P45071D8影响水稻株型以及盐胁迫耐性的功能及其应用

摘要

本发明公开了一个水稻P450家族成员P45071D8在调控水稻株高、叶型与胁迫耐性方面的应用。通过转基因技术创建所述转P45071D8基因水稻，获得的转基因水稻的株高、叶型和盐胁迫耐性改变的材料，因此P45071D8基因在水稻株型与胁迫耐性改良方面具有很好的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种调控水稻株高、叶型以及盐胁迫耐性的基因及其在农作物转基因改良中的应用。

背景技术

水稻株型与叶型是决定水稻产量的重要因素之一，长期以来一直是很多作物育种改良的重要目标，其调控机制备受关注。株高是影响水稻产量的一个关键因素，株高超过一定范围容易引起茎秆的倒伏而减产。20 世纪50 年代的水稻半矮秆品种选育和推广使水稻单产大幅度提高，这场水稻生产第一次“绿色革命”归功于半矮化基因sd1 的应用。20 世纪70年代以半矮化材料为亲本的杂交育种实现了水稻单产的第二次飞跃。因此，株型改良是水稻育种改良的关键性状，发掘、鉴定和利用新的矮化基因，以及阐明相关基因调控水稻株高的生理生化和分子机制，对推动水稻株型改良和高产育种具有积极的意义。

植物激素在水稻株高发育中发挥重要的调控作用，已克隆的30 多个株高基因与赤霉素、油菜素内酯和独角金内酯等激素代谢、信号转导以及激素之间的互作密切相关。如sd1、d35、d18、OsKS1、eui1、OsGA2ox6、d1、slr1、gid2、gid1等与赤霉素密切相关；brd1、d2、d11、osdwarf4、brd2、d61、OsBZR1、dlt与油菜素内酯相关；d10、htd1/sd-t、d27、htd2/d88/d14参与独角金内酯信号；tdd1和OsIAA1与生长信号调控水稻株高，这些研究为解析水稻株高的遗传调控机制以及水稻株型的遗传改良奠定了良好的基础。

盐对植物造成伤害有离子导致的渗透胁迫和离子毒害。植物在受到盐胁迫时，往往改变自身形态以适应胁迫。土壤的盐渍化是限制和危害农作物生长，造成作物减产最严重的非生物胁迫之一。目前全球约20%（10 亿hm2）的耕地受到盐渍化危害，我国耕地盐渍化已达1 亿hm2，有15亿亩内陆盐碱地，3500多万亩沿海滩涂，严重制约作物品种的推广及其高产、稳产和优质，因此，培育耐盐农作物将提高盐碱土地的利用率，实现粮食增产，对农业可持续发展具有重要的战略意义。水稻是盐敏感作物，低盐胁迫就表现出受害症状，最终导致显著减产。水稻耐盐性是由多基因控制的复杂数量性状，遗传改良是解决水稻耐盐性的有效途径之一，因此分析水稻盐胁迫相关基因的功能，有助于阐释水稻耐盐的生化与分子机制，为耐盐性的遗传改良提供理论基础与基因资源。

细胞色素P450(cytochrome P450，简称P450）是一类以血红素为辅基的B 族细胞色素超家族蛋白酶。植物细胞色素P450 具有广泛的催化活性，涉及萜类、生物碱类、甾醇类、脂肪酸、色素、黄酮类、植物激素和信号分子等的合成和代谢反应。研究发现水稻细胞色素P450蛋白BR-6氧化酶、CYP90D2、 CYP724B1和 CYP90B2在调控水稻株高过程中具有重要的作用。

发明内容

本发明人创建水稻P450 71D8基因过表达的转基因水稻，证实P450 71D8调控水稻株高、叶型及其对盐碱逆境的应答反应，在正常生长状态下，P450 71D8转基因水稻株高降低、叶片变宽、对盐胁迫的耐性增强，表明P450 71D8基因在水稻农艺性状与胁迫耐性方面具有应用价值。

本发明提供的技术方案是：一种水稻P450 71D8基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，P450 71D8基因过表达影响水稻株型和盐胁迫耐性形成等过程。

本发明还提供所述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供包含所述的基因的表达载体，优选为植物表达载体。

本发明还提供包含所述的基因的宿主细胞。

本发明还提供所述的基因在培育抗逆作物品种的应用，是将包括所述基因的表达载体导入植物中，筛选获得抗逆性提高的植株，优先为水稻，所述抗逆性质为盐胁迫敏感。这样可以制作盐胁迫敏感的水稻品种材料。

本发明还提供所述的基因在培育改变了水稻株型的应用，是将所述基因导入植物中，筛选获得改变了水稻株高降低、叶片变宽，所述植物为农作物，优选为水稻。

通过本发明可以通过转基因技术，使水稻中的P450 71D8基因表达提高，因而可以获得抗逆性（盐胁迫）增强、株高降低和叶片变宽的水稻品种。

本发明研究表明P450 71D8调控水稻株型及其在水稻应答盐碱逆境胁迫反应中发挥重要的作用。通过转基因技术创建P450 71D8基因超表达转基因水稻，转基因水稻株高降低、叶片变宽，且盐胁迫耐性增强，表明该基因在水稻株型与耐盐性的改良中具有很好的应用前景，进而可以利用该基因进行水稻重要农艺性状和胁迫耐性的遗传改良。

附图说明

图1转P450 71D8基因水稻的分子鉴定，A：DNA水平检鉴定转基因水稻；B：RNA水平鉴定转基因水稻。

图2 P450 71D8调控水稻的株高与叶型。

图3 P450 71D8调控水稻的耐盐性。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例一：转基因水稻材料的创建与鉴定

1、P450 71D8基因重组植物表达载体的构建

以P450 71D8（基因号：Os09g0483600）编码区序列为模板，利用引物P450 71D8-F 5'-AGTGGATCC ATGTTCCCCCCCAAAATAAAAG-3'，P450 71D8-R 5'-GG CGGTACCCTATAAGACAGTTGACAAAG-3'从cDNA文库中PCR扩增P450 71D8全长为1617bp（序列如SEQ IDNO:1所示）的目的片段，利用BamHI和KpnI对PCR片段和植物表达载体pCAMBIA1205进行双酶切，利用T4 DNA连接酶将酶切产物进行连接16小时，然后进行通过42度热激转化将载体质粒转入大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆进行测序分析，获得P450 71D8基因的植物表达载体pCAMBIA- P450 71D8，导入农杆菌AGL0中。进一步利用农杆菌介导法侵染越光水稻的愈伤组织，分化后获得转基因植株。

、农杆菌侵染愈伤发转化水稻

1）水稻胚愈伤的诱导与继代：将水稻种子（越光）脱壳，用75%乙醇浸泡1min，用次氯酸钠溶液浸泡30min，无菌水冲洗，用次氯酸钠重复浸泡15min，用无菌水冲洗。将灭菌后的水稻种子于灭菌滤纸上晾干，种于诱导培养基中。28℃暗培养2周。分离愈伤组织转移至诱导培养基28℃继代3次。挑取颜色淡黄且质地松散愈伤颗粒28℃暗培养3天。

2）菌种活化及扩繁：在28℃条件下，将含有目的基因表达载体（pCAMBIA-P45071D8）的农杆菌于YEB固体培养基上划线培养2天。

3）农杆菌与愈伤组织的共培养：取适量菌体悬浮于100μM AS+AA液体培养基中，菌液OD值达0.3时，使愈伤组织浸入菌液中，轻摇20分钟。弃菌液，取出愈伤，滤干多余菌液，转移到NB固体培养基上22℃暗培养3天。

4）筛选抗性愈伤：挑选共培养的愈伤组织，无菌水漂洗，滤干后铺于筛选培养基上，28℃暗培养2周后继代一次。

5）预分化与分化：选生长旺盛呈乳白色的愈伤组织转至预分化培养基上，28℃暗培养1周，28℃光照培养2周，见到绿点时继代一次，4周后分化成苗。

6）生根与壮苗：将长势较好的幼苗移至生根培养基上，培养2周后移栽。

7）将生长正常的转基因苗移栽温室培养至种子的收获。

8）得到的转基因阳性植株的幼苗。

、转基因水稻材料的鉴定

T0代水稻移栽至土壤中驯化培养，待其长势稳定、状态良好时，剪取叶片CTAB法提取不同水稻材料的基因组DNA，利用植物表达载体上潮霉素抗性基因（特异性引物为：上游引物和下游引物分别为5-GCAAACTGTGATGGACGA-3 ，5-AAGAAGATGTTGGCGACCT-3）通过PCR鉴定各转基因株系中的阳性材料，以越光水稻(WT)的基因组DNA为负对照，以植物表达载体pCAMBIA1205（CK）的质粒DNA为正对照，DNA 水平PCR结果证实4个转基因株系(OE1-OE4）均为阳性（图1A）。然后提取DNA水平鉴定为阳性的转基因株系叶片的RNA，反转录得cDNA第一条链，以P450 71D8基因的特异引物（上游引物5-GGGAGGATGCTGAGACATT-3 ，下游引物5-CCCAATCAAAGTGGTAAAGC-3）通过荧光定量PCR鉴定过表达植株中P450 71D8的表达水平，OsActin（Os03g0718100特异引物为：上游引物5'-GGACCCAAGAATGCTAAGCC-3'，下游引物5'-TGGTACCCTCATCAGGCATC-3'）的表达作为内参，证实4个转基因株系植株中P450 71D8基因表达水平分别是野生型（WT）的2-4倍（图1B），从RNA 水平上确定（OE1-OE4）均为转P45071D8基因的阳性株系。

实施例二：P450 71D8影响水稻株高与叶型

本发明人发现 P450 71D8过表达的水稻株高降低，P450 71D8过表达的转基因水稻从苗期开始就比非转基因的植株低（图2A），在分蘖期（图2A）和抽穗期都明显低于野生型水稻，高度只有非转基因的60%左右（图2C），此外在成熟期，转基因水稻上部的的第一叶片（旗叶）比非转基因水稻的叶片明显变宽和变短（图2D），这些水稻株高和叶型的变化，表明P45071D8参与水稻株高与叶型的调控过程，该基因的转基因应用可以改良水稻株高与叶型，在水稻生产中具有很好的应用前景。

实施例三：P450 71D8过表达提高水稻的耐盐性

本发明人对1周的非转基因（WT）越光和转 P450 71D8基因水稻材料用1%的NaCl溶液处理6天，然后去掉盐水，恢复正常浇水培养4天，观察处理后转基因水稻与野生型水稻间的耐盐性差异，结果如图3所示， 盐处理恢复给水培养4天后，野生型植株（WT）几乎全部枯黄而死亡，而P450 71D8过表达的转基因水稻能存活下来，绝大部分植株在盐处理后能正常生长，叶片保持绿色鲜嫩，表明P450 71D8过表达可以提高转基因水稻的对盐的耐受性。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> P450 71D8影响水稻株型以及盐胁迫耐性的功能及其应用

<160> 2

<210> 1

<211>1617

<212> DNA

<400> 1

ATGTTCCCCC CCAAAATAAA AGAACTTCTC CCTATTTATA CCATTTCCAT GAAGTGCTCG

ACAGCTCAAA CCATGGCCAT GGTGCAAGAC ATCACCGGCT ACCTGTGCCT CTCCTTGGCT

CTCCTCTTGC TCACTCTCGT CCTCCACAAG GTGGCGAGGA AGGCGACCGG TAATGGCGCC

GGCAAGCCGA GGCTTCCGCC GGGGCCGTGG CGGCTGCCGG TCATCGGCAA CCTCCACCAG

GTCGCGATGG GCGGCCCGCT CGTCCACCGC ACCATGGCCG ACCTGGCGCG CCGGCTGGAC

GCGCCGCTCA TGTCGCTCAG GCTCGGCGAG CTCCGCGTCG TCGTCGCCTC ATCCGCCAAC

GCCGCCAGGG AGATCACCAA GACGCACGAC GTCGCGTTCG CGACGCGGCC GTGGACCTCC

ACCATCCGCG TCCTGATGAG CGACGGCGTT GGGCTGGTGT TCGCGCCCTA CGGCGCGCTG

TGGCGGCAGC TCCGCAAGAT CGCCGTGGTG GAGCTCCTCA GCGCGCGCCG CGTCCAGTCG

TTCCGCCGCA TCCGGGAGGA CGAGGTCGGC CGCCTCGTCG CCGCCGTCGC CGCCGCCCCG

GCGGCGCAGC CCGTGAACGT CAGCGAGCGG ATCGCGGCGC TCATCTCCGA CTCGGCGGTG

CGCACCATCA TCGGCGACCG GTTCGAGAGG CGGGACGAGT TCCTGGAGGG TCTCGCCGAG

GCGATCAAGA TCACCTCCGG GTTCAGCCTC GGCGACCTGT TCCCGTCGTC GAGGCTGGCC

AGCTTCGTCG GCGGCACGAC GCGGCGGGCG GAGGCGAACC ACCGCAAGAA CTTCGAGCTG

ATAGAGTGCG CTCTGAGGCA GCACGAGGAG CGGAGGGCCG CCGGCGCCGT GGACGACGAC

GAGGACCTCG TCGATGTGCT TCTCAGGGTT CAGAAGGATG GGAGCCTCCA GATGCCTCTC

ACCATGGGCA ATATCAAAGC CGTCGTCCTG GAACTTTTTG GTGCTGGGAG CGAGACATCA

GCTAATACAC TTCAATGGGC GATGACTGAG CTCATAATGA ATCCAAGAGT GATGCTGAAG

GCACAAGCTG AGTTAAGTAA CGTCATCAAA GGAAAGCAAA CGATATCTGA AGATGACTTA

GTTGAATTGA AGTACTTAAA ACTTATTATC AAAGAGACCT TAAGGTTACA TCCTGTAGTG

CCACTACTTC TCCCTAGGGA ATGTCGGGAG ACATGTGAGG TCATGGGTTA CGATATCCCC

ATAGGTACTA CTGTGCTTGT TAACGTATGG GCAATAGGTA GAGATCCTAA GTATTGGGAG

GATGCTGAGA CATTCATACC TGAACGATTT GAGGATGGCC ATATAGACTT CAAAGGAACA

AACTTTGAAT TTATACCGTT TGGAGCTGGA CGAAGGATGT GCCCTGGCAT GGCATTTGCA

GAAGTAATCA TGGAGCTCGC TCTAGCCTCA TTGCTTTACC ACTTTGATTG GGAGCTCCCT

GATGGCATCT CGCCAACCAA GGTGGACATG ATGGAGGAGT TGGGTGCTAC AATTCGAAGA

AAGAACGATC TTTACCTTAT TCCTACTGTC CGTGTGCCTT TGTCAACTGT CTTATAG

<210> 2

<211> 536

<212> 氨基酸

<400> 2

MFPPKIKELL PIYTISMKCS TAQTMAMVQD ITGYLCLSLA LLLLTLVLHK VARKATGNGA

GKPRLPPGPW RLPVIGNLHQ VAMGGPLVHR TMADLARRLD APLMSLRLGE LRVVVASSAN

AAREITKTHD VAFATRPWTS TIRVLMSDGV GLVFAPYGAL WRQLRKIAVV ELLSARRVQS

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