →75℃水浴10min→细菌内毒素检测试剂盒测定内毒素含量。

方法2：高氯酸法

对照样本（1-6号）、干扰样本1（1-6号）、回收样本1（1-6号）、干扰样本2（1-6号）、回收样本2（1-6号）、干扰样本3（1-6号）、回收样本3（1-6号）各100μL +100μL 0.18N NaOH→37℃水浴5min →100μL 0.32N HClO₄>

方法3：高氯酸-冰醋酸法

对照样本（1-6号）、干扰样本1（1-6号）、回收样本1（1-6号）、干扰样本2（1-6号）、回收样本2（1-6号）、干扰样本3（1-6号）、回收样本3（1-6号）各100μL +120μL 0.2moL/L HClO₄ +80μL>

1.5结果（单位：EU/mL）

我们根据干扰学及回收率试验结果，总结表如下：

（注：一般临床上经验数据经验数据，轻微溶血的血清中血红蛋白值为1.2g/L,中度溶血的血清中血红蛋白值为2.4g/L，严重溶血的血清中血红蛋白值为4.8g/L）。（查别人文献资料，轻微：1.45g/L；中度：2.5g/L严重：5.5g/L）

结论：轻微溶血血清中血红蛋白浓度为0.8g/L-1.2g/L以内时，血清为淡红色，此时用加热稀释法和高氯酸测定，干扰偏差高至2000%以上，回收率在50-200%区间外，两种方法均不可处理溶血血清；当轻微溶血血清中血红蛋白浓度为0.8g/L-1.2g/L以内时，中度溶血的血清中血红蛋白浓度为2.4g/L值时，血清中血红蛋白的浓度为4.8g/L值时，采用了我们研制发明的高氯酸-冰醋酸法，干扰偏差和回收率又在依然在较好的范围干扰偏差小于10%，回收率在90-110%区间。

通过三种方法比较，溶血血清采用高氯酸-冰醋酸法处理最好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。