苯基硼酸酯化合物及包含该化合物的过氧化苯甲酰检测试剂盒

摘要

本发明涉及过氧化苯甲酰检测技术领域，具体涉及一种苯基硼酸酯化合物及包含该化合物的过氧化苯甲酰检测试剂盒。过氧化苯甲酰检测试剂盒包含试剂储备液a和试剂储备液b；所述试剂储备液a是pH值为6～8的乙醇的磷酸盐缓冲液，所述试剂储备液b为苯基硼酸酯化合物的有机溶剂溶液。本发明的过氧化苯甲酰检测试剂盒中试剂储备液b本身荧光较弱；而与过氧化苯甲酰反应后则荧光强度会明显增强，在690nm～750nm处产生强吸收，并在706nm处荧光显著增强，该荧光发射波段为近红外光区，背景干扰少，因此具有较高的准确性和灵敏度；并且该荧光探针对过氧化苯甲酰具有特异性，不受其他常见的无机盐离子和氧化物种的干扰。

说明书

技术领域

本发明属于过氧化苯甲酰检测技术领域，具体涉及苯基硼酸酯化合物及包含该化合物的过氧化苯甲酰检测试剂盒。

背景技术

近年来，随着人们生活水平的提高，食品安全问题也越来越受到人们的关注。保障食品安全是建设健康中国、增进人民福祉的重要内容，是以人民为中心发展思想的具体体现。“十三五”国家食品安全规划将食品安全抽检情况列为食品安全工作考核的重点内容，食品安全抽检覆盖全部食品类别、品种。食品添加剂是引起食品问题的主要原因，在众多的食品添加剂中，过氧化苯甲酰是重要的食品增白保鲜剂，被广泛应用于食品、化工和医药领域。在食品领域它经常被用作小麦面粉的漂白剂，此外其还能起到抗菌、催熟等作用。

然而，过氧化苯甲酰(benzoyl peroxide)在解决我们日常生活、生产所需时潜藏着巨大的安全隐患。作为活性氧物种的过氧化苯甲酰的过多添加会导致食品中的营养成分如维生素A、维生素E和维生素B1等的降解，过氧化苯甲酰还会加重肝脏负担，促发癌变，对外周血可以产生遗传性毒副作用。另外，食品中的过氧化苯甲酰在食品加热过程中能产生苯自由基，进而会形成苯、苯酚、联苯等有毒物质，对人体都有巨大的损伤，自由基加速人体细胞衰老，导致动脉粥样硬化，甚至诱发多种疾病。基于此，很多国家和地区都严控过氧化苯甲酰的使用。我国于2011年5月1日起正式禁用过氧化苯甲酰在面粉中的添加。但可在小麦粉和杀菌剂中使用。

目前，用于过氧化苯甲酰检测的方法有高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱与色谱联用、离子色谱、化学发光法、电化学等。过氧化苯甲酰的非法添加主要发生在食品中，食品是国民生产生活的必消品，即使是抽检也会有大量的样品，因此需要更加便捷快速的检测方法。

中国申请CN201110084232.6公开了一种面粉违禁添加剂过氧化苯甲酰快速检测试剂盒，由反应试剂、显色剂、阳性对照试剂储备液和标准比色卡组成；反应试剂是浓度100mg/L至300mg/L的亚铁离子酸性水溶液；显色剂是浓度0.5mol/L至0.75mol/L的硫氰酸根水溶液；阳性对照试剂储备液是浓度500mg/L至1500mg/L的过氧化苯甲酰乙醇溶液；标准比色卡包括若干小色块，每个色块对应过氧化苯甲酰浓度。其检测原理是利用过氧化苯甲酰的强氧化性，将反应试剂中的亚铁离子氧化成三价铁离子，三价铁离子再在酸性溶液中与显色剂中的硫氰酸根发生显色反应，生成橙红色硫氰酸铁配合物，橙红色配合物颜色的深浅与过氧化苯甲酰含量呈相关性进行半定量检测，但是这种方法具有较大的局限性，显色反应是在可见光波段，很多样品组成较为复杂，本身的色素对于显色反应具有很大的干扰性，尤其是对于生物组织或者活体组织的检测，这种检测试剂盒完全无法适用。

中国申请CN201611163372.1公开了一种过氧化苯甲酰快速检测方法，其检测原理也是利用样品中的过氧化苯甲酰可以与检测试剂形成可见光波段可显色的物质，利用与标准比色卡进行颜色比对进行半定量分析。上述常用方法中，样品前处理繁琐耗时，需要对样品进行提取，才可进行显色反应；而且需要进行两次比色判断，成本高，不便于过氧化苯甲酰的快速检测，不易推广使用。

因此，建立一种能灵敏快速检测过氧化苯甲酰含量的新方法，为基层质检部门提供技术支持，实现过氧化苯甲酸的安全使用是非常有意义的。

光学探针是一种可与目标物质发生反应并引起光学(包括发光、荧光、吸光)性质的变化。借助于如荧光光谱仪、荧光成像显微镜等手段，可以定性甚至定量外界刺激的强弱，从而实现分析检测的目的。荧光探针主要是依靠荧光信号为检测手段，通常有荧光的增强、淬灭或者发光波长的变化。荧光探针通过分子的发光现象和吸收光谱的变化来探测分子间的相互作用，其优点可以概括为以下几个方面：(1)方便快捷，具有很高的灵敏度；(2)可以利用光纤技术实现单细胞的实时检测；(3)如果在吸收光谱上有比较大的变化，可以在不借助于任何仪器的情况下，直接通过颜色的变化来达到检测的目的。

荧光光谱法灵敏度高、选择性好,获得的信息直观、准确,能科学表达解释复杂样品的结构、分布、含量及生理功能等，因此，得到分析检测领域科研人员的关注。但是，荧光光谱法的建立也存在一些难点，许多生物体及其组织在可见光的激发下自身会发射荧光，严重干扰生物样品的荧光检测和造影，如血浆中血清蛋白的荧光波长范围为325nm～350nm，还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶(NADPH)和胆红素的荧光波长范围为430nm～470nm，故使得荧光分析的灵敏度和准确性受到了很大的影响。发射波长在可见光波段的荧光探针在应用于生物活体或生物样品分析时灵敏度和准确性不足，需要开发可以有效避免生物组织本身荧光干扰的新型探针化合物。

近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长为600nm～900nm，光渗透组织可达数厘米，优良的生物组织穿透能力与抵抗背景干扰能力，近红外荧光检测在生物样品分析中已显示出明显优越性。鉴于此，开发发射波长属于近红外光区的荧光检测试剂盒，对于生物样品中过氧化苯甲酰的检测具有重要的价值。

发明内容

为了解决现有技术中过氧化苯甲酰检测方法选择性差，样品前处理繁琐，显色特性属于可见光区段，灵敏度和准确性受到生物样本本身的显色反应的干扰会大大下降，因而不适合生物样品检测的缺陷，一方面，本发明以三碳菁IR-780骨架衍生物作为荧光团，以邻位取代的苯基硼酸酯作为识别基团，设计合成了一种可在近红外发射波长范围内检测过氧化苯甲酰的化合物，另一方面，本发明还提供了一种基于荧光探针方法的过氧化苯甲酰检测试剂盒及其检测方法。

本发明提供式(I)所示的苯基硼酸酯化合物，

本发明提供式(I)所示的苯基硼酸酯化合物的制备方法，包括如下步骤：

步骤(A)在碱存在的条件下，式(IV)所示的化合物与式(V)所示的化合物经取代分解重排反应，得到式(II)所示化合物；

步骤(B)在碱存在的条件下，式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物发生亲核取代反应，得到式(I)所示苯基硼酸酯化合物；

进一步地，上述苯基硼酸酯化合物的制备方法中，步骤(A)和步骤(B)中，所述碱均选自有机碱或无机碱；其中，所述有机碱选自三乙胺、二异丙基乙基胺或吡啶中的至少一种；所述无机碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或碳酸氢钠中的至少一种。

进一步地，上述苯基硼酸酯化合物的制备方法中，步骤(A)中，式(IV)所示的化合物、式(V)所示的化合物和碱的投料摩尔比为1：1～5：0.5～5；在一些实施方案中，投料摩尔比为1：2.5：2.5，步骤(A)的反应时间根据投料量的不同为1小时～24小时，投料量增加，反应时间相应延长。反应优选在惰性气体，如氮气或氩气中反应。

步骤(B)中，式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和碱的投料摩尔比为1：1～1.5：1.5～2，在一些实施方案中，投料摩尔比为1：1.5：1.5；步骤(B)需严格控制反应时间，隔时进行薄层色谱TLC检测反应进程，在一些实施方案中，所述步骤(B)的反应时间根据投料量的不同为2小时～4小时，投料量增加，反应时间相应延长。反应优选在惰性气体，如氮气或氩气中反应。

进一步地，上述苯基硼酸酯化合物的制备方法中，步骤(A)中，反应温度为30℃～60℃，反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙腈中的至少一种，在一些实施方案中，反应的反应温度为40℃～50℃；步骤(B)中，反应温度为20℃～60℃，反应溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、乙腈中的一种，在一些实施方案中，反应温度为40℃～50℃。在步骤(A)和步骤(B)中，反应溶剂的用量以完全溶解反应物为准，无需特别限定其用量。

本发明苯基硼酸酯化合物(I)的制备方法，简便易行，后处理简单，易于规模化生产。

本发明还提供一种过氧化苯甲酰检测试剂盒，包含试剂储备液a和试剂储备液b；所述试剂储备液a是pH值为6～8的乙醇的磷酸盐缓冲液，所述试剂储备液b为式(I)所示苯基硼酸酯化合物的有机溶剂溶液，所述有机溶剂选自二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈中的至少一种。

进一步地，本发明所述的过氧化苯甲酰检测试剂盒中，所述试剂储备液a中的磷酸盐选自Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和KH₂PO₄中的至少一种，试剂储备液a中乙醇的体积百分浓度为10％，所述磷酸盐的摩尔浓度为5mM～15mM；所述试剂储备液b中式(I)所示苯基硼酸酯化合物的浓度为0.01mM～1mM。在一些实施方案中，所述试剂盒中的试剂储备液a和所述试剂储备液b的体积比为200/1。

进一步地，本发明所述的过氧化苯甲酰检测试剂盒中，所述试剂储备液a的pH值为7.4，其中磷酸盐的摩尔浓度为10mM；所述试剂储备液b中式(I)所示苯基硼酸酯化合物的浓度为0.01mM～1mM。

本发明所述的过氧化苯甲酰检测试剂盒的检测原理：

试剂储备液b中的苯基硼酸酯化合物(I)作为探针，其本身的荧光强度较低，过氧化苯甲酰可导致化合物(I)中的苯硼酸频哪酯氧化、电子发生重排，最终重新释放具有强荧光团的化合物(II)，该化合物的荧光在690nm～750nm处显著增强，在706nm处具有最强荧光，因此可将此性质用于过氧化苯甲酰检测；荧光强度的变化与过氧化苯甲酰的浓度呈比例，通过测定相关荧光信号的变化可测定过氧化苯甲酰的含量。反应过程如下：

还在另一方面，本发明提供所述的过氧化苯甲酰检测试剂盒测定样品中的过氧化苯甲酰含量的检测方法，其包含以下步骤：

(1)制备标准曲线

以635nm～690nm作为激发波长，测定一系列不同浓度的过氧化苯甲酰标准品溶液在发射波长690nm～750nm处的荧光强度记为F，测定试剂空白在发射波长处的荧光强度，记为F₀，荧光强度差值ΔF＝F–F₀，以过氧化苯甲酰的浓度C为横坐标，荧光强度差值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线，其中，所述不同浓度的过氧化苯甲酰标准品溶液是由试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和过氧化苯甲酰标准储备溶液配制得到的；

(2)检测样品中过氧化苯甲酰的浓度

将步骤(1)制备的过氧化苯甲酰标准品溶液替换为待测样品，向其中加入试剂储备液b，按照步骤(1)所述方法检测待测样品在与步骤(1)相同的发射波长处的荧光强度，记为F’，将所述F’代入步骤(1)所得标准曲线，进而得到待测样品中过氧化苯甲酰的浓度。

在一些实施方案中，使用所述的试剂盒时，其中，所述一系列不同浓度的过氧化苯甲酰标准品溶液由试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和过氧化苯甲酰标准储备溶液配制而得，所述过氧化苯甲酰标准储备溶液中，试剂储备液b添加量均相等，溶剂主要为试剂储备液a；所述一系列不同浓度的过氧化苯甲酰标准品溶液的溶剂为试剂储备液a，体积均为2mL，浓度依次为0μM、0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM、5.0μM、5.5μM和6.0μM。检测荧光强度后，发现过氧化苯甲酰浓度在0.5μM～4μM之间时，浓度与荧光强度之间呈线性关系，相关度R达到0.99以上，可进行定量检测。

使用本发明中所述试剂盒时，激发波长可选630nm～690nm波长段，其中在一些实施方案中，选择激发波长635nm；在另一些实施方案中，选择激发波长670nm；发射波长可选690nm～750nm波长段，其中在一些实施方案中，选择发射波长706nm；在另一些实施方案中，选择发射波长700nm。

还在另一方面，本发明还提供了另一种使用所述的过氧化苯甲酰检测试剂盒测定样品中的过氧化苯甲酰的检测方法，其包含以下步骤：

(i)测定空白对照样品的荧光强度或荧光成像

以635nm～690nm作为激发波长，向不含过氧化苯甲酰的对照样品中加入一定浓度的试剂储备液b，一定时间后用试剂储备液a清洗以除去多余的试剂储备液b，然后在发射波长为690nm～750nm处用荧光仪测定体系的荧光强度，或者是用激光共聚焦进行荧光成像；

(ii)测定待测样品荧光强度或荧光成像

向待测样品中加入与步骤(i)相同浓度的试剂储备液b，一定时间后用试剂储备液a清洗，测定体系在与步骤(i)相同的发射波长处的荧光强度或者拍摄荧光成像，并与步骤(i)测得的荧光强度或荧光成像对比；

当待测样品的荧光强度大于对照样品的荧光强度或者待测样品荧光成像亮度比对照样品荧光成像强时，则说明待测样品中含有过氧化苯甲酰。

与现有技术相比，本发明的过氧化苯甲酰检测试剂盒，具有以下特点：

1、本发明的过氧化苯甲酰检测试剂盒中试剂储备液b本身荧光较弱；而与过氧化苯甲酰反应后则荧光强度会明显增强，在690nm～750nm处产生强吸收，并在706nm处荧光显著增强，该荧光发射波段为近红外光区，背景干扰少，因此具有较高的准确性和灵敏度。

2、本发明的过氧化苯甲酰检测试剂盒，荧光产生反应速度快，20分钟内即可显色稳定。

3、本发明的过氧化苯甲酰检测试剂盒，检测灵敏度高，灵敏度高，过氧化苯甲酰浓度在大于0.5μM时即有荧光增强信号，荧光强度随过氧化苯甲酰浓度的增加而增强，在过氧化苯甲酰浓度在0.5μM～4μM之间时，荧光强度与过氧化苯甲酰浓度，之间呈线性关系，相关度R达到0.99以上。

4、本发明的过氧化苯甲酰检测试剂盒，过氧化苯甲酰对荧光的增强反应具有特异性，不受其他常见的无机盐如氯化钙(CaCl₂)、氯化镁(MgCl₂)、氯化铜(CuCl₂)、氯化亚铁(FeCl₂)、硫酸锌(ZnSO₄)、氯化铁(FeCl₃)，次氯酸根(ClO^–)、氢氧根(OH^–)、或者维生素B6、维生素C、葡萄糖、精氨酸、丝氨酸、单线态氧(¹O₂)、一氧化氮(NO)、亚硝酸根(NO₂^–)、过氧叔丁醇(TBHP)、高锰酸钾、重铬酸钾、氯酸钾、氯酸钠、高氯酸钠、碘酸钾、次氯酸钠、过氧化氢等典型氧化活性物种的干扰。

5、本发明的过氧化苯甲酰检测试剂盒，具有近红外荧光发射波长，可用荧光光谱法检测，背景信号较低，背景噪音少，适于检测成分复杂的生物样品，还适合于监测活体样本中过氧化苯甲酰的分布。

附图说明

图1为试剂盒与不同浓度的过氧化苯甲酰反应的荧光发射光谱。

图2为试剂盒用于检测过氧化苯甲酰浓度时的标准曲线。

图3为试剂盒用于各种干扰物质反应的荧光发射光谱。

图4为试剂盒检测Hela细胞中不同浓度过氧化苯甲酰的荧光强度变化。

图5为试剂盒检测孕育过氧化苯甲酰后的斑马鱼荧光强度变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所属领域的技术人员将认识到：本发明所描述的化学反应可以用来合适地制备许多本发明的其他化合物，例如，根据本发明反应条件做一些常规的修改，用于制备本发明的化合物的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。

化合物的结构是通过核磁共振(¹H-NMR、¹³C-NMR)来确定的。¹H-NMR、¹³C-NMR化学位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。¹H-NMR、¹³C-NMR的测定是用Bruker>3OD)。用TMS(0ppm)或氯仿(7.25ppm)作为参照标准。当出现多重峰的时候，将使用下面的缩写：s(singlet，单峰),d(doublet，双峰),t(triplet，三重峰),m(multiplet，多重峰),br(broadened，宽峰),dd(doublet>

柱层析一般使用青岛海洋化工200目～300目硅胶为载体。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂如IR-780碘代物和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或者可以采用或者按照本领域已知的方法来合成。

实施例中无特殊说明，反应均在氮气氛下进行；

氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氮气气球或钢釜；

说明书中无特殊说明，室温为20℃～30℃，实施例中所描述的温度误差为±5℃。

实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)反应所使用的展开剂的体系有：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。

实施例1：式(I)苯基硼酸酯化合物的制备

(1-1)化合物(III)的制备

化合物(III)可直接购买得到或者按照以下方法制备：

向一个装有Dean-Stark分水器的三口瓶中加入30mL甲苯，随后加入2-甲基苯硼酸(0.21g，1.55mmol)、频哪醇(pinacol-H₂O,0.22g,1.86mmol)，所得混合物加热回流两个小时。反应结束后，混合物用水洗(30mL×3)，除掉未反应的频哪醇和苯硼酸，然后将分出的有机相减压蒸发除去甲苯溶剂。将所得粗产品用二氯甲烷(50mL)溶解，再次水洗(30mL)后，向所得有机相中加入无水硫酸钠进行干燥，干燥后的溶液减压蒸发得到粗产物0.32g。

取所得粗产物(0.32g,1.47mmol)、NBS(N-溴代琥珀酰亚胺,0.39g,2.2mmol)、AIBN(偶氮二异丁腈,0.003g,0.018mmol)溶解到的乙腈(10mL)中。所得反应溶液在90℃下回流两个小时。室温下冷却后，减压蒸除溶剂，得粗产品。所得粗产品用硅胶柱层析分离纯化，以石油醚(60～90℃)/乙酸乙酯(v/v)＝1：1作洗脱液，得到产物为白色固体(0.53g，产率80％)。

(1-2)化合物(II)的制备

将间苯二酚(86.0mg,0.78mmol)和碳酸钾(102mg,0.78mmol)溶解于乙腈(20mL)中，在室温及氮气保护下搅拌10分钟，然后将溶解于乙腈(1mL)中的化合物(IV)(即IR-780碘代物,207mg,0.31mmol)加入到体系中。将反应混合物在50℃下反应4小时，反应完毕，减压蒸除溶剂，得粗产品。用硅胶柱层析纯化粗产品，以石油醚(60～90℃)/乙酸乙酯(1：1，v/v)作洗脱剂，得到产物为蓝绿色粉末(67.3mg,产率52.6％)。

化合物(II)的结构表征数据结果如下：

氢谱：¹H>3):δ(ppm)8.03(d,1H,J＝14.2Hz),7.28-7.23(m,3H),7.19(d,1H,J＝9.2Hz),7.04(t,1H,J＝7.6Hz),6.81(d,1H,J＝7.6Hz),6.74(d,1H,J＝8.8Hz),6.51(s,1H),5.61(d,1H,J＝14.2Hz),3.76(t,2H,J＝7.2Hz),2.67(t,2H,J＝6.0Hz),2.61(t,2H,J＝6.0Hz),1.91-1.78(m,4H),1.66(s,6H),1.06(t,3H,J＝7.6Hz).

碳谱：¹³C>3OD):δ(ppm)174.5,173.7,163.8,158.5,144.0,142.2,141.6,140.3,131.1,129.9,126.1,123.5,123.2,121.9,116.2,115.9,112.0,103.6,100.1,50.4,46.6,29.6,29.0,25.3,22.1,21.8,11.9.

式(II)所示化合物的制备还可以按照以下表1的实验条件进行。

表1：

按照上表1的实验条件，均可以得到化合物(II)。

(1-3)化合物(I)的制备

将化合物(II)(40mg,1.0mmol)和碳酸钾(20mg,1.5mmol)溶解于乙腈(4mL)中，在室温及氮气保护下搅拌10分钟，然后将溶解于乙腈(1mL)中的化合物(III)(20mg,1.0mmol)加入到混合溶液中，将反应混合物在50℃反应2.5小时。反应完毕，加入二氯甲烷(20mL)稀释混合物，依次用水(5mL)和饱和碳酸钠水溶液(5mL)洗涤。然后用无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸除溶剂，得粗产品。用硅胶柱层析提纯粗产品，二氯甲烷/甲醇＝10：1，得到产物为深蓝色固体(25mg，36％)。

化合物(I)的结构表征数据结果如下：

氢谱：¹H>

碳谱：¹³C>

式(I)所示苯基硼酸酯化合物的制备还可以按照以下表2的实验条件进行。

表2：

按照上表2的实验条件，均可以得到化合物(II)。

反应温度为40℃～50℃，式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和碱的投料摩尔比为1：1.5：1.5，综合反应效果最佳。

实施例2：式(I)所示荧光探针与不同浓度过氧化苯甲酰反应的光谱性质

先配制含乙醇的10mM PH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，按照本领域常规操作方法配制磷酸盐浓度为10mM，pH为7.4的含乙醇的磷酸盐缓冲液，其中乙醇的体积百分浓度为10％，PBS配制使用NaHPO₄-KH₂PO₄体系，因此磷酸盐浓度指的是NaHPO₄和KH₂PO₄的总浓度，然后，所配制的溶液作为试剂储备液a。将实施例1制备得到的苯基硼酸酯化合物(I)配制成浓度为1mM的溶液作为试剂储备液b，所选用的溶剂为乙腈，得到试剂储备液b。经验证，用于配制试剂储备液b有机溶剂的种类不影响检测效果，换用二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺为溶剂时效果一样。试剂盒中的试剂储备液a和试剂储备液b的体积比为200/1。

取试剂储备液b(1mM，20μL)溶于试剂储备液a中，用试剂储备液a或乙醇定容到2mL。此时，苯基硼酸酯化合物(I)即探针浓度为10μM。然后，通过加入不同体积的过氧化苯甲酰标准储备溶液(1mM)，最终配制得到一系列不同浓度的过氧化苯甲酰标准品溶液，其中的过氧化苯甲酰的浓度依次为0μM、0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM、5.0μM、5.5μM和6.0μM。一系列含不同浓度的过氧化苯甲酰标准品的反应液的体积均为2mL。所得的混合溶液在37℃下反应20min，荧光仪F-4600测量其荧光激发光谱和荧光发射光谱，激发和发射的狭缝宽度为10nm。荧光发射光谱测定时以670nm为激发波长，得到不同浓度的过氧化苯甲酰标准品溶液的发射光谱如图1所示。

荧光发射光谱测定时以670nm为激发波长，测定一系列不同浓度的过氧化苯甲酰标准品的溶液在发射波长为706nm处的荧光强度，记为F；测定试剂空白在发射波长为706nm处的荧光强度，记为F₀，荧光强度差值ΔF＝F–F₀，以过氧化苯甲酰的浓度C为横坐标，荧光强度差值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线如图2所示。

标准曲线对应的线性回归方程为：ΔF＝676.3×[BPO](μM)–100.1，(R²＝0.993)，由标准曲线可知，过氧化苯甲酰浓度在0.5μM～4μM之间时，浓度与荧光强度之间呈线性关系，相关度R达到0.99以上。在线性范围内，向待测样品中加入试剂储备液b，检测待测样品在发射波长处的荧光强度，将该荧光强度代入标准曲线，就可得到待测样品中过氧化苯甲酰的浓度。其中，过氧化苯甲酰[BPO]的浓度单位为μM。

根据本领域常规试验方法，在11次重复实验后得出该探针的检测限(S/N＝3)为47nM。

本实施例中的磷酸盐缓冲溶液按照本领域常规的PBS配制方法配制，试剂储备液a中的磷酸盐选自Na₂HPO₄、NaH₂PO₄和KH₂PO₄中的至少一种，磷酸盐的摩尔浓度可以为5mM～15mM；试剂储备液b中式(I)所示荧光探针的浓度可以为0.01mM～1mM。常用的试剂储备液a为浓度10mM，pH为7.4，含乙醇10％的PBS缓冲液，试剂储备液b为浓度1mM的溶液。

上述实验结果表明，本发明中的荧光探针苯基硼酸酯化合物(I)具有以下特点：

1、荧光探针苯基硼酸酯化合物(I)在溶液中荧光信号极低，背景信号较低；但随着过氧化苯甲酰的加入，化合物(I)与过氧化苯甲酰反应后则荧光强度会明显增强，在690nm～750nm处产生强吸收，并在706nm处荧光最强，该荧光发射波段为近红外光区，背景干扰少，此探针具有较高的准确性和灵敏度。

2、荧光探针苯基硼酸酯化合物(I)荧光产生反应速度快，20分钟内即可显色稳定。

3、荧光探针苯基硼酸酯化合物(I)在过氧化苯甲酰浓度在大于0.5μM时即有荧光增强信号，荧光强度随过氧化苯甲酰浓度的增加而增强，在过氧化苯甲酰浓度在0.5μM～4μM之间时，荧光强度与过氧化苯甲酰浓度，呈线性关系，可进行过氧化苯甲酰的定量检测。

实施例3：含有荧光探针(I)的试剂盒与其他离子的反应情况(选择性研究)

将1mM浓度的试剂储备液b溶于试剂储备液a(10mM，pH 7.4)中配制成在10μM的荧光探针溶液，向其中分别加入等体积的各种常见的无机盐、生物介质、活性氧化物和典型氧化物，如30μM的氯化钙、氯化镁、氯化铜、氯化亚铁、硫酸锌、氯化铁；1.5mM的维生素B6、维生素C、葡萄糖、精氨酸、丝氨酸；30μM的次氯酸根、氢氧根、单线态氧、一氧化氮、亚硝酸根、高锰酸钾、重铬酸钾、氯酸钾、氯酸钠、高氯酸钠、碘酸钾、次氯酸钠、过氧化氢和6μM的过氧化苯甲酰(作为对照组)。干扰物质以浓度为10mM的试剂储备液a作为溶剂，得到一组混合溶液，均在37℃下反应20min后，使用荧光仪F-6000分别测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以670nm去激发；激发和发射的狭缝宽度为10nm。

实验结果如图3所示，图3为试剂盒用于各种干扰物质反应的荧光发射光谱。

实验结果表明，只有过氧化苯甲酰可引起荧光探针产生明显的光信号显著变化响应，证明该荧光探针对过氧化苯甲酰具有高度的选择性；其他常见的无机盐、氧化活性物种和典型氧化物干扰作用不明显。

实施例4：含有荧光探针(I)的过氧化苯甲酰检测试剂盒检测Hela细胞中不同浓度过氧化苯甲酰的荧光强度变化

Hela细胞于玻璃培养皿中贴壁生长；培养液为DMEM培养液，其中含10％胎牛血清、100mg/mL青霉素和100mg/mL链霉素；培养条件为37℃，5％CO₂；培养时间为12～24小时。在进行细胞内过氧化苯甲酰的荧光成像前，一组细胞作为空白对照，其余四组Hela细胞分别用含有不同浓度的过氧化苯甲酰(0μM、2μM、4μM、6μM)的胎牛血清的DMEM在37℃下孵育10min，用试剂储备液a(浓度为10mM、pH为7.4)清洗三次。再分别用10μM的探针溶液(将1mM的试剂储备液b用试剂储备液a进行稀释而成)分别与四组实验组细胞反应20min，用同样的试剂储备液a清洗三次。试剂储备液b与过氧化苯甲酰反应后荧光反应强度大，在生物样品检测时，使用较低浓度即可达到明显的检测效果，因此，一般稀释成10μM左右的浓度使用，试剂加入量按照本领域常规用量添加即可。

用激光共聚焦显微镜TCS SP5在635nm的激发波长下荧光成像。实验结果如图4所示，图4为试剂盒检测Hela细胞中不同浓度过氧化苯甲酰的荧光强度变化。

图4中4A为未用试剂储备液b处理过的空白对照的荧光成像，4B为没有添加过氧化苯甲酰只用试剂储备液b处理后的细胞的荧光成像，4C、4D和4E分别为用浓度2μM、4μM、6μM的过氧化苯甲酰处理过的细胞样品，加入试剂储备液b后的荧光成像。图4F～4J为图4A～4E对应的明场细胞图。

由图4中的4A和4B对比可知：Hela细胞本身无荧光，单独加入荧光探针后Hela细胞荧光微弱。由图4中的4C、4D和4E可知，Hela细胞荧光强度均较4B有不同程度的显著增强，说明在细胞样品中，过氧化苯甲酰对探针的荧光有不同程度的增强作用，且随着过氧化苯甲酰浓度的增大，荧光增强；荧光强度变化明显，可以依靠荧光强度判断出过氧化苯甲酰的浓度差别。由图4F～4J也可以看出，随着过氧化苯甲酰浓度加大，细胞荧光强度逐渐增强。

实施例5：含有荧光探针(I)的过氧化苯甲酰检测斑马鱼中不同浓度过氧化苯甲酰的荧光强度变化

斑马鱼培养于E3胚胎培养液中(15mM氯化钠，0.5mM氯化钾，1mM硫酸镁，1mM氯化钙，0.15mM磷酸二氢钠，0.05mM磷酸氢二钠，0.7mM碳酸氢钠，5～10％的亚甲蓝，pH 7.5)，用生长1天的斑马鱼进行荧光呈像。在进行过氧化苯甲酰处理前，一组斑马鱼作为空白对照，其余四组斑马鱼分别用含有不同浓度的过氧化苯甲酰溶液(0μM、2μM、4μM、6μM)培育5min，然后用试剂储备液a(浓度为10mM、pH为7.4)清洗三次；之后用10μM试剂储备液b(将1mM的试剂储备液b用试剂储备液a进行稀释而成)，培养20min，再用同样的试剂储备液a清洗三次，以洗掉多余探针。处理完成后的斑马鱼用活体成像仪进行荧光成像，激发波长为635nm，发射波长为690nm～750nm。

实验结果如图5所示，图5为随过氧化苯甲酰浓度变化，斑马鱼尾部(A1～E1)和卵黄囊部(A2～E2)荧光强度的变化。图5A1和图5A2为未用试剂储备液b处理过的空白对照的荧光成像，图5B1和图5B2为没有添加过氧化苯甲酰只用试剂储备液b处理后的斑马鱼的活体荧光成像，图5C1/5C2、5D1/5D2、5E1/5E2分别为用浓度2μM、4μM、6μM的过氧化苯甲酰处理过的斑马鱼活体样品加入试剂储备液b后的荧光成像。作为对比，图5F1～5J1为图5A1～5E1在非荧光状态下的原始照片，图5F2～5J2为图5A2～5E2在非荧光状态下的原始照片。

由图5A1和5A2可知，相同测试条件下，斑马鱼的尾部和卵黄囊部本身没有荧光，由图5B1和5B2可知，单独在斑马鱼活体中加入荧光探针后，斑马鱼的尾部和卵黄囊部荧光微弱。由图5C1/5C2、5D1/5D2、5E1/5E2可知进行不同浓度过氧化苯甲酰前处理的斑马鱼尾部和卵黄囊部的荧光强度均有所增强，并且荧光强度的增加与过氧化苯甲酰浓度呈正比。

同时，为直观观测荧光强度的变化对斑马鱼活体尾部的荧光强度进行量化检测，并对荧光强度值进行数量化分析。将加0μM过氧化苯甲酰处理的斑马鱼(5B1)荧光强度记作1.0；相比于此，加2、4、6μM过氧化苯甲酰的处理组(5C1～5E1)荧光强度分别增加了0.77、1.11和1.36的倍数，说明本试剂盒中的探针化合物是适合于检测活体内部的过氧化苯甲酰的分布的。

以上实施例4和实施例5很好的验证了，应用含有本发明式(I)所示的苯基硼酸酯化合物的试剂盒可以通过对比荧光强度或荧光成像的方式，直观地判断待测生物样品是否含有过氧化苯甲酰，不仅适用于普通生物样本(细胞)，对于复杂生物活体样本同样适用，并且在检测过氧化苯甲酰方面，本发明所提供的试剂盒反应迅速，灵敏程度高，操作简单，适于广泛应用。

综上所述，本发明的过氧化苯甲酰试剂盒是一种性能优良、使用方便的过氧化苯甲酰检测设备，在食品、医药、活体生物成像等领域中有着巨大的应用前景。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。