一种抗根肿病榨菜细胞质雄性不育杂种的选育方法

摘要

本发明提供了一种抗根肿病榨菜细胞质雄性不育杂种的选育方法，所述方法包括：1)以榨菜常规品种为母本，白菜抗根肿病抗原种为父本进行杂交，获得抗根肿病改良型榨菜父本系；2)以榨菜hau细胞质雄性不育系为母本，所述抗根肿病改良型榨菜父本系为父本进行杂交，获得抗根肿病榨菜细胞质雄性不育杂种；所述榨菜hau细胞质雄性不育系是以天然芥菜型油菜细胞质雄性不育系6‑102A作母本，保持系榨菜6‑170为父本进行杂交制得。使用本发明的选育方法得到的抗根肿病榨菜细胞质雄性不育杂种具有纯度高、抗根肿病的特点，克服了现有榨菜品种中存在感根肿病、连作障碍以及品种退化等缺陷。

说明书

技术领域

本发明涉及十字花科蔬菜育种技术领域，更具体地，涉及一种抗根肿病榨菜细胞质雄性不育杂种的选育方法。

背景技术

十字花科蔬菜杂种优势明显，杂种优势利用的主要途径为自交不亲和性和雄性不育性，其中细胞质雄性不育是理想的授粉控制系统。通过利用不同来源的雄性不育因子，选育个体在发育过程中对环境和个体发育稳定的菜心胞质雄性不育系，并加以繁育和利用，配制出综合性状优良的杂种一代。十字花科蔬菜杂种一代利用工作已广泛地开展，特别是在亚洲国家，如中国、日本和韩国等，目前采用自交不亲和系或自交亲和系的方法进行杂种一代生产居多,但是该方法存在着不亲和性难于保持或自交多代易发生双亲生活力衰退和容易出现假杂种等问题。利用细胞质雄性不育系制种，可以获得高质量的杂交后代。目前生产上利用的十字花科蔬菜细胞质雄性不育类型主要为油菜波里马细胞质雄性不育(polCMS)和萝卜胞质雄性不育(ogu CMS),但油菜波里马细胞质雄性不育(pol CMS)存在不育性不稳定，受不良温度影响易出现花粉量少、种子纯度低的缺点；ogu CMS存在低温黄化及蜜腺退化等缺点，目前已经得到改良。因此挖掘和创制新的细胞质雄性不育类型，解决细胞质单一问题，拓宽现有种质资源，具有重要的意义。

Pol CMS是华中农业大学傅廷栋1972年发现,在油菜以及十字花科蔬菜中广泛利用，彭谦等利用甘蓝型油菜雄性不育系湘油A的雄性不育株为不育源母本，用四九-19号菜心为父本，育成了菜心异源胞质雄性不育系002-8-20A及其保持系。自Ogura1968年发现oguCMS以来，国内外学者对该不育材料进行了大量的回交转育，目前已转育到油菜、甘蓝、白菜、青花菜等十字花科蔬菜中。方智远1998年从美国引进CMS625、CMS629等6份新改良后的Ogu CMS材料，并用30余份甘蓝自交系和20余份青花菜自交系进行转育，CMS625、CMS629后代表现低温下叶片不黄化、不育花正常开放等优点，具有较好的应用前景。

芥菜起源于中国，由于芥菜花器官小，因此CMS是芥菜杂种优势利用的主要途径。目前国内外报道的芥菜细胞质雄性不育类型主要有芥菜hau CMS(万正杰等)、Moricandiaarvevsis CMS(Prakash et al)、芥菜oxa CMS(史华清等)和榨菜CMS(陈竹君等)。芥菜hauCMS是华中农业大学1999年发现的一种新的细胞质雄性不育类型，通过对芥菜hau CMS的不育性评价、线粒体不育基因的分子鉴定、不育基因克隆、转基因功能验证及线粒体基因组测序，明确了芥菜hau CMS是一种十字花科作物胞质不育新类型。陈竹君等(1993)以1983年从中国农科院蔬菜所引进的(芥菜×结球白菜)种间杂种不育源，回交转育获得榨菜细胞质雄性不育系。在此基础上，利用同源序列法获得该不育系的不育基因orf220。

发明内容

为了克服现有榨菜杂交种生产上出现的不足，本发明提供了一种抗根肿病榨菜细胞质雄性不育杂种的选育方法，包括：

1)以榨菜常规品种为母本，白菜抗根肿病抗原种为父本进行杂交，获得抗根肿病改良型榨菜父本系；

2)以榨菜hau细胞质雄性不育系为母本，所述抗根肿病改良型榨菜父本系为父本进行杂交，获得抗根肿病的榨菜细胞质雄性不育杂种；

所述榨菜hau细胞质雄性不育系是以天然芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A作母本，保持系榨菜6-170为父本进行杂交制得。

本发明以不育性稳定的榨菜细胞质雄性不育系即榨菜hau细胞质雄性不育系为母本，以抗根肿病核心榨菜自交系为父本，提供了榨菜细胞质雄性不育杂交种的选育、繁殖和制种方法，为芥菜类蔬菜杂交品种选育提供新的种质资源。

其中，使用上述选育方法得到的榨菜hau细胞质雄性不育系的不育性十分稳定和彻底，不受环境影响，在中国甘肃兰州和湖北武汉连续五年10代种植并进行育性鉴定表明，其育性均表现0级，不育株率和不育度均为100％，且没有任何死蕾和苗期黄化等现象。

在一个优选实施方式中，榨菜hau细胞质雄性不育系的选育方法为：选择天然芥菜型油菜细胞质雄性不育系6-102A作母本，用保持系榨菜6-170作父本，杂交获得F1，通过育性鉴定和连续回交，得到遗传稳定的榨菜细胞质雄性不育系和保持系，繁殖所述榨菜细胞质雄性不育系，即得上述榨菜hau细胞质雄性不育系，即榨菜细胞质雄性不育系CMS6-170。

在一个优选实施方式中，步骤1)具体为：

以榨菜常规品种为母本，利用白菜抗根肿病抗原种为父本，杂交获得种间杂种F₁，以所述母本为轮回亲本，经过回交，获得抗根肿病改良型榨菜父本系。

其中，榨菜常规品种可以为本领域中常规的品种，优选为榨菜常规品种“永安小叶”。

其中，白菜根肿病抗原种优选为白菜抗根肿病4号生理小种。

在一个优选实施方式中，步骤2)具体为：

以榨菜hau细胞质雄性不育系为母本，所述抗根肿病改良型榨菜父本系为父本进行杂交，利用芥菜雄性不育基因orf288和抗根肿病基因对杂交后的杂种进行鉴定，确定抗根肿病的榨菜细胞质雄性不育杂种。

其中，上述方法中母本与父本的行比均优选为4:2。

本发明的方法优选均在秋冬播隔离条件下进行。

使用本发明的选育方法得到的抗根肿病榨菜细胞质雄性不育杂种具有纯度高、抗根肿病的特点，克服了现有榨菜品种中存在感根肿病、连作障碍以及品种退化等缺陷，采用本发明选育的榨菜hau细胞质雄性不育系的繁殖程序和杂交种的制种程序具有可操作性，生产的榨菜杂交品种纯度高(利用的榨菜不育系不育度为100％)，优势明显。本发明提供的选育方法简单易行，能够获得纯度高、抗根肿病的榨菜杂交种。

附图说明

图1为根据本发明实施例1中技术路线图。

图2为根据本发明实施例中榨菜hau细胞质雄性不育系的花器官图；本发明选育的榨菜hau细胞质雄性不育系兰W905和榨菜保持系“6-170”(兰W906)花器官和单株图；

图中：A、B是榨菜hau细胞质雄性不育系和榨菜保持系花器官图；C、D是本发明选育的抗根肿病榨菜杂交种利用的2个亲本材料：抗根肿病材料“兰W109”和父本系“永安小叶”；E是榨菜hau CMS不育线粒体基因orf288的PCR检测图(兰W301-304)；F是榨菜hau细胞质雄性不育系兰W905与榨菜自交系永安小叶进行杂交得到F1榨菜根肿病相关的分子标记检测图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。

实施例1 榨菜抗根肿病细胞质雄性不育杂交种的选育

本实施例选育方法的技术路线图如图1所示。

(1)以榨菜常规品种“永安小叶”(该育种材料的种子已于申请日前公开销售)为母本，利用白菜抗根肿病4号生理小种(已公开销售)为父本，经过远缘杂交获得种间杂种F1，以常规品种“永安小叶”为轮回亲本，经过回交，获得抗根肿病改良型榨菜父本系“永安小叶”。

(2)用步骤(1)中得到的榨菜抗根肿病榨菜品种“改良型永安少叶”为父本，以榨菜hau细胞质雄性不育系作母本，杂交配组得到榨菜雄性不育杂种F1。

(3)用步骤(2)得到的杂种F1作材料，利用不育基因orf288和抗根肿病连锁的分子标记鉴定抗根肿病雄性不育杂交种。

其中，榨菜hau细胞质雄性不育系的选育方法为：

a)用天然芥菜型雄性不育株6-102A(保藏号：CCTCC NO：P200504，已在中国专利申请CN200510086942.7中公开)作母本，以保持系榨菜常规品种6-170(兰W906已公开销售)作父本，杂交得到杂种F1；

b)对a)的杂种F1进行育性鉴定，用步骤a)得到的F1植株为母本，以榨菜常规品种6-170(保持系)作父本，杂交得到BC1F1细胞质雄性不育系CMS；

c)对BC1F1进行育性鉴定，用步骤b)得到的BC1F1CMS作母本，以榨菜常规品种6-170(保持系)作父本，得到BC2F1细胞质雄性不育系；

d)对BC2F1细胞质雄性不育系进行育性鉴定，用步骤c)得到的BC2F1细胞质雄性不育系为母本，以榨菜常规品种6-170(保持系)作父本，得到BC3F1细胞质雄性不育系；

e)对BC3F1细胞质雄性不育系进行育性鉴定，用步骤d)得到的BC3F1细胞质雄性不育系为母本，以保持系6-170作轮回亲本连续回交六代，得到BC8榨菜细胞质雄性不育系CMS6-170，即W905。

实施例2 榨菜细胞质雄性不育系A的繁殖以及杂交种制种

在中国湖北武汉秋季播(9月初)或中国甘肃兰州夏播(每年的4月底)隔离条件下，采用榨菜细胞质雄性不育系A为母本，“6-170(兰W906)”为父本，按父本：母本为2：4的行比(行比)繁殖所述的榨菜细胞质雄性不育系A，其他栽培管理与普通榨菜的繁殖相同。

将繁殖后榨菜细胞质雄性不育系A与抗根肿病榨菜自交系“永安小叶”杂交，得到榨菜细胞质雄性不育杂交品种。

其中，图2中：

A：是指榨菜细胞质雄性不育系兰W905，说明榨菜不育系是不育性稳定，是多年来自主选育而成的，可以作为核心亲本用于杂交育种。

B：为细胞质雄性不育系兰W905的保持系，主要是繁殖该不育系的正常的可育自交系。

C、D是本发明选育的抗根肿病榨菜杂交种利用的2个亲本材料：抗根肿病材料“兰W109”和父本系“永安小叶”；目的是通过杂交和回交获得抗根肿病的“永安小叶”父本系，将材料“兰W109”携带的根肿病抗原基因通过杂交技术转育到综合性状优良的榨菜目标亲本“永安小叶”。

E是榨菜hau CMS不育线粒体基因orf288的PCR检测图(兰W301-304)，由于利用的原始母本为自主选育并申报专利的榨菜细胞质雄性不育系兰W905，通过已经克隆的榨菜hau CMS的不育基因orf288的检测，确定榨菜杂交种携带有母本兰W905的不育基因，符合细胞质母性遗传规律。

F是榨菜根肿病相关的分子标记检测图。表示获得的杂交种F1(兰W905×改良的永安小叶)的若干单株均有抗根肿病4号生理小种的扩增带型，也就是杂交种携带有父本抗原基因，说明抗根肿病性状(4号生理小种)是显性遗传的。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。