参与植株形态建成和花发育的白桦SPL2基因及其蛋白

摘要

本发明涉及一个参与植株形态建成和花发育的白桦SPL2基因及其编码蛋白，属于分子生物学中的基因技术领域。相关基因BpSPL2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明提供白桦BpSPL2基因及其植物表达载体，利用农杆菌介导法在拟南芥中过表达该基因，获得的转基因拟南芥纯合株系出现了花瓣不开展，雌蕊雄蕊均萎蔫皱缩的表型，另有部分转基因株系表现为矮化，初级茎数量或主茎上的侧枝数量增多。表明BpSPL2基因能够影响拟南芥花发育、植株形态建成。本发明为利用转基因技术调控林木花败育和植株形态建成提供了基因资源和理论依据。

说明书

技术领域：本发明涉及一个参与植株形态建成和花发育的白桦SPL2基因及其蛋白,属于分子生物学中的基因技术领域。

背景技术：

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的一类转录因子，广泛存在于绿色植物中，最初从金鱼草花序cDNA文库中筛选到2个SPL基因，分别命名为SBP1和SBP2，因其能够识别并结合到SQUAMOSA的启动子上而得名。SPL蛋白构成了一个多样化的转录因子家族，均具有含76个氨基酸的高度保守区段，以此同下游靶基因启动子区域结合,调控靶基因的表达，被命名为SBP结构域。SBP结构域包含一个新的锌指结构和一个核定位信号，参与转录因子进入细胞核，并与含有GTAC的核心基序及其两侧DNA区域特异性结合。不同的SPL基因在不同植物中的功能既有相似之处又各有特点。研究表明水稻OsPL16可以控制米粒大小、形态和色泽，提高OsPL16的表达会促成胚乳细胞增殖及籽粒的充实，并加大粒宽、粒重和水稻产量。拟南芥中，AtSPL2，AtSPL10和AtSPL11在生殖阶段共同调控侧生器官的发育，而且参与调控茎生叶和花的形态建成。AtSPL3，AtSPL4和AtSPL5在控制开花转型上具有类似功能，最近研究表明这三个基因通过SOC1-SPL模型调节光周期和赤霉素信号来控制植物开花。AtSPL9和AtSPL15冗余地调控拟南芥幼年向成年的转型以及叶的形成。SBP基因的研究迄今多数是在草本植物和作物之中，如上述拟南芥、金鱼草、水稻等，而对其在多年生木本植物中的功能研究极少。目前，对于具有较长幼龄期的白桦的SPL基因的功能尚不清楚，也没有涉及白桦SPL2基因序列及其功能的相关专利报道。

另外，在拟南芥中，大多数SPL基因功能已被鉴定，而G1区的AtSPL基因功能鲜有报道。本研究利用反向遗传学的手段，通过构建同在G1区的BpSPL2基因的过表达载体，利用农杆菌侵染法对拟南芥进行遗传转化，筛选出转基因株系后对其表型、性状进行分析统计，以此来研究白桦BpSPL2基因功能，同时也是对G1区SPL基因功能的一个补充。

发明内容：

本发明提供一种从白桦中克隆白桦花发育相关基因BpSPL2的方法：

(1)先采用改良的CTAB法提取白桦雄花RNA，用ThermoScript^TM>

(2)设计含有CACC位点，克隆白桦BpSPL2编码区全长的PCR引物；引物序列为：

正向引物：BpSPL2-F：5′-CACCATGGAGTCTTGGAGTTGCAGTTCAG-3′；反向引物：BpSPL2-R：5′-CACACCTTGTTGGTTGCACACTGC-3′

(3)利用引物BPSPL2-F和BPSPL2-R对合成的cDNA进行PCR扩增，获得一个BpSPL2转录因子基因的全长cDNA，命名为白桦BPSPL2；

PCR扩增产物经测序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

本发明构建了白桦BPSPL2基因的植物表达载体，构建的植物表达载体(pGWB5-BPSPL2)经农杆菌浸染拟南芥植株，获得转基因拟南芥植株；部分转基因纯系植株表现为花停止生长，花瓣不开展，雌蕊雄蕊均萎蔫皱缩。果实败育，角果中种子数量较野生型减少。表明该基因能够影响拟南芥花发育和种子结实率；另外，大部分转基因纯系株系出现了矮化的表型，另有部分转基因植株的初级茎数量或主茎上的侧枝数量增多，表明该基因可能参与植株形态建成，影响主茎高度，侧枝萌蘖。

构建白桦BpSPL2基因植物表达载体的技术方案如下：

选择pGWB5载体作为基本植物表达载体，首先设计含有CACC位点的白桦BpSPL2全长引物，并克隆出白桦BpSPL2基因全长，将其连接到入门载体pENTR^TM/SD/D-利用Gateway技术将该基因连接至植物表达载体pGWB5上。检测构建的载体pGWB5-BpSPL2。

本发明提供的白桦BpSPL2基因在调节拟南芥花发育，降低花的育性和种子结实率的应用。将上述植物表达载体pGWB5-BpSPL2转化农杆菌EHA105，经农杆菌介导的浸花法浸染，获得白桦BpSPL2过表达的转基因拟南芥植株，经抗性筛选及PCR检测最终得到12个转基因阳性纯合株系：line1-line12；白桦BpSPL2可以降低转基因拟南芥的育性，转基因纯合株系的花不育率大于野生型非转基因植株，部分转基因株系花的不育率高达60％以上；转基因纯合株系的种子结实率低于野生型非转基因植株。另外，部分转基因纯系株系出现了矮化、初级茎数量、主茎上的侧枝数量增多的表型，表明该基因可能参与植株形态建成，影响主茎高度，侧枝萌蘖。本发明为今后利用转基因技术对林木开花进行调控，培育不育的林木提供了基因资源，同时为利用基因工程技术调控植株形态建成提供理论依据，具有很大的应用价值。

本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：

1、本发明提供了调控植物花发育的BpSPL2蛋白，可用于调控林木开花，培育不育的林木，并且可用于搜寻在其他植物中与花发育相关的基因。

2、本发明提供的含有白桦BpSPL2基因重组载体，可有效负调控植物花发育和种子结实率，对植株的形态建成也具有调节作用。

3、本发明提供的BpSPL2基因具有调控花育性、种子结实率、参与植株形态建成的功能，可用于林木植物花发育研究中，并为植物SBP基因家族功能研究提供参考资源。

附图说明

图1为白桦BPSPL2基因全长cDNA的PCR扩增显示图。

图2为植物表达载体pGWB5图谱。

图3为植物表达载体pGWB5-BPSPL2 PCR检测图。

图4为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥植株PCR验证图，1-12为转基因株系，13，14为pGWB5-BPSPL2质粒阳性对照。

图5为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥株系Line6。

图6为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥株系Line1。

图7为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥株系败育花表型。

图8为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥株系不育的角果表型。

图9为转基因过表达白桦BPSPL2拟南芥株系败育花的解剖结构。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：白桦BpSPL2基因的克隆

(1)植物材料的获得

实验材料白桦雄花，采自东北林业大学白桦林。采集后立即冷藏到-80℃冰箱保存备用。(2)白桦RNA的抽提

白桦总RNA使用改良的CTAB法步骤进行，使用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计测总RNA的纯度和浓度。用ThermoScript^TM>TM/SD/D-cloning kit说明书操作，将胶回收产物与入门载体Vector连接，连接体系如下：取1μLVector，1μL Salt solution，2μL胶回收产物加入到200μL的PCR管中，补加无菌去离子水2μL。轻轻混合均匀，4℃过夜连接后转化大肠杆菌，提取质粒并测序。

白桦BpSPL2核苷酸序列分析

BpSPL2基因序列长为1566bp，序列见序列表SEQ ID NO:1，利用NCBI数据库，获得拟南芥的全部SPL基因，并利用软件MEGA5.0进行系统进化树分析。结果显示BpSPL2与拟南芥AtSPL6/13聚在一条分枝上，BpSPL2与AtSPL6/13同源性分别为50％、59％。

白桦BpSPL2基因编码的蛋白质序列分析

BpSPL2基因总共编码522个氨基酸，序列见序列表SEQ ID NO:2，通过Compute pI/Mw软件(http://web.expasy.org/compute_pi/)分析可知，BpSPL2所编码形成的蛋白质理论上的等电点为6.81。BpSPL2氨基酸序列含有一个由79个氨基酸组成的SBP结构域。SBP结构域中包含有8个非常保守的半胱氨酸和组氨酸残基，前四个和后四个分别参与组成SBP结构域中的两个锌指结构。在SBP保守域近C端，含有一个核定位信号，控制其在细胞核中表达。说明BpSPL2是SBP转录因子家族的成员之一。

实施例2：白桦BpSPL2基因的植物表达载体构建

(1)利用gateway技术构建植物表达载体，具体步骤如下：

a.分别以携带入门载体pENTR-BpSPL2和Gateway载体pGWB5的菌株为对比，在含有50mg/L卡那霉素以及不同浓度的潮霉素(hyg)的LB液体培养基中培养，以此筛选潮霉素的实用浓度。

b.取2μL质粒pENTR-BpSPL2和2μL质粒pGWB5于200μL PCR管中并混合均匀。

c.将LR ClonaseTMEnzyme II mix置于冰上2min后快速振荡2次，每次约2s。

d.向混合质粒体系中加入1μL LR ClonaseTMEnzyme II mix并混合均匀，短暂离心。

e.PCR仪中，25℃保温6h。

f.向反应体系中加入0.5μL的蛋白酶K终止反应，混合均匀后37℃保温10min。

g.取3μL的反应产物用于转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。选择性培养基为含50mg/L卡那霉素和625mg/L潮霉素的液体培养基。

h.培养后PCR检测呈阳性的菌株扩大培养，菌液提质粒电泳检测，测序。

实施例3：白桦BpSPL2基因在拟南芥中过表达功能分析

(1)拟南芥无菌苗的培养：

a)取适量种子于离心管中，加入适量无菌蒸馏水，充分漩涡震荡，短时瞬离，将漂浮的种子和无菌水一起吸出。

b)加入1mL 70％的乙醇，漩涡震荡10s，使种子充分悬浮于乙醇溶液中，吸出乙醇(乙醇消毒时间不宜过长，避免乙醇渗入，降低种子活性)，加入无菌ddH₂O，震荡清洗2遍。

c)加入1mL 10％次氯酸钠，漩涡充分震荡5min，12000rpm离心1min，超净工作台中，用1mL无菌ddH₂O，震荡清洗3-5遍，直至离心管内溶液变为无色，降低残余次氯酸钠对种子的影响。

d)将洗好的无菌种子均匀铺于MS培养基表面，待培养基表面水分稍干后，封好封口膜，并做好标记。

e)将密封好的培养基放入4℃冰箱中春化处理2-3天，目的是打破种子休眠。

f)取出春化后的平板放入培养架上光照培养(16h light/8h dark)

g)待幼苗生长10d左右，长出两片真叶时即可将其大量移栽至已高温灭菌并浇过饱和营养液的土壤中培养。

(2)农杆菌介导的浸花法转化拟南芥

1)菌液的准备：用接种环蘸取菌液在加入利福平和卡那霉素(浓度分别为10μg/mL和50μg/mL)的LB培养基上划线，培养单菌落。挑取单菌落接种于有4mL LB(分别加入Rif和Kan)液体培养基的锥形瓶里，28℃，220rpm振荡培养过夜。取过夜培养菌液1mL接种于100mLLB(分别加入Rif和Kan)液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.8。将培养的菌液离心收集加入到含有20μL Silwet L-77的烧杯中悬浮备用。

2)农杆菌浸染拟南芥：去除植株已开的花和角果，侵染前往托盘注水，使塑料土盆充分吸水。将土盆倒扣，莲座叶上部分全部浸没在侵染液中30s。取出拟南芥，吸水纸轻拭表面渗透液，覆上塑料薄膜保湿。暗培养24h后揭掉薄膜。当塑料盆中土干透后，浇水。2～4周后，用离心管收集种子，4℃保存。

(3)抗性植株的筛选及PCR检测

取转化后收的种子，用70％酒精振荡洗30s，再用10％的次氯酸钠溶液振荡洗2min，最后用无菌水清洗4～6次。将表面消毒后的种子均匀地铺在Kan终浓度为50μg/mL的MS培养基上，4℃黑暗培养2～3天后，22℃长日照(16h光照，8h黑暗)培养。种子发芽8～10天左右可鉴定转基因植株。将筛选呈阳性的转基因植株移栽到土盆中。种子成熟后，单株收获种子。用BpSPL2的一对特异性引物(正向引物BpSPL2-F1：GCTCTAGAGGAACTCTTGGATTTGGGATT，反向引物BpSPL2-R1：CGGGATCCTCTCTTCCTCTGCAAACATGG)进行PCR检测，获得12个转基因株系，分别命名为line1-line12，为获得稳定性遗传，再用前面相同的方法连续筛选出T3代种子。

选择经过PCR检测正确的拟南芥阳性植株(转基因株系line1-12)和野生型非转基因拟南芥植株各9株，进行表型观察。对BpSPL2转基因拟南芥T₃代植株的12个株系的主茎高度进行统计。大部分转基因株系的主茎高度均显著低于野生型株系(line2,3,5,6,7,8,9,10,11)(以图5为例，表1)，只有line1,4,12的主茎高度与野生型无明显差异(以图6为例，表1)。部分转基因植株的初级茎数量明显多于野生型(line1,4,5,6,7,10,11)(以图5为例，表1)，另有部分转基因植株主茎上的侧枝数也明显多于野生型(line1,9)(以图5为例，表1)。这表明BpSPL2基因可能参与植株形态建成，影响主茎高度和侧枝萌蘖。

转基因植株的花停止生长，花瓣不开展(图7)，果实败育，角果中种子数量较野生型减少(图8)，对野生型和转基因的不育花和种子结实率进行统计(表1)。转基因植株的花败育率高于野生型，其中Line4的花败育率高达69.2％；种子的结实率明显降低，其中Line3的种子结实率仅为42％。通过解剖转基因植株中的不育花和野生型花结构(图9)，我们发现了以下表型：野生型花萼鲜嫩且呈绿色，而转基因植株的花萼干瘪且呈黄白色，花瓣小且包裹于花萼内。野生型植株的花的各部分器官都比转基因植株的相应花器官大。如，转基因植株的花丝极短，花药和雌蕊也比野生型小很多。上述结果表明，白桦BpSPL2影响转基因拟南芥花发育和种子结实率。

表1：BpSPL2转基因(转基因株系line1-line12)与野生型拟南芥(WT)表型统计

^*P<0.05，差异显著；^**P<0.01差异极其显著；

序列表SEQ ID NO:1

ATGGAGTCTTGGAGTTGCAGTTCAGAAGGGAAAGGCCTTTTGCTTTCTGATGAAATGGATTTACAAGTTGATGCTTTTGCTAGAAGTAAAAAGACATTAATGGAATGGGACAATAAACCCACTTATTATTTTGAAAGCAATGGACTTGTTTCTGATAGAGAAGCGGTTGAGGGCATGGAACTCTTGGATTTGGGATTCTCTGACTTGGTGAGAAAACCTTTTCATGGTAACCGAGGAATGGAGATGTTAAGCGGTGAGGTTGGTAGTGGCTCTAGTCAAAGAGCAGTCACTCCTACGTATATGGTTACTTCAAATTCATGTTTTGAGGAAGTGGGTTCTGAAGCAAAGCTTTCAAGTTCTTCTATGGAAGCCAACAGTCAAGATTTATCACTGATTGATTTGAAGCTAGGGACATTGGCTGATTGCAAAGATGCGGAGAATATCAAGGTATTGAAAGAGAAACCGGTTTTGTCATCTGTAAGTCCATGTTTGCAGAGGAAGAGAGCGCGCAAAACAAGTTCACACTCTCAGACTGCCTTCTGCCAAGTCCATGGTTGTAACAAGGATTTGAGCTCCTCAAAGGATTACCACAAAAGGCATAAAGTTTGTGATGTTCACTCTAAGACTGCCAAAGTTATTGTTAACGGCATTGAACAAAGGTTTTGTCAACAGTGTAGCAGGTTTCATCTGCTGGTTGAATTTGATGATGGTAAGCGAAGCTGTCGTAAACGCCTAGCAGGCCACAATGAACGTCGACGGAAGCCTCAATTAGATACCCTTTCTGGCACTCAATACTTGGGGACTTCCTTGCAAAAGAGGACACCCCTTGTTTTCCCAGACATATTTCGAGCTGGCATTATTTGTCCAGGAAAAAATGAAGAAGCCAATTGGTTTAGACATACCAAATTAGAAGGGGAGTCAATATACAGTCCTCAATCAGCAATACCAATCACAAATGGGCATTTGCTTCCAAAATCTTTTCTCCATCTCCATGGCATTGGGAAACAACATTGTTCTGGAGTTCCTTCATCAGGATCTGAAGACTATACTTTTACTGCATCAACCGTCCAGGAATTACCTGGGGCCTCAATTTCCAGTTGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAGCTCAATCACAGGACTTGTCAAGCCATTTGACTGGACGTCCAATGGCTAGTCCCCAGATTATGCAAGGTCGCTCTGCCCATCACGTTCTTGGTCAAACTGATAAACCTGTAAGGGTAAGCTCTGTGGAACAATATGGATCAAATGGACTCTATTCATATGGGATGAACTCCATGGAAGTTGATAAGATAGGATCAGTAATGCTTTCTGATGCTAGTAATGCTGCTGATTTTCAAGTTCACACCGATGGAATTTTTCAAGAGTCAGATATTTTGAATGCCAACTATTTTTCTTCTACCGAATATGGACCCACGGTTGATTGGCTTCAATTGTCATCACATCTTCAAAGAGTGGAGCGACAGAGAAATTCCATCCAAGTAAAGCAGGAAAATGGGGACTCTTGCTATTTCCCAACCTTTAGAGCAGTGTGCAACCAACAAGGTGTGTAA

序列表SEQ ID NO:2

MESWSCSSEGKGLLLSDEMDLQVDAFARSKKTLMEWDNKPTYYFESNGLVSDREAVEGMELLDLGFSDLVRKPFHGNRGMEMLSGEVGSGSSQRAVTPTYMVTSNSCFEEVGSEAKLSSSSMEANSQDLSLIDLKLGTLADCKDAENIKVLKEKPVLSSVSPCLQRKRARKTSSHSQTAFCQVHGCNKDLSSSKDYHKRHKVCDVHSKTAKVIVNGIEQRFCQQCSRFHLLVEFDDGKRSCRKRLAGHNERRRKPQLDTLSGTQYLGTSLQKRTPLVFPDIFRAGIICPGKNEEANWFRHTKLEGESIYSPQSAIPITNGHLLPKSFLHLHGIGKQHCSGVPSSGSEDYTFTASTVQELPGASISSCALSLLSAQSQDLSSHLTGRPMASPQIMQGRSAHHVLGQTDKPVRVSSVEQYGSNGLYSYGMNSMEVDKIGSVMLSDASNAADFQVHTDGIFQESDILNANYFSSTEYGPTVDWLQLSSHLQRVERQRNSIQVKQENGDSCYFPTFRAVCNQQGV