五彩络石的组培快繁方法

摘要

本发明公开了一种五彩络石的组培快繁方法，包括：消毒灭菌：以五彩络石的叶为外植体，进行消毒灭菌；愈伤组织的诱导：将消毒后的外植体接种于诱导培养基中进行培养，得愈伤组织；分化培养：将愈伤组织接入分化培养基中进行培养，得小芽；壮苗培养：将所述的小芽接入壮苗培养基进行培养，得无根幼苗；生根培养：将所述的无根幼苗接入生根培养基进行培养；炼苗及移栽：生根培养一段时间后进行炼苗移栽。本研究以五彩络石叶片为外植体，从外植体的消毒、愈伤组织的诱导、愈伤组织的分化培养、小苗的壮苗培养、幼苗的生根培养等几方面进行了系统研究，以期为快速繁殖优良的五彩络石种苗提供技术支持，满足市场对五彩络石的日益需求。

说明书

技术领域

本发明涉及五彩络石的繁殖方法，尤其涉及一种五彩络石的组培快繁方法。

背景技术

五彩络石(Trachelospermum jasminoides‘Variegatum’)是夹竹桃科(Apocynaceae)络石属(Trachelospermun)常绿木质藤本，叶椭圆形至卵椭圆形，整个植株叶片由粉色叶、白色叶、白底绿斑叶、绿底白斑叶和绿色叶组成，冬天以褐红色为主，叶色丰富，色彩斑斓，酷似花，非常漂亮，且观赏期长，是攀援、垂直等立体绿化的好材料，同时，其抗性较强，喜阳耐高温、且耐寒、耐湿，正是这些特性吸引了广大苗商。在众多的优良地被植物中，五彩络石以其分布广、叶色五彩缤纷、观赏期长、具多种用途而受到人们的青睐，是有较大市场潜力的彩叶地被植物之一，有广阔的市场发展前景。

五彩络石的繁殖方法有扦插繁殖、组织培养等。运用扦插繁殖的方法进行扩繁，速度比较慢，繁殖系数较低，易造成繁殖的种苗质量不高，而组织培养可以加快五彩络石的繁殖速度，种苗质量较高。我国对五彩络石的组培快繁的研究多以茎段为外植体，本研究以五彩络石叶片为外植体，从外植体的消毒、愈伤组织的诱导、愈伤组织的分化培养、小苗的壮苗培养、幼苗的生根培养等几方面进行了系统研究，以期为快速繁殖优良的五彩络石种苗提供技术支持，满足市场对五彩络石的日益需求。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中的问题，本发明提供了一种五彩络石的组培快繁方法，诱导率、分化率、生根率、移栽成活率等都维持在高水平。

技术方案：本发明所述的五彩络石的组培快繁方法，包括：

(1)消毒灭菌：以五彩络石的叶为外植体，进行消毒灭菌；

(2)愈伤组织的诱导：将消毒后的外植体接种于诱导培养基中进行培养，得愈伤组织；所述的诱导培养基的配方为：MS+BA0.1-0.3mg/L+ZT0.1-0.2mg/L+ NAA1.0-2.0mg/L+蔗糖30-40g/L+琼脂6-8g/L；

(3)分化培养：将愈伤组织接入分化培养基中进行培养，得小芽；

(4)壮苗培养：将所述的小芽接入壮苗培养基进行培养，得无根幼苗；

(5)生根培养：将所述的无根幼苗接入生根培养基进行培养；

(6)炼苗及移栽：生根培养一段时间后进行炼苗移栽。

步骤(2)中，所述诱导培养的条件为：温度20±2℃、黑暗培养。

步骤(3)中，所述的分化培养基的配方为：

MS+BA1.0-1.5mg/L+ZT0.5-1.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+蔗糖30-40g/L+琼脂 6-8g/L。

优选的，所述的分化培养基的配方为：

MS+BA1.4-1.5mg/L+ZT0.5-0.6mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+蔗糖30-40g/L+琼脂 6-8g/L。

所述分化培养的条件为：温度23±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间 10～12h/d。

步骤(4)中，所述壮苗培养基配方为：

MS+BA2.0-2.5mg/L+ZT0.5-1.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+蔗糖30-40g/L+琼脂 6-8g/L。

优选的，所述壮苗培养基配方为：

MS+BA2.0-2.1mg/L+ZT0.8-1.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+蔗糖30-40g/L+琼脂 6-8g/L。

所述壮苗培养的条件为：温度23±2℃、光照强度2000～2500lx、光照时间 12～15h/d。

步骤(5)中，所述生根培养基配方为：1/4MS+ IBA0.1-0.2mg/L+NAA0.2-0.6mg/L+活性炭3-4g/L+蔗糖30-40g/L+琼脂6-8g/L。

优选的，所述生根培养基配方为：1/4MS+

IBA0.1-0.2mg/L+NAA0.2-0.3mg/L+活性炭3-3.5g/L+蔗糖30-40g/L+琼脂 6-8g/L。

所述生根培养的条件为：温度23±2℃、光照强度2000～2500lx、光照时间 12～15h/d。

步骤(6)中，移栽基质由园土、砻糠灰和泥炭按1﹕2﹕(2-4)的体积比混合制成。

有益效果：本发明对五彩络石组织培养流程进行系统研究，特别对愈伤组织的诱导、分化培养、壮苗培养、生根培养、移栽关键环节的培养基质及条件进行优化，使得各培养步骤都能取得非常好的效果，最终培育出高质量的五彩络石植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

本发明中所使用的激素BA即为6-BA。

本发明五彩络石的组培快繁方法，步骤如下：

1.消毒灭菌

供试的五彩络石材料由江苏绿苑园林建设有限公司苗木基地提供，选取生长一年的健壮植株，从植株顶部开始数选取其第2-4叶作为外植体。

将外植体放在流水下反复冲洗20min，加入适量的洗涤剂浸泡20min，边浸泡边振荡，冲洗干净后移至超净工作台进行下一步的消毒处理。

消毒处理为：先用体积浓度75％酒精浸泡5s，用无菌水反复冲洗振荡外植体至少3次，每次冲洗时间不少于3min；再转入质量浓度0.1％的升汞(HgCl₂)>

2.愈伤组织的诱导

愈伤组织诱导的实验过程及结果分析：

实验过程：将经过处理的外植体材料接入不同的培养基上诱导愈伤组织。诱导愈伤组织的培养基配方共设置了10个处理(见表1)，各培养基配方均是在 MS培养基基础上添加不同种类和不同浓度的植物生长调节剂(不同浓度的生长调节剂的单位均为mg/L)，同时添加30-40g/L蔗糖、6-8g/L琼脂，pH值5.8-6.0。每个配方接种10瓶，每瓶接种5个外植体。培养条件为：温度20±2℃、黑暗培养、培养地点无菌培养室。20d后观察愈伤组织萌发情况，40d后统计愈伤组织数量，记录愈伤组织诱导率，愈伤诱导率＝诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数。

表1不同的培养基诱导愈伤组织的结果

处理愈伤组织诱导培养基配方愈伤组织诱导率愈伤组织外观愈伤组织直径1BA0.05+ZT0.1+NAA1.072％致密、褐色4.2mm2BA0.1+ZT0.05+NAA1.060％疏松、白色4.9mm3BA0.1+ZT0.1+NAA1.0100％致密、淡黄绿色6.7mm4BA0.1+ZT0.05+NAA1.074％致密、褐色5.2mm5BA0.05+ZT0.2+NAA2.088％疏松、黄色5.6mm6BA0.3+ZT0.2+NAA1.0100％致密、淡黄绿色6.0mm7BA0.3+ZT0.2+NAA2.0100％致密、淡黄绿色8.0mm8BA0.3+ZT0.05+NAA2.095％疏松、褐色4.2mm9BA0.2+ZT0.05+NAA2.090％疏松、褐色4.2mm10BA0.2+ZT0.2+NAA1.5100％致密、淡黄绿色7.4mm

结果分析：从表1可看出，不同的培养基诱导愈伤组织其愈伤组织诱导率、愈伤组织的外观表现及大小有所不同。处理3、处理6、处理7和处理10，20d 后发现在接种材料的伤口处有愈伤组织萌发，40d后其愈伤组织诱导率达100％，且愈伤组织外观表现良好，大小约6-8mm，质地致密，色泽为淡黄绿色。而其他6个处理20d后观察发现，无愈伤组织萌发，40d后其愈伤组织诱导率参差不齐，其中，处理8和处理9的愈伤组织诱导率较高，分别为95％和90％，其次是处理5，愈伤组织诱导率为88％，其余处理的愈伤组织诱导率均较低；另外，处理8、处理9和处理5这三个处理其愈伤组织的外观表现较差，质地疏松、色泽为褐色或黄色，且直径相对较小(4.2-5.6mm)，因此这三种培养基不适宜作为诱导率愈伤组织的良好培养基。愈伤组织外观表现的好坏直接关系着愈伤组织分化培养丛生芽的好坏，质地致密、色泽淡黄绿色的愈伤组织易分化培养出丛生芽，而质地疏松、色泽褐(黄)色或白色的愈伤组织不易分化培养出丛生芽，分化率较低。综上所述，适宜的培养基可以使五彩络石的愈伤组织诱导率较高，诱导出的愈伤组织外观表现良好，由本研究可知，五彩络石适宜的愈伤组织培养基处理为处理3、处理6、处理7和处理10。

结论：综合考虑愈伤组织诱导率、愈伤组织萌发时间、愈伤组织外观表现及愈伤组织的大小，认为诱导愈伤组织适宜的培养基配方为：MS+BA(0.1-0.3mg/L) +ZT(0.1-0.2mg/L)+NAA(1.0-2.0mg/L)+蔗糖30-40g/L+琼脂6-8g/L。

3.愈伤组织的分化培养

愈伤组织分化培养的实验过程及结果分析：

实验过程：选用优化的愈伤组织培养基进行愈伤组织的诱导后，将诱导出的愈伤组织切成2-3mm的小块，接入分化培养基中进行分化培养。培养条件为：温度23±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间10～12h/d、培养地点无菌培养室。分化培养基配方设置了10个处理(见表2)，各培养基配方均是在MS培养基基础上添加不同种类和不同浓度的植物生长调节剂(不同浓度的生长调节剂的单位均为mg/L)，同时添加30-40g/L蔗糖、6-8g/L琼脂，pH值5.8-6.0。每个分化培养基配方接种10瓶，每瓶接种5个愈伤组织小块。经过分化培养后在愈伤组织上萌发出一定数量的小芽，一个月后对分化的小芽进行观察和统计，计算出分化率(分化出芽的材料数/接种的材料数)。

表2不同的培养基分化培养的结果

结果分析：从表2可看出，不同的培养基对愈伤组织进行分化培养其分化率、分化芽的外观表现有所不同。处理3、处理4、处理6和处理7，经过愈伤组织分化培养后，分化率达96％以上，且分化芽外观表现良好，分化的小芽高度约为 3-4mm，小芽嫩绿色、健壮。其他6个处理，分化率相对较低，分化的小芽外观表现不良，小芽高度较低，低于3mm，且小芽色泽为黄褐(绿)色或淡黄色，小芽均表现为弱小状。综上所述，适宜的培养基可以使五彩络石的愈伤组织分化出较多的小芽、小芽生长良好，由本研究可知，五彩络石适宜的分化培养基处理为处理3、处理4、处理6和处理7。

结论：综合考虑分化率、分化芽的外观表现(高度、色泽、强壮度)，认为愈伤组织分化培养的适宜培养基配方为：MS+BA(1.0-1.5mg/L)+ZT (0.5-1.0mg/L)+NAA(0.1-0.2mg/L)+蔗糖30-40g/L+琼脂6-8g/L。经过几次分化培养后，达到6-7倍左右时，进行壮苗培养。

4.壮苗培养

壮苗培养的实验过程及结果分析：

实验过程：由于分化培养出的小芽比较幼嫩，有必要进行一定的壮苗培养。选用优化的分化培养基培养后产生小芽，将小芽切下后接种壮苗培养基上进行壮苗培养。培养条件为：温度23±2℃、光照强度2000～2500lx、光照时间12～15h/d、培养地点无菌培养室。壮苗培养基配方设置了11个处理(见表3)，各培养基配方均是在MS培养基基础上添加不同种类和不同浓度的植物生长调节剂(不同浓度的生长调节剂的单位均为mg/L)，同时添加30-40g/L蔗糖、6-8g/L琼脂，pH 值5.8-6.0。每个壮苗培养基配方接种10瓶，每瓶接种5株生长一致的小芽。一个月后观察幼苗生长情况。

表3不同的壮苗培养基对五彩络石小芽的影响

注：幼苗生长状况用高度、健壮度、色泽来表示；健壮度：++++健壮，+++较健壮，++生长一般，+ 细弱；色泽：***深绿色，**淡绿色，*黄绿色。

结果分析：将分化培养基上的小芽切下后接种在不同的壮苗培养基上进行壮苗培养，结果见表3。由表3可知，处理3、处理4、处理7、处理8和处理9，幼苗生长最好，生长高度较高，达7.0-8.0cm，均表现为健壮和深绿色；其余6 个处理，幼苗高度≤6.6cm，且幼苗外观表现一般，健壮度大部分表现为生长一般(除处理10为较健壮)和细弱，色泽为淡(黄)绿色。通过组培培养出的幼苗高度高、健壮度高、色泽深绿色，可提高出瓶移栽的成活率。综上所述，适宜的壮苗培养基可以使五彩络石的小芽变成健壮、且色泽好的幼苗，由本研究可知，五彩络石适宜的壮苗培养基处理为处理3、处理4、处理7、处理8和处理9。

结论：综合考虑幼苗高度、幼苗健壮度和色泽，认为五彩络石壮苗培养的适宜培养基配方为：MS+BA(2.0-2.5mg/L)+ZT(0.5-1.0mg/L)+NAA(0.1-0.2mg/L) +蔗糖30-40g/L+琼脂6-8g/L，幼苗生长健壮、色泽深绿，高度可达7-8cm。

5.生根培养

生根培养的实验过程及结果分析：

实验过程：选择优化的壮苗培养基对五彩络石的小芽进行壮苗培养后，把健壮的五彩络石无根幼苗转移到生根培养基上培养。培养条件为：温度23±2℃、光照强度2000～2500lx、光照时间12～15h/d、培养地点无菌培养室。生根培养基配方设置了12个处理(见表4)，各培养基配方是在1/4MS培养基基础上添加不同种类和不同浓度的植物生长调节剂(单位均为mg/L)及活性炭(单位均为g/L)，同时添加30-40g/L蔗糖、6-8g/L琼脂，pH值5.8-6.0。每个生根培养基配方接种 10瓶，每瓶接种5株的幼苗茎段(生长一致，高度约为3-4cm)。2周后观察幼苗根系萌发情况，30d后统计生根生长情况。

表4不同的培养基对生根培养的影响

注：根系生长状况用长度、健壮度、色泽来表示；健壮度：++++健壮，+++较健壮，++生长一般，+细弱；色泽：***白色，**淡黄色，*黄褐色。

从表4可看出，不同的生根培养基培养五彩络石无根幼苗其根系生长状况有所不同。处理3、处理5、处理7、处理8和处理9这五个处理，2周后观察发现有白色根生出，生根率达100％，30d后观察发现根系生长健壮，长度达3-4cm，每苗可分化出4-5条根，根系色泽为白色。而其他7个处理2周后观察发现，无根系萌发，30d后观察发现根系生长状况较差，根系长度较短，≤2.2cm，每苗可分化出的根系数量较少，≤3.2根，且大部分根系表现为生长一般或细弱(除处理10为较健壮)，色泽为淡黄色或黄褐色。根系数量多、长度长、健壮度高、色泽白色的组培苗移栽时成活率高。综上所述，适宜的生根培养基可以使五彩络石的无根幼苗长出较多的根系，且根系健壮度较高、色泽好，由本研究可知，五彩络石适宜的生根培养基处理为处理3、处理5、处理7、处理8和处理9

结论：综合考虑根系数量、根系长度、健壮度和色泽，认为五彩络石生根培养的适宜培养基配方为：1/4MS+IBA(0.1-0.2mg/L)+NAA(0.2-0.6mg/L)+活性炭(3-4g/L)+蔗糖30-40g/L+琼脂6-8g/L，2周后可生出白色的根，生根率达 100％，30d后根系生长健壮，长度达3-4cm，每苗可分化出4-5条根。40-50d后即可进行炼苗移栽。

二、五彩络石的炼苗及移栽

试验过程：五彩络石组培苗炼苗可先在温度20±2℃的温室内拧松瓶盖放置 7d-10d天，然后进行温床过渡移栽。过渡苗床(即温床)建在普通单体的塑料大棚内，床宽1.2m左右，床四周砌高30cm，床底整平，栽培基质设置为10个处理，具体见表5。栽培基质须经过灭菌，充分混匀后使用。移栽时，将幼苗从瓶内取出，用清水将五彩络石组培苗根部的固体培养基清洗干净，同时应尽量减少伤根。种入苗床后，选择清洁水浇灌，每两周喷1次质量百分比75％的百菌清可湿性粉剂稀释1000倍～1500倍药液进行消毒，连续喷3-4次。移栽初期要特别注意保持苗床和空气湿度，湿度保持在85％左右，温度23±2℃，前期应进行遮阴7d-10d；一般需全封闭管理10d左右，根据情况在20d左右可以逐步通风，并除去覆盖物。40d后统计成活率。

表5不同的栽培基质处理对五彩络石组培苗成活率的影响

处理栽培基质的成分体积比成活率(％)1园土：砻糠灰：泥炭1:2:174.82园土：砻糠灰：泥炭1:2:295.03园土：砻糠灰：泥炭1:2:397.24园土：砻糠灰：泥炭1:2:498.55园土：砻糠灰：泥炭1:2:580.26园土：砻糠灰：泥炭0:2:374.07园土：砻糠灰：泥炭1:0:375.68园土：蛭石：泥炭1:1:162.49园土：蛭石：泥炭1:3:169.510园土：蛭石：泥炭1:4:168.6

结果分析--从表5可知，不同的栽培基质处理对五彩络石组培苗成活率的影响亦不同。从表5中可看出，栽培基质的成分以园土、砻糠灰和泥炭组合较好，成活率均高于以园土、蛭石和泥炭为栽培基质的组合；以园土、砻糠灰和泥炭为栽培基质的组合中，其中三者的体积比为1:2:2、1:2:3和1:2:4时成活率最高，分别为95.0％、97.2％和98.5％，显著高于其他基质处理。

结论--对五彩络石的组培苗进行移栽，应选择适宜的移栽基质，本研究表明，五彩络石组培苗移栽基质的成分以园土、砻糠灰和泥炭为组合最好，三者按1﹕ 2﹕(2-4)的体积比混合制成，可显著提高其成活率，成活率达95％以上。