DGM1蛋白在提高植物根毛生成能力中的应用

摘要

本发明公开了一种DGM1蛋白在提高植物根毛生成能力中的应用。本发明提供了DGM1蛋白或其编码基因在提高植物根毛生成能力中的应用；所述DGM1蛋白可为序列表中序列2‑6中任一的蛋白质。本发明将AtDGM1在植物中过表达，发现可显著提高植物根毛长度和密度，且不改变植物其他的生长和发育性状。由于AtDGM1基因直接来源于植物，因而在生物安全方面具有较小的风险性。另外，由于AtDGM1基因在其他重要农作物如水稻，大豆，油菜和番茄中都有同源基因，因而在进行转基因植物构建时具有更多的选择余地。本发明为利用基因工程手段培育高效吸收土壤养分的农作物新品种提供基因资源，可用于培育高效吸收土壤养分的农作物新品种。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种DGM1蛋白在提高植物根毛生成能力中的应用。

背景技术

根毛的表面积约占植物根系总表面积的70％，是根系吸收水分和养分最活跃的组织，并且是植物根系感受外界信号的重要组成部分。根毛是根部成熟区特定的表皮细胞外伸形成的单细胞、管状突出物。根毛作为植物根与土壤的直接接触部分，其数目和长度的增加可以增大植物根表皮细胞与土壤的接触面积，有助于提高根在土壤中的稳定性、根与微生物的互作及根对土壤营养的吸收。根毛还可以通过分泌大量的有机酸，酶类，粘液和次生代谢物质来影响根系周围环境。研究表明，通过增加根毛的密度和长度，可以改善植物的营养吸收效率。在拟南芥中，根毛细胞命运的决定与其所处的位置有关。位于两个皮层细胞之间的表皮细胞(生毛细胞)能够分化形成根毛，而位于一个皮层细胞之上的表皮细胞(非生毛细胞)不能发育成根毛。

当环境中营养缺乏时(比如缺磷、缺铁等)，植物根部会形成许多根毛，以提高植物对营养的吸收效率。这些营养胁迫可以促进根毛的生成和伸长，增加根毛的长度和生长时期，进一步提高生毛细胞形成根毛的比率，或者使非生毛细胞转化成生毛细胞。然而，目前对调控这些过程的分子机制并不明确。阐明调控根毛生长和发育的分子机制不仅有助于我们深入了解植物细胞发育分化的规律，而且能更好的服务于生产实践。本发明在提高植物根毛生成能力(包括根毛数目和长度)，进而将这一方法用于农作物育种方面具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种DGM1蛋白的新用途。

第一，本发明提供了DGM1蛋白或其编码基因在提高植物根毛生成能力中的应用。

其中，所述DGM1蛋白可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为序列表中的序列2的蛋白质(拟南芥来源)；

(A2)氨基酸序列为序列表中的序列3的蛋白质(水稻来源)；

(A3)氨基酸序列为序列表中的序列4的蛋白质(大豆来源)；

(A4)氨基酸序列为序列表中的序列5的蛋白质(油菜来源)；

(A5)氨基酸序列为序列表中的序列6的蛋白质(番茄来源)；

(A7)将序列表中序列2-6中任一所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A8)与(A1)-(A7)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A9)在(A1)-(A8)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

第二，本发明提供了DGM1蛋白或其编码基因在促进植物根毛伸长和/或促进植物根毛密度增加中的应用。其中，所述DGM1蛋白为前文(A1)-(A9)任一所示蛋白质。

第三，本发明提供了一种培育根毛生成能力更强的植物的方法。

本发明所提供的培育根毛生成能力更强的植物的方法，具体可包括使受体植物中DGM1蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。其中，所述DGM1蛋白为前文(A1)-(A9)任一所示蛋白质。

第四，本发明提供了一种培育根毛生成能力更强的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育根毛生成能力更强的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入DGM1蛋白的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比根毛生成能力更强。其中，所述DGM1蛋白为前文(A1)-(A9)任一所示蛋白质。

第五，本发明提供了一种培育根毛生长度更长和/或密度更大的植物的方法。

本发明所提供的培育根毛生长度更长和/或密度更大的植物的方法，具体可包括使受体植物中DGM1蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。其中，所述DGM1蛋白为前文(A1)-(A9)任一所示蛋白质。

第六，本发明提供了一种培育根毛生长度更长和/或密度更大的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育根毛生长度更长和/或密度更大的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向受体植物中导入DGM1蛋白的编码基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比根毛生长度更长和/或密度更大。其中，所述DGM1蛋白为前文(A1)-(A9)任一所示蛋白质。

在上述应用或方法中，所述DGM1蛋白的编码基因具体可是如下任一所述的DNA分子：

(B1)序列表中序列1的第156-1778位所示的DNA分子；

(B2)序列表中序列1所示的DNA分子；

(B3)在严格条件下与(B1)或(B2)限定的DNA分子杂交且编码所述DGM1蛋白的DNA分子；

(B4)与(B1)-(B3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述DGM1蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列1为拟南芥AtDGM1基因，第156-1778位为ORF。序列1编码序列表中序列2所示的蛋白质。

在所述方法中，所述DGM1蛋白的编码基因可通过含有所述DGM1蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA-1300-221、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组载体中启动所述DGM1蛋白的编码基因转录的启动子为CaMV35S启动子。

更加具体的，所述重组表达载体为将所述DGM1蛋白的编码基因插入到pZH01载体的多克隆位点处(BamH I和Sac I)所得的重组质粒。

在上述方法中，将携带有所述DGM1基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

进一步，所述双子叶植物可为十字花科植物或豆科植物或茄科植物；所述单子叶植物可为禾本科植物。

更加具体的，所述十字花科植物为拟南芥或油菜；所述豆科植物为大豆；所述茄科植物为番茄；所述禾本科植物为水稻。

本发明通过将类核酸酶基因AtDGM1在植物中进行过表达，来显著提高植物根毛长度和密度，且不改变植物其他的生长和发育性状。另外，由于AtDGM1基因直接来源于植物，因而在生物安全方面具有较小的风险性。最后，由于AtDGM1基因在其他一些重要农作物如水稻，大豆，油菜和番茄中都有同源基因，因而在进行转基因植物构建时具有更多的选择余地。本发明为利用基因工程手段培育高效吸收土壤养分的农作物新品种提供基因资源，可用于培育高效吸收土壤养分的农作物新品种。

附图说明

图1为分别提取WT和35S::AtDGM1植株四个纯合株系叶片和根部的RNA，检测DGM1基因的表达量。A为叶片；B为根部。图中显示3次生物学重复实验的统计结果，误差线代表SD，将正常生长条件下的WT的基因表达值定为1，*表示与同样条件下的WT相比有显著差异(P<0.05，t-test)。

图2为AtDGM1过表达转基因植株在正常条件下的生长表型。A为野生型(WT)和转基因植株的种子在相应的培养基上直接萌发生长7天时的照片(7天大小的拟南芥幼苗形态)。B为将A图中的植物根尖在解剖镜下放大观察(7天大小的拟南芥幼苗主根根尖的根毛形态)。4-5、9-2、11-4、18-12代表4个T3代35S::AtDGM1转基因拟南芥株系。

图3为野生型拟南芥和35S::AtDGM1植株的根毛长度以及根毛密度统计结果。A为野生型拟南芥和35S::AtDGM1植株的根毛长度的统计图；B为Col-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)和35S::AtDGM1的根毛密度的统计图。选取图2中B所示的植物根尖向上第3mm的区域进行根毛统计分析。每个样品取20到30棵根。图中显示3次生物学重复实验的统计结果，误差线代表SD，*表示与同样条件下的WT相比有显著差异(P<0.05，t-test)。

图4为不同物种中DGM1的氨基酸序列比对。基因物种标注在图左边，紧接着的数字代表氨基酸的编号。比对是利用CLUSTAL W2程序进行的，再用Boxshade着色。相同或相似的氨基酸用黑色和灰色背景显示。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

农杆菌菌株GV3101：Clontech公司产品。

Columbia-0生态型拟南芥(Col-0)：Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)产品。

pZH01载体：将pCAMBIA1301载体的GUS(β-葡萄糖苷酸酶)基因(序列7)替换为LUC(荧光素酶)基因(序列8)，pCAMBIA1301的其余序列保持不变得到。其中pCAMBIA1301为Biovector产品，产品目录号为BiovectorpCambia1301，pZH01带有潮霉素抗性基因。

实施例1、AtDGM1基因的获得及其功能验证

为了鉴定参与调控植物根毛发育的重要基因，本发明的发明人进行了根毛异常的拟南芥突变体筛选。通过对拟南芥种子突变库的筛选，得到一个正常条件下根毛形成增加的突变体hps5。基因克隆表明HPS5编码乙烯受体ERS1。通过对hps5和乙烯不敏感突变体ein3等的转录组比较分析，发明人鉴定得到了一系列位于乙烯下游参与根毛发育过程的靶基因，并证明EIN3可以直接结合到这些根毛相关的基因的启动子上，提高这些靶基因的表达水平，从而增加了根毛的形成。这些基因大部分是编码细胞壁蛋白，细胞壁修饰酶类，质子泵，茉莉酸信号和合成相关的蛋白，以及一些功能未知的蛋白。但是，这些靶基因调控根毛发育的分子机制并不清楚。因此，进一步深入研究这些基因的相关表型及功能，有助于鉴定新的参与植物根毛发育的分子组分。于是发明人构建了功能不同的基因的过表达植株，发现其中一个基因(基因编号：At4g29780)过表达后能显著提高根毛的生成能力。发明人将该基因命名为AtDGM1(DUO>GEN>MAO>

一、35S::AtDGM1转基因植株的构建

为了获得DGM1基因过表达的植株，发明人构建了用CaMV 35S(Cauliflowermosaic virus 35S)启动子驱动的野生型AtDGM1基因的表达载体(35S::AtDGM1)，用于植物转化。从Col-0野生型拟南芥中提取总DNA，以此为模板，引物DGM1-35S-F和DGM1-35S-R克隆出AtDGM1基因序列，将克隆出的序列连接到pZH01载体CaMV 35S启动子后的BamH I/Sac I酶切位点。构建好的载体用内切酶BamHI和SacI进行检测，能够切出1.9KB的目的片段，表明构建的载体是正确的。pZH01载体自身带有一个潮霉素抗性基因。

DGM1-35S-F：

5’-CGGGGGACTCTAGAGGATCCCATAAAACTCAAAAATCTTTGGTC-3’(含有BamHI酶切位点)；

DGM1-35S-R：

5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCACTTAAGAGGTTTCAGATTCAATTTG-3’(含有SacI酶切位点)

1、重组表达载体的制备及验证

(1)PCR条件为：

反应体系为50μL

(2)质粒线性化处理

37℃酶切1h，电泳检测酶切是否完全，切胶回收线性质粒和PCR产物。

(3)回收：采用天根公司的回收试剂盒(货号DP209-03)

(4)连接

(5)转化及鉴定

将连接产物转化DH5α大肠感受态细胞。将连接产物加入100μL感受态细胞中，冰上孵育30min，42℃水浴90s，冰上孵育2min。加入700μL LB液体培养基，37℃200rpm培养1h。4000rpm离心去上清，留100μL LB重悬菌体，涂布于抗性LB(含50μg/ml卡那霉素)的平板上，37℃倒置培养16h，挑单菌落。

转化子按照常规分子克隆方法进行鉴定。首先进行菌落PCR鉴定含有目的片段的菌落，然后将该菌落的质粒提出，用内切酶BamH I和Sac I进行检测，能够切出约1.9kb的目的片段，表明构建的载体是正确的。最后将酶切正确的质粒去测序，完全正确的质粒即是35S::AtDGM1融合表达载体。

35S::AtDGM1融合表达载体的结构描述如下：将pZH01载体的酶切位点BamH I和Sac I之间的小片段替换为序列表中序列1所示DNA片段的重组质粒。序列1为AtDGM1基因的基因组序列，其中第156-1778位为ORF。序列1编码序列表中序列2所示的蛋白质。

2、转基因植物的获得

(1)将重组质粒35S::AtDGM1导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。方法为将测序正确的质粒取5μL加入到100μL农杆菌感受态中，冰上5min，液氮里冻20s，37℃水浴保温5min。加入700μL LB液体培养基，28℃，200rpm培养4h。4000rpm离心去上清留100μL LB重悬菌体，涂布于抗性LB(含50μg/ml卡那霉素)的平板上，28℃倒置培养48h，挑单菌落。

(2)通过花浸泡法(参照文献Clough SJ and Bent AF,1998)将重组质粒导入Col-0拟南芥，得到种子。

方法：挑选单克隆于2-3ml的液体LB培养基中，28℃，250rpm培养16小时；取0.2ml菌液加到100ml液体LB培养基中，28℃，250rpm培养18-24小时；将菌液倒入250ml的离心管中，配平；室温，5500rpm离心10min；弃上清，将菌体重悬于floral dip溶液(配方：1/2MS盐+微生物B5(Sigma salts 0404)2.2g/l；蔗糖50g/l；MES 0.5g/l；0.44mM 6BA 10μl/l；Silwet L-77 200μl/l；用NaOH调pH至5.7)中，调至OD₆₀₀nm为0.8。将处于开花状态的野生型Col-0倒置，使花完全浸没在菌体悬液中，维持2min；取出Col-0，侧放于湿润的托盘内，避光放置24小时后，将Col-0植株竖直，同普通植物一样培养。

3、转基因植物的筛选及验证

从农杆菌浸泡后的植物上，收获种子(称之为35S::AtDGM1转基因拟南芥T1代种子)。种子经消毒后，将其铺在琼脂浓度为0.55g/100ml的MS(含有30μg/ml潮霉素)平板上，4℃春化2天；将平板放入温室，平放生长12天后，筛选抗性植株移入土中。单株收获抗性植株的种子(即35S::AtDGM1转基因拟南芥T2代种子)。将收获后的种子再次铺在含潮霉素的筛选培养基上，挑选抗潮霉素的植株。每个转基因株系挑选10株抗性苗，移到土中，成熟后单株收获种子。将每株植物收获的种子，再次铺到筛选培养基上，检验抗潮霉素性状的分离情况。如无分离，则表明此植株为转基因纯合株系，可用于表型的分析。总共得到4个纯合株系，分别是4-5、9-2、11-4、18-12。

接着，对这些植株做Real-time PCR进一步证实这些植株中的AtDGM1的表达是否明显升高。使用Qiagen公司的RNAeasy Plant Mini Kit(货号：74903)提取野生型和转基因植物的总RNA，取1μg的总RNA先用DNase 37℃消化30min，然后在20μl体系里使用TOYOBO的RT kit按照说明书反转录成cDNA；用TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq kit来扩增cDNA，用Bio-Rad CFX96real-time PCR检测系统实时检测cDNA的扩增量。用于扩增AtDGM1基因的引物序列为5’-TCGAATCGGTCCACAAAATACC-3’和5’-GTGGACTTTCGGAGCGATGA-3’，用来扩增Actin cDNA的引物序列为5’-GACCTTGCTGGACGTGACCTTAC-3’和5’-GTAGTCAACAGCAACAAAGGAGAGC-3’。

结果如图1，四个株系的叶部和根中AtDGM1表达量都显著高于野生型(WT)植株，说明转基因植株35S::AtDGM1体内DGM1基因确实显著过表达。

二、35S::AtDGM1转基因植株表型分析

1、35S::AtDGM1幼苗的生长状况观察

将消毒的野生型拟南芥(WT)和35S::AtDGM1植株的种子4-5、9-2、11-4、18-12铺于9cm的MS固体培养基(配方：MS盐4.46g/l(PhytoTechnology Laboratories产品，货号为M519)，MES 1g/l，蔗糖10g/l，pH 5.8，琼脂浓度为1.2g/100ml)平板上，每种拟南芥铺3粒种子，4℃春化3天后，放入温室竖直培养，温室竖直培养的条件温度为23℃，光强为100μmol^-2·s^-1，16小时光照8小时黑暗，植物生长8天后，得到WT和35S::AtDGM1幼苗，观察根毛性状。

WT和35S::AtDGM1植株的根毛性状如图2所示。结果表明，正常条件下，这些转基因植株的主根长度与野生型一致(图2中A)。与野生型相比，35S::AtDGM1转基因拟南芥的根毛长度显著变长，根毛密度显著增加(图2中B)。

2、根毛长度和密度的测量

首先，将步骤二培养得到的野生型拟南芥和35S::AtDGM1幼苗在相差显微镜(Olympus,BAX51,Japan)下观察其根毛并用对应连接的数码相机拍照。然后将拍摄好的照片用软件Digimizer打开，以标尺的实际刻度设置内参，然后每个根选取固定区域和长度计量根毛数目并测量该区域每根根毛的长度，得到每个根的根毛密度和平均根毛长度，每种拟南芥选取20到30个根，每个根量20到30个根毛，试验重复3次，结果取平均值。

野生型拟南芥和35S::AtDGM1植株的根毛长度和密度的测量结果如图3所示。图3中A的结果表明，Col-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的平均根毛长度为0.32±0.02mm，和35S::AtDGM1植株的平均根毛长度为0.49±0.02mm、0.62±0.03mm、0.63±0.02mm、0.64±0.03mm。图3中B的结果表明，Col-0生态型拟南芥(野生型拟南芥)的根毛密度(每mm根里的根毛数量)为19.5±0.9个，和35S::AtDGM1植株的根毛密度(每mm根里的根毛数量)为27.1±1.0个、36.2±1.6个、32.5±1.7个、34.8±1.2个。结果表明，相对于野生型拟南芥，35S::AtDGM1植株根毛长度显著增长，根毛密度显著提高。

三、主要农作物中的DGM1同源蛋白

为了了解一些主要农作物中是否存在DGM1的同源蛋白，本发明的发明人对植物基因组数据库进行了搜索，发现在水稻，大豆，油菜和番茄中存在着和DGM1高度相似的同源蛋白(水稻中DGM1蛋白的序列如序列表中序列3所示；大豆中DGM1蛋白的序列如序列表中序列4所示；油菜中DGM1蛋白的序列如序列表中序列5所示；番茄中DGM1蛋白的序列如序列表中序列6所示)，如图4所示。以上蛋白序列比对结果表明，水稻，大豆，油菜和番茄这些作物中的DGM1蛋白与拟南芥中的DGM1蛋白同源性较高，有可能用这些农作物中的DGM1基因，来构建具有根毛生成能力提高的农作物，从而培育高效吸收养分农作物新品种。

综合以上结果，本发明的发明人认为通过在植物中过表达类核酸酶基因AtDGM1，可以显著提高植物生成根毛的能力。

<110> 清华大学

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<130> CGGNQALN176112

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1997

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

cataaaactc aaaaatcttt ggtcttcaaa cttcaaacac ttgagaaaaa agcttttgat 60

ttcacatctt aatctaacaa gtcaaacact tttcaaacca caaaattcgt caaagctctg 120

aaacaaataa acatttttta atttctccct ttttaatgga aatctcttct ttcccatttc 180

catacctaca agacgacgag tgttcccatt tccttggtct atttcaagac atggactctt 240

ctccttctac tttcggatta gaaggtttta atagcaacga caataatact aatcaaaaga 300

aacgcccaag aaaagacgac gaaggcggtg gtggtggcgg cggaggaaca gaagttctag 360

gagctgttaa tggtaataat aaggctgctt ttggagatat actcgcgacg cttctgttgt 420

tagacgagga agctaaacag caacaagaac agtgggattt tgaatttatt aaagagaagt 480

ctttacttga agctaatcat aagaagaaag tgaaaacaat ggatggttat tacaatcaaa 540

tgcaagatca ttactctgca gctggtgaaa ccgatggttc gcgttcaaaa cgcgcacgga 600

aaaccgcggt tgcggctgtg gtttccgcgg tagcttccgg ggcggacaca accggtttag 660

ctgctccggt tccgaccgcg gatatcgcta gcggttccgg gtcaggaccg agtcatagga 720

ggttatgggt taaagaacga accacggact ggtgggacag agtaagccgg cctgattttc 780

cagaagacga gtttcggcga gagttccgta tgagcaaatc gacgtttaac ctaatatgcg 840

aggagctaga tacgacggtg acgaagaaaa acacgatgtt aagagacgcg attccagctc 900

caaaacgcgt aggcgtttgc gtttggcgtt tggcgacagg agctccgctt cgccacgtgt 960

cggagcgttt cggtctggga atctcaactt gccacaaact agtcatcgaa gtctgccgcg 1020

cgatctacga cgttctcatg cccaagtatc tcctctggcc gtcggattca gagataaact 1080

caacgaaagc caaattcgaa tcggtccaca aaataccaaa cgtcgtcgga tcaatctaca 1140

ccacacatat tccgatcatc gctccgaaag tccacgtggc ggcgtatttt aacaagagac 1200

acacggagag gaatcagaag acgtcgtact cgataacagt acaaggagtg gtcaacgccg 1260

acgggatctt caccgacgtt tgtatcggaa acccaggatc tctcaccgac gatcagatcc 1320

tggagaaatc ttcgctttca cggcaaagag cggcgcgtgg gatgttacgt gacagctgga 1380

tagttggaaa ctctgggttt ccgttgactg attatcttct tgtaccgtac acgagacaga 1440

atctgacgtg gacgcagcac gcgtttaacg agagtatcgg agagattcag gggattgcga 1500

cggctgcgtt tgagaggctc aaaggacggt gggcttgttt gcagaaacgg acggaggtga 1560

agcttcagga tctgccgtac gtgcttggag cttgttgtgt gttgcataac atttgtgaga 1620

tgaggaagga ggagatgttg ccggagttga agtttgaggt ttttgatgat gtggcggtgc 1680

cggagaataa tatccgatct gctagtgcgg ttaatacgag ggatcatatc tctcacaatc 1740

tcttgcatcg tggacttgcc gggacaagaa ctctataggc tctgtttttc accttttctt 1800

attttgaaac tgatttttta ttgcaaattc tttttccaaa ttaggaataa aaacatttta 1860

gggattggtt ggatacagaa agaatagttg aattgagagt agaagtggct gatgatattg 1920

tttgtgttac ttattagcat tgtgtaatct ttagttcatg tattttctat acaaattgaa 1980

tctgaaacct cttaagt 1997

<210> 2

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Glu Ile Ser Ser Phe Pro Phe Pro Tyr Leu Gln Asp Asp Glu Cys

1 5 1015

Ser His Phe Leu Gly Leu Phe Gln Asp Met Asp Ser Ser Pro Ser Thr

202530

Phe Gly Leu Glu Gly Phe Asn Ser Asn Asp Asn Asn Thr Asn Gln Lys

354045

Lys Arg Pro Arg Lys Asp Asp Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

505560

Thr Glu Val Leu Gly Ala Val Asn Gly Asn Asn Lys Ala Ala Phe Gly

65707580

Asp Ile Leu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Asp Glu Glu Ala Lys Gln Gln

859095

Gln Glu Gln Trp Asp Phe Glu Phe Ile Lys Glu Lys Ser Leu Leu Glu

100 105 110

Ala Asn His Lys Lys Lys Val Lys Thr Met Asp Gly Tyr Tyr Asn Gln

115 120 125

Met Gln Asp His Tyr Ser Ala Ala Gly Glu Thr Asp Gly Ser Arg Ser

130 135 140

Lys Arg Ala Arg Lys Thr Ala Val Ala Ala Val Val Ser Ala Val Ala

145 150 155 160

Ser Gly Ala Asp Thr Thr Gly Leu Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Asp

165 170 175

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tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 420

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attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctggtggcgc tcccctctct 960

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aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taa 1653