一种麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测试方法

摘要

本发明涉及鱼肝脏线粒体膜流动性的测试，具体涉及一种麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测试方法，该方法包括S1.鱼体暴露实验；S2.麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备；S3.DPH溶液的制备；S4.线粒体膜DPH荧光探针的标记；S5.膜流动性测定；S6.线粒体的蛋白质含量测定。本发明麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测试方法，方便准确的测定药剂对鱼线粒体膜流动性的影响。

说明书

技术领域

本发明涉及鱼肝脏线粒体膜流动性的测试，具体涉及一种麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测试方法。

背景技术

近年来随着现代生物技术的不断发展，杀虫药剂毒理机制的研究方法也在朝着分子水平方向发展。其中一个方面就是生物膜效应方面的研究。生物膜磷脂双分子层的流动性是生物膜的基本特征之一。大量研究表明，生物膜合适的流动性是生物膜发挥正常功能的必要条件。例如，物质运送、能量转换、细胞的识别和分化、细胞免疫、激素作用、膜结合酶活性等，都与膜的流动性密切相关。膜的适宜程度的流动性是细胞维持正常生理功能的必要条件。

线粒体是真核细胞内重要的细胞器，参与细胞内三羧酸循环、脂肪酸代谢、氧化磷酸化等多种生理和生化过程，是细胞的代谢供能中心，也是众多环境化学外源物毒性作用的优先靶标。线粒体膜具有多种离子通道可介导离子转运，离子通道的调节可能影响线粒体甚至细胞的功能。目前国内外有关测定膜脂流动性影响的研究主要集中在医学领域，主要针对药剂对高等动物的离体生物膜及人工膜的影响，通过离体测定一些病人的细胞膜流动性，从膜分子生物学方面研究一些疾病的发病机制，为临床诊断、治疗提供新的依据。

国内外有关杀虫剂对膜脂流动性影响的研究主要集中在医学领域，且多见于高等动物的离体生物膜及人工膜上，在环境毒理学领域仅有个别研究测定了杀虫药剂对昆虫线粒体膜流动性影响的离体测定，而药剂对鱼类线粒体膜流动性影响的活体测定目前尚未见报道。上述无论是针对高等动物还是个别鱼和昆虫的线粒体膜流动性测定研究，都属于离体实验检测，且存在很多缺陷：

(1)体外线粒体膜流动性检测虽然有效、所需费用较低，但离体实验缺少了生物整体的代谢循环转换和体内的循环分布，不能真正反映整体生物活性；

(2)离体检测需要将线粒体分离，同样缺少了药物在生物体内的吸收、分布、代谢及排泄过程，不能反映药物在体内的真实情况；

(3)线粒体在分离过程中有可能破坏生物膜的天然状态，会造成不同程度的膜损伤；

(4)离体线粒体活性降低，生物学功能较差。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术离体线粒体膜流动性检测方法所存在的缺陷和不足，提供一种麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测试方法。

本发明采用的技术方案如下：一种麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测定方法，包括以下步骤：

S1.鱼体暴露实验

麦穗鱼体暴露实验采用水体染毒法：将麦穗鱼室内驯化10-16天，随机暴露于药液中，进行染毒暴露；

S2.麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备

取暴露时间终点的麦穗鱼，解剖取其肝脏，在生理盐水中清洗去除结缔组织和脂肪组织，剪碎，加入冷蔗糖提取液，匀浆，过滤，匀浆液离心，取上清液，离心，弃上清液，用冷蔗糖提取液悬浮沉淀，再次离心，最后制得的线粒体沉淀用冷蔗糖提取液悬浮，即获得肝脏线粒体悬浮液；

S3.DPH溶液的制备

DPH溶液为DPH浓度为2×10^-6M的四氢呋喃溶液；

S4.线粒体膜DPH荧光探针的标记

在所述肝脏线粒体悬浮液中加入PBS缓冲液，加入DPH荧光探剂，在25℃下温育30-40min即可；

S5.膜流动性测定

膜流动性的测定是通过荧光分光光度仪测定标记的线粒体膜的荧光偏振度P的变化；用恒温水浴控制测试体系的温度；

按照以下公式计算荧光强度F和荧光偏振度P：

F＝I_Ⅱ+2I_I>Ⅱ-GI_I/I_Ⅱ+GI_I>HV/I_HHI_HV

式中I_Ⅱ为起偏器和检偏器光轴均在垂直方向时的荧光强度；

I_I起偏器光轴和检偏器光轴分别在垂直方向和水平方向时的荧光强度；

I_HV为起偏器和检偏器分别在水平和垂直方向时的荧光强度；

I_HH为起偏器和检偏器均在水平方向时的荧光强度。

膜流动性以1/P来表示，若膜的荧光偏振度P增大，则膜的流动性降低，反之，则膜的流动性增加；

S6.线粒体的蛋白质含量测定

参照Bradford(1976)考马斯亮蓝G-250法，用牛血清白蛋白(BSA)测定蛋白质含量，绘制标准曲线。

进一步地，所述麦穗鱼室内驯化的死亡率稳定在5％以下。

进一步地，所述药液定期12-24h更换为同浓度的药液，以保持药液浓度尽量维持不变。

进一步地，所述麦穗鱼体急性暴露实验期间不喂食，慢性暴露实验期间可喂食，需要及时清理未被食用完的饲料，并以加溶剂处理的麦穗鱼作平行对照。

进一步地，所述麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备的具体过程为：取暴露时间终点的麦穗鱼，解剖取其肝脏，在0℃生理盐水中清洗去除结缔组织和脂肪组织，剪碎，加入8-12倍体积的冷蔗糖提取液，玻璃匀浆器冰浴匀浆，纱布过滤，匀浆液在2500-3500g离心10-15min，取上清液，再在10000-12000g离心25-35min，弃上清液，再次用8-12倍体积冷蔗糖提取液悬浮沉淀，10000-12000g离心25-35min，最后制得的线粒体沉淀用冷蔗糖提取液悬浮，即获得肝脏线粒体悬浮液。

进一步地，所述冷蔗糖提取液中，每1L冷蔗糖提取液中含有以下质量的组分Tris 1.21g、EDTA 0.0372g、蔗糖3.42g、NaCl 8g、BSA 0.5％；保存于2-4℃条件下。

更进一步地，所述冷蔗糖提取液的pH为7.4。

进一步地，所述麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备均在0-4℃下进行。

进一步地，所述DPH溶液配制的具体过程为：(1)以四氢呋喃作溶剂，配制DPH浓度为2×10^-3M的储备液；(2)用PBS(0.01M磷酸缓冲液，pH7.4，含0.14M>-6M的DPH溶液，即DPH荧光探剂。

进一步地，所述PBS为0.01M磷酸缓冲液，含0.14M NaCl，pH7.4。

进一步地，所述测试体系的温度为20-25℃，pH为7.4。以保证测试的准确性。

进一步地，步骤S4中，所述肝脏线粒体悬浮液中加入PBS缓冲液后，肝脏线粒体悬浮液中蛋白含量为125-160μg/ml。

进一步地，所述荧光分光光度仪的激发光源波长设定为362nm，狭缝为10nm；发射波长设定为428nm，狭缝为10nm。

进一步地，所述膜流动性的测定，以非DPH标记的等量线粒体悬浮作为空白对照，以消除散射光和其他因素的影响。

本发明的测定方法一方面避免了线粒体膜流动性离体测定方法的缺陷，可以真实反映药物在活体内的代谢循环转换和体内的循环分布，包括药物的吸收、分布、代谢、排泄，能够真实反映药物的整体生物活性，可预测性好。另一方面避免了离体测定药剂对膜流动性表现出的短时效应，可以检测长期低剂量暴露对鱼生物膜系统的损伤。

本发明以麦穗鱼活体染毒后的肝脏线粒体膜为研究对象，采用DPH荧光偏振法，通过优化各种反应底物浓度、反应体系总体积以及荧光光谱波长等参数，麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测试方法，方便准确的测定药剂对鱼线粒体膜流动性的影响，从膜毒理学角度丰富毒物的环境毒理学资料，丰富毒物的毒作用机理，同时为探索新的亚细胞水平和分子水平毒理学检测方法提供可能性。从膜毒理学的角度探索一种新的亚细胞和分子水平的毒理学检测方法。

附图说明

图1、DPH、麦穗鱼肝脏线粒体膜、DPH标记的麦穗鱼肝脏线粒体膜的激发光谱和荧光光谱；(1)DPH标记的麦穗鱼肝脏线粒体膜的激发光谱和荧光光谱；(2)麦穗鱼肝脏线粒体膜的激发光谱和荧光光谱；(3)DPH溶液的激发光谱和荧光光谱；

图2、不同类型杀虫剂活体处理12天对麦穗鱼肝脏线粒体膜偏振度的影响(25℃)。

其中，表中数据为3次重复的平均值，每次重复为5条鱼；图中的*表示差异显著(P<0.05)

具体实施方式

实施例1

一种麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.鱼体暴露实验

麦穗鱼体暴露实验采用水体染毒法：将麦穗鱼室内驯化14天，死亡率稳定在5％以下，随机暴露于药液处理组的玻璃缸内，药液24h更换为同浓度的药液，以保持药液浓度尽量维持不变，进行染毒暴露；分别用4μg/L三唑磷、20μg/L的三唑磷、14μg/L氟虫腈和71μg/L的氟虫腈染毒麦穗鱼12天，并以加溶剂处理的麦穗鱼作平行对照，在暴露时间终点取样，每次取5条鱼作为一个处理的样本。麦穗鱼体暴露实验期间定点喂食。

S2.麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备

取暴露时间终点的麦穗鱼，解剖取其肝脏，在0℃生理盐水中清洗去除结缔组织和脂肪组织，剪碎，加入10倍体积的冷蔗糖提取液，玻璃匀浆器冰浴匀浆，纱布过滤，匀浆液在3000g离心10min，取上清液，再在10000g离心30min，弃上清液，用冷蔗糖提取液悬浮沉淀，再次离心，最后制得的线粒体沉淀用冷蔗糖提取液悬浮，即获得肝脏线粒体悬浮液。

其中，冷蔗糖提取液中，每1L冷蔗糖提取液中含有以下质量的组分Tris 1.21g、EDTA 0.0372g、蔗糖3.42g、NaCl 8g、BSA 0.5％，pH为7.4，保存于4℃条件下。

麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备均在0-4℃下进行。

S3.DPH溶液的制备

DPH溶液为DPH浓度为2×10^-6M的四氢呋喃溶液；其配制的具体过程为：(1)以四氢呋喃作溶剂，配制DPH浓度为2×10^-3M的储备液，低温保存在棕色瓶中，使用期限为一个月；(2)用PBS(0.01M磷酸缓冲液，pH7.4，含0.14M>-6M的DPH溶液，即DPH荧光探剂。测定膜流动性所需要的DPH溶液，于使用前新鲜配制；

其中，PBS为0.01M磷酸缓冲液，含0.14M NaCl，pH7.4。

S4.线粒体膜DPH荧光探针的标记

在所述肝脏线粒体悬浮液中加入PBS缓冲液，调整线粒体膜蛋白含量为125-160μg/ml，取2ml，加入2ml 2×10^-6M>

S5.膜流动性测定

膜流动性的测定是通过荧光分光光度仪测定标记的线粒体膜的荧光偏振度P的变化；膜流动性以1/P来表示，若膜的荧光偏振度P增大，则膜的流动性降低，反之，则膜的流动性增加；荧光分光光度仪的激发光源波长设定为362nm，狭缝为10nm；发射波长设定为428nm，狭缝为10nm；用恒温水浴控制测试体系的温度，测试体系的温度为25℃，pH为7.4；并以非DPH标记的等量线粒体悬浮液作为空白对照，以消除散射光和其他因素的影响。

按照以下公式计算荧光强度F和荧光偏振度P：

F＝I_Ⅱ+2I_I>Ⅱ-GI_I/I_Ⅱ+GI_I>HV/I_HHI_HV

式中I_Ⅱ为起偏器和检偏器光轴均在垂直方向时的荧光强度；

I_I起偏器光轴和检偏器光轴分别在垂直方向和水平方向时的荧光强度；

I_HV为起偏器和检偏器分别在水平和垂直方向时的荧光强度；

I_HH为起偏器和检偏器均在水平方向时的荧光强度。

S6.线粒体的蛋白质含量测定

参照Bradford(1976)考马斯亮蓝G-250法，用牛血清白蛋白(BSA)测定蛋白质含量，绘制标准曲线。

由图1可以看出，DPH与麦穗鱼肝脏线粒体膜结合后的荧光光谱的变化。DPH溶液的激发光谱的峰值在382nm，荧光光谱的峰值在442nm。麦穗鱼肝脏线粒体膜用DPH标记后，激发光谱和荧光光谱都出现了蓝移。激发峰值由382nm移至362nm，荧光峰值由442nm移至428nm，荧光强度比单纯的DPH溶液和麦穗鱼肝脏线粒体膜增大30倍以上。

由图2可以看出，水体染毒麦穗鱼12天不同类型杀虫剂对麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的影响。用4μg/L与20μg/L的三唑磷和14μg/L与71μg/L的氟虫腈染毒麦穗鱼12天后，用DPH荧光探剂标记鱼肝脏线粒体后，观察到处理组的麦穗鱼肝脏线粒体膜的流动性比对照组都有明显降低(P<0.05)，且高浓度的膜流动性降低的幅度比低浓度的小。

实施例2

一种麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.鱼体暴露实验

麦穗鱼体暴露实验采用水体染毒法：将麦穗鱼室内驯化10天，死亡率稳定在5％以下，随机暴露于药液处理组的玻璃缸内，药液12h更换为同浓度的药液，以保持药液浓度尽量维持不变，进行染毒暴露；分别用8μg/L三唑磷、30μg/L的三唑磷、10μg/L氟虫腈和50μg/L的氟虫腈染毒麦穗鱼12天，并以加溶剂处理的麦穗鱼作平行对照，在暴露时间终点取样，每次取5条鱼作为一个处理的样本。麦穗鱼体暴露实验期间定点喂食。

S2.麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备

取暴露时间终点的麦穗鱼，解剖取其肝脏，在0℃生理盐水中清洗去除结缔组织和脂肪组织，剪碎，加入8倍体积的冷蔗糖提取液，玻璃匀浆器冰浴匀浆，纱布过滤，匀浆液在2500g离心15min，取上清液，再在10000g离心35min，弃上清液，用冷蔗糖提取液悬浮沉淀，再次离心，最后制得的线粒体沉淀用冷蔗糖提取液悬浮，即获得肝脏线粒体悬浮液。

其中，冷蔗糖提取液中，每1L冷蔗糖提取液中含有以下质量的组分Tris 1.21g、EDTA 0.0372g、蔗糖3.42g、NaCl 8g、BSA 0.5％，pH为7.4，保存于2℃条件下。

麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备均在0-4℃下进行。

S3.DPH溶液的制备

DPH溶液为DPH浓度为2×10^-6M的四氢呋喃溶液；其配制的具体过程为：(1)以四氢呋喃作溶剂，配制DPH浓度为2×10^-3M的储备液，低温保存在棕色瓶中，使用期限为一个月；(2)用PBS(0.01M磷酸缓冲液，pH7.4，含0.14M>-6M的DPH溶液，即DPH荧光探剂。测定膜流动性所需要的DPH溶液，于使用前新鲜配制；

其中，PBS为0.01M磷酸缓冲液，含0.14M NaCl，pH7.4。

S4.线粒体膜DPH荧光探针的标记

在所述肝脏线粒体悬浮液中加入PBS缓冲液，调整线粒体膜蛋白含量为125-160μg/ml，取2ml，加入2ml 2×10^-6M>

S5.膜流动性测定

膜流动性的测定是通过荧光分光光度仪测定标记的线粒体膜的荧光偏振度P的变化；膜流动性以1/P来表示，若膜的荧光偏振度P增大，则膜的流动性降低，反之，则膜的流动性增加；荧光分光光度仪的激发光源波长设定为362nm，狭缝为10nm；发射波长设定为428nm，狭缝为10nm；用恒温水浴控制测试体系的温度，测试体系的温度为25℃，pH为7.4；并以非DPH标记的等量线粒体悬浮液作为空白对照，以消除散射光和其他因素的影响。

按照以下公式计算荧光强度F和荧光偏振度P：

F＝I_Ⅱ+2I_I>Ⅱ-GI_I/I_Ⅱ+GI_I>HV/I_HHI_HV

式中I_Ⅱ为起偏器和检偏器光轴均在垂直方向时的荧光强度；

I_I起偏器光轴和检偏器光轴分别在垂直方向和水平方向时的荧光强度；

I_HV为起偏器和检偏器分别在水平和垂直方向时的荧光强度；

I_HH为起偏器和检偏器均在水平方向时的荧光强度。

S6.线粒体的蛋白质含量测定

参照Bradford(1976)考马斯亮蓝G-250法，用牛血清白蛋白(BSA)测定蛋白质含量，绘制标准曲线。

实施例3

一种麦穗鱼肝脏线粒体膜流动性的活体测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.鱼体暴露实验

麦穗鱼体暴露实验采用水体染毒法：将麦穗鱼室内驯化16天，死亡率稳定在5％以下，随机暴露于药液处理组的玻璃缸内，药液20h更换为同浓度的药液，以保持药液浓度尽量维持不变，进行染毒暴露；分别用4μg/L三唑磷、20μg/L的三唑磷、14μg/L氟虫腈和71μg/L的氟虫腈染毒麦穗鱼12天，并以加溶剂处理的麦穗鱼作平行对照，在暴露时间终点取样，每次取5条鱼作为一个处理的样本。麦穗鱼体暴露实验期间定点喂食。

S2.麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备

取暴露时间终点的麦穗鱼，解剖取其肝脏，在0℃生理盐水中清洗去除结缔组织和脂肪组织，剪碎，加入12倍体积的冷蔗糖提取液，玻璃匀浆器冰浴匀浆，纱布过滤，匀浆液在3500g离心12min，取上清液，再在12000g离心25min，弃上清液，用冷蔗糖提取液悬浮沉淀，再次离心，最后制得的线粒体沉淀用冷蔗糖提取液悬浮，即获得肝脏线粒体悬浮液。

其中，冷蔗糖提取液中，每1L冷蔗糖提取液中含有以下质量的组分Tris 1.21g、EDTA 0.0372g、蔗糖3.42g、NaCl 8g、BSA 0.5％，pH为7.4，保存于2-4℃条件下。

麦穗鱼活体肝脏线粒体膜的制备均在0-4℃下进行。

S3.DPH溶液的制备

DPH溶液为DPH浓度为2×10^-6M的四氢呋喃溶液；其配制的具体过程为：(1)以四氢呋喃作溶剂，配制DPH浓度为2×10^-3M的储备液，低温保存在棕色瓶中，使用期限为一个月；(2)用PBS(0.01M磷酸缓冲液，pH7.4，含0.14M>-6M的DPH溶液，即DPH荧光探剂。测定膜流动性所需要的DPH溶液，于使用前新鲜配制；

其中，PBS为0.01M磷酸缓冲液，含0.14M NaCl，pH7.4。

S4.线粒体膜DPH荧光探针的标记

在所述肝脏线粒体悬浮液中加入PBS缓冲液，调整线粒体膜蛋白含量为125-160μg/ml，取2ml，加入2ml 2×10^-6M>

S5.膜流动性测定

膜流动性的测定是通过荧光分光光度仪测定标记的线粒体膜的荧光偏振度P的变化；膜流动性以1/P来表示，若膜的荧光偏振度P增大，则膜的流动性降低，反之，则膜的流动性增加；荧光分光光度仪的激发光源波长设定为362nm，狭缝为10nm；发射波长设定为428nm，狭缝为10nm；用恒温水浴控制测试体系的温度，测试体系的温度为20℃，pH为7.4；并以非DPH标记的等量线粒体悬浮液作为空白对照，以消除散射光和其他因素的影响。

按照以下公式计算荧光强度F和荧光偏振度P：

F＝I_Ⅱ+2I_I>Ⅱ-GI_I/I_Ⅱ+GI_I>HV/I_HHI_HV

式中I_Ⅱ为起偏器和检偏器光轴均在垂直方向时的荧光强度；

I_I起偏器光轴和检偏器光轴分别在垂直方向和水平方向时的荧光强度；

I_HV为起偏器和检偏器分别在水平和垂直方向时的荧光强度；

I_HH为起偏器和检偏器均在水平方向时的荧光强度。

S6.线粒体的蛋白质含量测定

参照Bradford(1976)考马斯亮蓝G-250法，用牛血清白蛋白(BSA)测定蛋白质含量，绘制标准曲线。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。