闪蒸气相色谱法测定四神丸中指标性成分的方法

摘要

本发明提供了一种闪蒸气相色谱法同时测定四神丸中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，包括：闪蒸气相色谱法检测四神丸样品获取定性分析结果、外标法建立标准工作曲线、获取四神丸样品中指标性成分的定量分析结果3步；本发明一方面闪蒸气相色谱采用固体样品直接进样，无需复杂提取过程，无溶剂使用，故操作简便，环保；另一方面通过闪蒸气相色谱方法对四神丸中指标性成分进行定量检测，能够有效节省实验时间、简化实验步骤；因此，本发明的质量评价方法具有简单、环保、高效的特点，该检测技术对四神丸质量评价具有十分深远的意义。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种闪蒸气相色谱法测定四神丸中指标性成分的方法，具体涉及一种闪蒸气相色谱法同时测定四神丸中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法。

(二)背景技术

四神丸是一种中成药名，为固涩剂，具有温肾散寒，涩肠止泻之功效，用于肾阳不足所致的泄泻，症见肠鸣腹胀、五更溏泻、食少不化、久泻不止、面黄肢冷。四神丸是由肉豆蔻、补骨脂、五味子和吴茱萸四味药以及大枣、生胶制成，其中骨脂补命火，散寒邪，为君药；吴茱萸温中散寒，肉豆蔻温暖脾胃，涩肠止泻，均为臣药；五味子收敛固涩，是为佐药；生姜暖胃散寒，大枣补益脾胃，同为使药。

《中华人民共和国药典》(2015版)规定，每克四神丸中补骨脂素和异补骨脂素的含量总和不得少于3mg。补骨脂素和异补骨脂素的含量是中药补骨脂的主要成分，也是《药典》中评价补骨脂生药材的指标性物质。《药典》中对四神丸的质量评价只有补骨脂标志性物质的含量要求，而对其他三味中药(肉豆蔻、五味子和吴茱萸)却没有质量评价。《药典》(2015版)规定，肉豆蔻中挥发油含量不得低于6％，去氢二异丁香酚含量不得低于0.1％；五味子中五味子醇甲的含量不得低于0.4％；吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量之和不得少于0.15％，柠檬苦素的含量不得低于0.2％。由于柠檬苦素是一种苦味物质，其有消炎杀菌的作用，但是不是吴茱萸药材的主要活性成分，因此一般研究较多的是研究吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量。因此，为了对四神丸中的四味中药的指标性成分进行分析，有必要开发一种能同时测定其中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法。

现有文献对补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素以及五味子中五味子醇甲检测方法，常用的方法有薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法等，对肉豆蔻中的去氢二异丁香酚以及吴茱萸中的吴茱萸碱和吴茱萸次碱采用薄层色谱法和液相色谱法；但需要超临界提取、超声提取等繁琐前处理方式。对四神丸样品中的这些物质的测定，通常采用液相色谱法，除了需要繁琐的提取过程外，对不同物质的检测需要不同检测波长，进一步加大了检测工作量。因此，本发明旨在开发不需前处理且能同时测定四神丸中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种闪蒸气相色谱法同时测定四神丸中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法。

本发明采用如下技术方案：

一种闪蒸气相色谱法同时测定四神丸中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，所述方法为：

(1)闪蒸气相色谱法检测四神丸样品获取定性分析结果

将四神丸样品研磨成粉末状装入裂解器中，将裂解器置于气相色谱仪进样口处，当裂解器温度达到300～350℃时进样，用气相色谱仪检测，得到气相色谱图，通过对比标准物质保留时间得到四神丸样品中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的定性分析结果；

所述气相色谱仪的检测条件为：色谱柱为弱极性柱，TRB-5石英毛细管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μm膜厚，5％甲基聚硅氧烷，美国)，柱箱升温程序为初温50℃，以5～10℃/min(优选10℃/min)速率升到200℃，再以3～5℃/min(优选5℃/min)速率升到300℃，然后在300℃保持5～15min(优选10min)；进样口温度为280～320℃(优选300℃)，检测器温度为280～320℃(优选300℃)，分流比30～50：1；载气为氮气或氦气，流速1.0mL/min；

裂解器条件：裂解炉温度300～350℃；裂解器与气相色谱仪接口温度300～350℃；

(2)外标法建立标准工作曲线

将补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲的标准品溶于二氯甲烷，配制成混合标准品溶液I；将去氢二异丁香酚、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的标准品溶于二氯甲烷，配制成混合标准品溶液II；采用与步骤(1)相同的气相色谱仪检测条件和裂解器条件，对混合标准品溶液I、II进行闪蒸气相色谱法检测，得到气相色谱图，以混合标准品溶液I、II中各标准品的浓度为横坐标、气相色谱图中各标准品的峰面积值为纵坐标绘制标准工作曲线，进而得到标准线性方程；

所述混合标准品溶液I中，补骨脂素、异补骨脂素、五味子醇甲标准品的浓度各自独立为20～10000mg/L，优选50～10000mg/L；

所述混合标准品溶液II中，去氢二异丁香酚、吴茱萸碱、吴茱萸次碱标准品的浓度各自独立为20～2000mg/L，优选50～2000mg/L；

(3)获取四神丸样品中指标性成分的定量分析结果

将步骤(1)所得四神丸样品的气相色谱图中，补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的峰面积值分别代入步骤(2)所得标准线性方程中，进而计算得到四神丸样品中各指标性成分的含量。

本发明中，为了确保样品的均匀性和代表性，粉末状四神丸中成药样品的粒径优选为80～120目。若市售的固态四神丸中成药不以粉末状形式存在，则需对其进行粉碎预处理，如对其进行研磨，过80～120目筛，制成粉末状样品。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明用闪蒸气相色谱法同时测定四神丸样品中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量，一方面闪蒸气相色谱采用固体样品直接进样，无需复杂提取过程，无溶剂使用，故操作简便，环保；另一方面通过闪蒸气相色谱方法对四神丸中指标性成分进行定量检测，能够有效节省实验时间、简化实验步骤；因此，本发明的质量评价方法具有简单、环保、高效的特点，该检测技术对四神丸质量评价具有十分深远的意义。

(四)附图说明

图1：四神丸样品(四神丸1)和6个标准品的闪蒸气相色谱-质谱总离子流图；

图2：7个市售四神丸样品在300℃下的闪蒸气相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：四神丸样品中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的定性分析

(1)仪器与试剂

美国ThermoFinnigan Trace DSQ的气相色谱/质谱联用仪(GC-MS)；美国ThermoFinniganTrace GC Ultra气相色谱仪，配氢火焰检测器(FID)；日本Frontier PY-3030D双击式纵型微型炉裂解器。

从各个药店购买当地四神丸样品，研磨后过120目筛，于60℃烘至恒重，备用。

(2)实验方法

准确称取四神丸样品(四神丸1)粉末0.5mg装入样品杯，固定于进样杆后，装入安装在GC进样口上方的裂解器，此时样品处于室温。待裂解器温度达到合适温度后，按下进样按钮，样品杯掉入炉心，挥发性成分瞬间气化，由载气带入GC进样口，进行气相色谱分析。

美国ThermoFinnigan Trace GC Ultra气相色谱仪(TRB-5石英毛细管柱，30m×0.25mmi.d.×0.25μm，膜厚5％甲基聚硅氧烷，美国)，日本Frontier PY-3040D双击式纵型微型炉裂解器。

闪蒸气相条件：UA-5金属毛细管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μm，膜厚5％甲基聚硅氧烷，日本)升温程序：初温50℃，以10℃/min速率升到200℃，再以5℃/min速率升到300℃，保持10min；进样口温度为300℃，检测器温度为300℃，分流比30：1；载气氮气或氦气，流速1.0mL/min。裂解器条件：裂解炉温度：300℃；裂解器与气相色谱仪接口温度300℃。

质谱条件为：电子轰击离子源，离子源温度250℃，传输线温度300℃，电离能量70eV，离子扫描范围40～550m/z。

(3)结果与讨论

补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱为四神丸中补骨脂、肉豆蔻、五味子和吴茱萸的质量评价的指标性物质，因此先对四神丸中这6个成分进行定性分析。图1为四神丸样品(S1四神丸1)和6个标准品的闪蒸气相色谱-质谱总离子流图。从图1中可知，四神丸样品中有6个峰与补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱6个标准品色谱峰保留时间一致；且通过质谱对四神丸中该6个峰与标准品质谱图进行比较，发现四神丸中该6个峰中质谱图与标准品对应，没有多余的碎片信息，说明该6个物质为补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱，且没有与其他物质发生干扰。结果见表1。

表1：四神丸中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的定性结果

实施例2：重现性的考察

美国Thermo Trace GC ultra气相色谱仪(TRB-5金属毛细管柱，30m×0.25mmi.d.×0.25μm，膜厚5％甲基聚硅氧烷，美国)，日本Frontier PY-3030D双击式纵型微型炉裂解器。

气相条件：升温程序：初温50℃，以10℃/min速率升到200℃，再以5℃/min速率升到300℃，保持10min；进样口温度为300℃，检测器温度为300℃，分流比30：1；载气氮气或氦气，流速1.0mL/min。

裂解器条件：裂解炉温度：300℃；裂解器与气相色谱仪接口温度300℃。

分别准确称取3份与实施例1中相同的四神丸1样品0.5mg装入样品杯，固定于进样杆后，装入安装在GC进样口上方的裂解器，此时样品处于室温。待裂解器温度达到300℃时，按下进样按钮，样品杯掉入炉心，挥发性成分瞬间气化，由载气带入GC进样口，进行GC分析。

计算色谱峰绝对峰面积的重现性(用相对标准偏差(RSD)表示)。结果显示，峰面积的RSD≤5.46％，说明在300℃下闪蒸0.5mg、120目四神丸粉末样品能保证实验结果取得良好的重现性。

实施例3：四神丸中6个指标性物质的闪蒸气相色谱方法学开发

美国ThermoFinnigan Trace的气相色谱仪日本Frontier PY-3030D双击式纵型微型炉裂解器。

气相条件为：色谱柱为TRB-5石英毛细管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μm，膜厚5％甲基聚硅氧烷，美国)柱箱升温程序为初温50℃，以10℃/min速率升到200℃，再以5℃/min速率升到300℃，保持10min；进样口温度为300℃，检测器温度为300℃，分流比30：1；载气为氮气或氦气，流速1.0mL/min。

裂解器条件：裂解炉温度：300℃；裂解器与气相色谱仪接口温度300℃。

将补骨脂素、异补骨脂素和五味子醇甲标准品配成20-10000mg/L的二氯甲烷溶液(混标)，将去氢二异丁香酚、吴茱萸碱和吴茱萸次碱标准品配成20-2000mg/L的二氯甲烷溶液(混标)，吸取1微升溶液注射在样品杯，待其溶剂挥干后固定于进样杆后，装入安装在GC进样口上方的裂解器，此时样品处于室温。待裂解器温度达到300℃时，按下进样按钮，样品杯掉入炉心，混标溶液瞬间气化，由载气带入GC进样口进行分离和分析。

考察该方法的线性、检出限和定量限等参数，结果见表2。从表2中可以看到，补骨脂素、异补骨脂素和五味子醇甲在20-10000mg/L，去氢二异丁香酚、吴茱萸碱和吴茱萸次碱在20-2000mg/L范围内线性良好，r大于0.99。6个物质检出限在0.48-3.33mg/L之间，定量限在1.59-10.00mg/L之间。且100mg/L和1000mg/L浓度下RSD小于4.75％，因此认为该方法准确性良好，可以用来测定补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱。

表2：6个标准品的线性、检出限和定量限结果

实施例4：市售四神丸中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量测定

对7个市售四神丸样品进行闪蒸气相色谱分析，测定其中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量。

图2为7个四神丸样品的闪蒸气相色谱图。表3为该6个物质的定量结果。从图2中和表3中可以看出，7个样品中都含有补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱，可认为该7个四神丸中均含有补骨脂、肉豆蔻、五味子和吴茱萸这四种中药材。根据《药典》(2015版)规定，四神丸中补骨脂素和异补骨脂素的含量之和需大于3mg/g。而表3的结果显示，7个市售四神丸样品中补骨脂素和异补骨脂素的含量之和均符合药典规定，因此认为四神丸的质量合格。而去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱这四种物质的成分在不同四神丸中含量有所差异。

表3：7个四神丸中补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量测定结果(mg/g)

实施例5：四神丸样品加标回收测试

美国ThermoFinnigan Trace气相色谱仪；日本Frontier PY-3030D双击式纵型微型炉裂解器。

气相条件为：

色谱柱为TRB-5石英毛细管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μm，膜厚5％甲基聚硅氧烷，美国)柱箱升温程序为初温50℃，以10℃/min速率升到200℃，再以5℃/min速率升到300℃，保持10min；进样口温度为300℃，检测器温度为300℃，分流比30：1；载气为氮气或氦气，流速1.0mL/min。

裂解器条件：裂解炉温度：300℃；气相裂解器接口温度300℃。

对四神丸1样品进行加标回收。对补骨脂素、异补骨脂素、去氢二异丁香酚、五味子醇甲、吴茱萸碱和吴茱萸次碱该6个物质，分别加入0.5、1.0和1.5倍测得量所对应的标准品含量，计算其加标回收率。结果见表4。结果表明，该方法加标回收率在92.6-107.5之间，RSD小于5.32％。

表4四神丸样品加标回收结果