种子植物物种的鉴定方法和用途

摘要

本发明涉及一种种子植物物种的鉴定方法和用途，包括以下步骤：选取种子植物物种，获取所述种子植物物种的ITS2基因序列，基于ITS2基因序列构建进化树，在进化树中选取多对姊妹种，计算每对姊妹种之间的遗传距离，对属于同一门物种的多组遗传距离进行差异显著性检验，选取差异不显著的遗传距离计算平均值得到分子界值；计算待测物种与目标物种间的遗传距离，将所述遗传距离与待测物种所属门的分子界值比较确定物种类别。本发明的方法只需要将待测样品或疑似的物种与目标物种的ITS2基因序列进行分歧度比较即可，更加简便易行，准确性高，客观性强，不需要对同属其它物种大量取样作为参照，具有较高的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种种子植物物种的鉴定方法和用途。

背景技术

目前物种鉴定的主要方法是形态学分类法，然而因其精确度差、主观性强、效率低，已不能满足今天人们对物种分类鉴定的要求。随着测序水平的提高和测序成本的降低，DNA序列在物种鉴定中的作用越来越突出。2003年加拿大动物学家Paul Hebert首次提出了DNA barcoding(DNA条形码)的概念。它用一段标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段，通过建立生物DNA条形码数据库，实现快速、准确和自动化的物种鉴定。DNA条形码技术是目前物种鉴定使用最广的技术，然而随着研究的深入，基于DNA条形码鉴定物种的方法越来越受到诟病，主要是因为DNA条形码技术严重依赖于参照数据库的物种覆盖度和准确性。当数据库不全的时候，待测样本由于与数据库的标准样本比对不上往往会被错误鉴定。由于物种及其近缘种往往呈世界性分布，大多数物种及其近缘种很难取样完全，这已成为限制DNA条形码技术应用的瓶颈。

已知遗传距离是衡量品种间若干性状综合遗传差异大小的指标。育种目标所要求的性状不止一个，为了能够更全面地反映亲本品种间的遗传差异，需要对多个性状综合考虑，从而引伸出遗传距离的概念。由于生物的各种性状均有基因来表达，在分子生物学中遗传距离是指不同物种或同一物种不同的群体间基因的差异程度，估计的方法主要有JC69法、Kimura双参数法（K2P法）、距离系数法、枢轴凝聚法和主成分法等，其中K2P法应用最为广泛的。以往相似的研究在鉴定物种时不考虑物种种间遗传距离数值，或在确定物种种间遗传距离时，仅仅通过同属内物种两两比较取平均值来获取，其值明显偏大。

由此可见，能否基于现有技术中的不足，提供一种种子植物物种的鉴定方法和用途，能够快速、简单且准确的鉴定种子植物物种类别，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明针对上述的技术问题，提出一种种子植物物种的鉴定方法和用途，通过种子植物物种的ITS2基因序列大数据，分析了大量的姊妹种之间的遗传距离，其获取的遗传距离数值在不同的分类阶元或类群相对稳定，通过计算平均值作为种子植物物种鉴定的分子界值，可对待测物种进行较快鉴定，大大提高了鉴定的效率和准确度。

一种种子植物物种的鉴定方法，包括以下步骤：

确定分子界值：选取种子植物物种，获取所述种子植物物种的ITS2基因序列，基于ITS2基因序列构建进化树，在进化树中选取多对姊妹种，计算每对姊妹种之间的遗传距离，对属于同一门物种的多组遗传距离进行差异显著性检验，选取差异不显著的遗传距离计算平均值得到分子界值；

确定物种类别：计算待测物种与目标物种间的遗传距离，将所述遗传距离与待测物种所属门的分子界值比较，如其大于分子界值，则待测物种不属于目标物种，如其小于分子界值，则待测物种属于目标物种。

作为优选：被子植物门的分子界值为0.03361~0.04589；裸子植物门的分子界值为0.01178~0.02715。

作为优选：所述被子植物门的分子界值为0.03975；所述裸子植物门的分子界值为0.01946。

作为优选：采用邻接法构建进化树。

作为优选：以属为单位将ITS2基因序列矩阵构建得到进化树，取位于进化树的同一分支上相邻两个物种作为一对姊妹种。

作为优选：利用MEGA软件中的K2P模型计算各姊妹种的遗传距离。

作为优选：取每对姊妹种的遗传距离进行差异显著性检验，选取位于95%置信区间内的遗传距离并计算平均值。

作为优选：计算待测物种与目标物种间的遗传距离的方法包括以下步骤：提取待测物种的ITS2基因序列并测序，将待测样品的ITS2基因序列与数据库中目标物种的ITS2基因序列进行比对，计算所述待测物种与目标物种间的遗传距离。

作为优选：具体包括以下步骤：

确定分子界值：选取属内75%以上的种子植物物种，获取所述种子植物物种的ITS2基因序列，以属为单位将ITS2基因序列矩阵构建得到进化树，取位于进化树的同一分支上相邻两个物种作为一对姊妹种，计算各姊妹种的遗传距离，对属于同一门物种的多个遗传距离进行差异显著性检验，选取位于95%置信区间内的遗传距离计算平均值得到被子植物门的分子界值为0.03361~0.04589，裸子植物门的分子界值为0.01178~0.02715；

确定物种类别：提取待测物种的ITS2基因序列并测序，将待测样品的ITS2基因序列与数据库中目标物种的ITS2基因序列进行比对，计算所述待测物种与目标物种间的遗传距离，将所述遗传距离与待测物种所属门的分子界值比较，如其大于分子界值，则待测物种不属于目标物种，如其小于分子界值，则待测物种属于目标物种。

一种上述的种子植物物种的鉴定方法在鉴定中药材或入侵植物中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明提供的一种种子植物物种的鉴定方法，使用的姊妹种遗传距离为最接近物种真实遗传差异的数值，因此鉴定结果准确度更高。另外本发明所述方法使用分子界值来进行种子植物物种的鉴定，其对数据库的覆盖度要求低，只需要将待测样品或疑似的物种与目标物种的ITS2基因序列进行分歧度比较即可，本发明的方法更加简便易行，准确性高，客观性强，不需要对同属其它物种大量取样作为参照，具有较高的应用价值；

2、本发明在选取种子植物物种后，考虑到物种内存在遗传多样性且种内遗传多样性小于种间，因此对同一物种的多条序列要严格在进化树图中聚在一起，根据进化树的构建原理，聚在一起的两个物种即选取的姊妹种具有最高的基因相似性，即最近的亲缘关系，因此本发明获取的姊妹种之间的遗传差异比种内遗传多样性差异高，比同属内任何一对种间遗传差异低，最终获取的分子界值最接近物种遗传差异的界限，超过这一值即为其它物种；

3、针对中药材检验技术领域中，中药材在鉴别过程中存在着以伪乱真，同名异物和同物异名等错综复杂的混乱现象，由于本发明是基于遗传距离的角度去鉴别物种，因此通过本发明的方法进行中药材鉴定更加准确。

附图说明

图1为本发明一种种子植物物种的鉴定方法具体实施方式中被子植物APG II分类图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种种子植物物种的鉴定方法，包括以下步骤：

确定分子界值：选取种子植物物种，获取所述种子植物物种的ITS2基因序列，基于ITS2基因序列构建进化树，在进化树中选取多对姊妹种，计算每对姊妹种之间的遗传距离，对属于同一门物种的多组遗传距离进行差异显著性检验，选取差异不显著的遗传距离计算平均值得到分子界值；

确定物种类别：计算待测物种与目标物种间的遗传距离，将所述遗传距离与待测物种所属门的分子界值比较，如其大于分子界值，则待测物种不属于目标物种，如其小于分子界值，则待测物种属于目标物种。

通过种子植物物种的ITS2基因序列大数据，分析了大量的姊妹种之间的遗传距离，其获取的遗传距离数值在不同的分类阶元或类群相对稳定，通过计算平均值作为种子植物物种鉴定的分子界值，可对待测物种进行较快鉴定，大大提高了鉴定的效率和准确度。

在一可选实施例中：被子植物门的分子界值为0.03361~0.04589；裸子植物门的分子界值为0.01178~0.02715。

其中被子植物门的分子界值为0.03361~0.04589在95%的置信区间内，裸子植物门的分子界值为0.01178~0.02715在95%的置信区间内。

在一优选实施例中：所述被子植物门的分子界值为0.03975；所述裸子植物门的分子界值为0.01946。

在一可选实施例中：采用邻接法构建进化树。

在一可选实施例中：以属为单位将ITS2基因序列矩阵构建得到进化树，取位于进化树的同一分支上相邻两个物种作为一对姊妹种。

需要说明的是，以属为单位将ITS2基因序列矩阵导入MEGA软件中构建得到进化树，取位于进化树的同一分支上相邻两个物种作为一对姊妹种。

在一可选实施例中：利用MEGA软件中的K2P模型计算各姊妹种的遗传距离。

其中所述K2P模型全称为Kimura 2-parameter模型。

在一可选实施例中：取每对姊妹种的遗传距离进行差异显著性检验，选取位于95%置信区间内的遗传距离并计算平均值。

需要说明的是，将每对姊妹种的遗传距离导入SPSS软件中进行差异显著性检验。

在一可选实施例中：计算待测物种与目标物种间的遗传距离的方法包括以下步骤：提取待测物种的ITS2基因序列并测序，将待测样品的ITS2基因序列与数据库中目标物种的ITS2基因序列进行比对，计算所述待测物种与目标物种间的遗传距离。

需要说明的是，基于MEGA软件中的K2P模型计算所述待测物种与目标物种间的遗传距离。

在一优选实施例中：具体包括以下步骤：

确定分子界值：选取属内75%以上的种子植物物种，获取所述种子植物物种的ITS2基因序列，以属为单位将ITS2基因序列矩阵构建得到进化树，取位于进化树的同一分支上相邻两个物种作为一对姊妹种，计算各姊妹种的遗传距离，对属于同一门物种的多个遗传距离进行差异显著性检验，选取位于95%置信区间内的遗传距离计算平均值得到被子植物门的分子界值为0.03361~0.04589，裸子植物门的分子界值为0.01178~0.02715；

确定物种类别：提取待测物种的ITS2基因序列并测序，将待测样品的ITS2基因序列与数据库中目标物种的ITS2基因序列进行比对，计算所述待测物种与目标物种间的遗传距离，将所述遗传距离与待测物种所属门的分子界值比较，如其大于分子界值，则待测物种不属于目标物种，如其小于分子界值，则待测物种属于目标物种。

需要说明的是基于MEGA软件中的K2P模型计算所述待测物种与目标物种间的遗传距离。

本发明另一实施例提供一种上述的种子植物物种的鉴定方法在鉴定中药材或入侵植物中的应用。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的一种种子植物物种的鉴定方法及其用途，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1

一种种子植物物种的鉴定方法，包括以下步骤：

确定分子界值：根据如图1所示的《被子植物APG II分类系统（修订版）》所示的类群关系及除单型纲（银杏纲）以外的裸子植物所有的代表纲，选取了7866个物种，具体包含被子植物99个科、179个属，99个科，使其基本覆盖了被子植物的多样性，所选取的物种所在的属满足75%以上的物种覆盖度；从GenBank中下载类群的ITS2基因序列，或下载类群的ITS序列根据GenBank注释截取获得ITS2基因序列；以属为单位将所选取物种的ITS2基因序列矩阵导入MEGA软件中构建进化树，同一物种的多条序列要相邻输入，根据构建进化树的原理，选出进化树中位于同一分支相邻的两个物种作为姊妹种，各对姊妹种间具有最高的基因相似性，如表1所示，最终获取113个属的281对姊妹种。将281对姊妹种的遗传距离导入SPSS软件中进行差异显著性检验，计算遗传距离最大遗传距离、最小遗传距离、遗传距离平均值和遗传距离最大与最小比值。取位于95%置信区间内的遗传距离并计算平均值得到被子植物的分子界值：0.03975，95%置信区间为[0.03361,0.04589]；裸子植物的分子界值：0.01946，95%置信区间为[0.01178,0.02715]。

表1 113个属的281对姊妹种的种间遗传距离

确定物种类别：一种疑似药用植物黄花蒿的鉴定方法，具体实施步骤包括：

步骤一、待测物种测序：提取待测物种的DNA、PCR扩增，使用ITS通用引物ITS4和ITS5B作为PCR扩增引物，将PCR产物进行DNA测序，待测物种的序列结果如 SEQ ID No：1所示：ITS4的序列如 SEQ ID No：5所示；ITS4的序列如SEQ ID No：6所示；

步骤二、序列比对：从GenBank中分别获取目标物种黄花蒿（Artemisia>）的GenBank序列号为JQ230972、FJ528301、AY548199、KX581796和GU724282的序列，上述序列号的序列均如SEQ ID No：1所示，使用CLUSTAL X软件将待测物种的ITS2基因序列和上述全部目标物种黄花蒿（Artemisia>）的ITS2基因序列进行比对；

步骤三、计算遗传距离：将比对好的序列矩阵，导入MEGA软件，基于K2P模型（Kimura 2-parameter model）计算两者之间的遗传距离，遗传距离值为0.00446；

步骤四、鉴定：疑似药用植物黄花蒿与黄花蒿之间的遗传距离0.00446小于被子植物的分子界值0.03975（95%置信区间：0.03361-0.04589），可鉴定为黄花蒿。

实施例2

确定分子界值与实施例1所述的步骤均一致，因此在本实施例中不再赘述。

确定物种类别：一种疑似药用植物红豆杉的鉴定方法，具体实施步骤包括：

步骤一、待测物种测序：提取待测物种的DNA、PCR扩增，使用ITS通用引物ITS4和ITS5B作为PCR扩增引物，将PCR产物进行DNA测序，待测物种的序列结果如 SEQ ID No：4所示：ITS4的序列如 SEQ ID No：5所示；ITS4的序列如SEQ ID No：6所示；

步骤二、序列比对：从GenBank中分别获取目标物种红豆杉（Taxus chinensis）的GenBank序列号为AF259300、AF259292和AF259291的序列，其中GenBank序列号为AF259300的序列如SEQ ID No：2所示，GenBank序列号为AF259292和AF259291的序列均如SEQ ID No：3所示；使用CLUSTAL X软件将待测物种的ITS2基因序列和上述全部目标物种红豆杉（Taxus>chinensis）的ITS2基因序列进行比对；

步骤三、计算遗传距离：将比对好的序列矩阵，导入MEGA软件，基于K2P模型（Kimura 2-parameter model）计算两者之间的遗传距离，遗传距离值为0.00446；

步骤四、鉴定：疑似药用植物黄花蒿与黄花蒿之间的遗传距离0.06012大于裸子植物的分子界值0.01946（95%置信区间：0.01178-0.02715），排除待测样品是红豆杉的可能性。

序列表

<110> 山东大学

<120> 种子植物物种的鉴定方法和用途

<141> 2017-09-14

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 225

<212> DNA

<213> 黄花蒿(Artemisia annua)

<400> 1

cgcatcgcgt cgccccccac aattctctgt aaagggaact cgtgttttgg gggcggataa 60

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<210> 2

<211> 233

<212> DNA

<213> 红豆杉(Taxus chinensis)

<400> 2

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<210> 3

<211> 233

<212> DNA

<213> 红豆杉(Taxus chinensis)

<400> 3

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<210> 4

<211> 233

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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