基于纳米给药系统筛选的三维实体瘤模型的微流控芯片及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于纳米给药系统筛选的三维实体瘤模型的微流控芯片及其应用。该芯片由键合在一起的基片和盖片组成。盖片的结构为相互连接的三个平行微通道，包括药物灌注和单层血管形成的微通道(1)，细胞外基质的连接通道(2)，和三维肿瘤多细胞球体形成的有许多“U”型槽结构(3)的微通道(4)；基片有一个利于细胞捕获的平行通道(5)。本发明可以同时进行纳米给药系统的靶向输送的实时监测及其药物毒性的在线评价，大大提高了药物评价的效率。另外，本发明具有更好的肿瘤仿生能力，为药物临床前评价提供较为准确的数据。并且微流控芯片平台具有试剂用量小，成本低廉，可同时分析多个样品等优势，具有较好的药物筛选应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术领域，特别是涉及一种用于纳米给药系统筛选的三维实体瘤微环境的微流控芯片。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病。根据最近的数据显示：全球每年有一千万新增病例，并且超过六百万人死于恶性肿瘤。2015年，我国癌症患者人数近430万人，居全球之首，死亡率占全球的22.3％，且呈持续增长趋势[1]。纳米给药系统的出现给恶性肿瘤的治疗提供了新的福音。纳米给药系统能有效解决本身在体内运输过程中水溶性差，易降解等问题，可有效提高药物循环时间、减小毒副作用、延长药物在体内的半衰期、提高疗效，在治疗人类癌症中提供了独特的优势[2-5]。然而，仅有少数纳米给药系统应用于临床，大量该系统仅仅停留在实验研究阶段[6]。其中的主要原因之一是现有的药物筛选体系的不完善，导致许多纳米给药系统临床前和临床的结果差异很大，不能最终投入最终的医药产业和抗肿瘤治疗当中[7]。

在肿瘤药物开发中,为检验药物的药效及其毒性,一般首先进行二维平面的细胞培养的模式[8]。然而,传统的细胞实验结果并不能体现其在人体内的所有特性,因为传统细胞实验中细胞所处环境较为单一，并不能完全模拟复杂的肿瘤微环境:不同细胞之间的代谢物质交换、提供化学与机械特性的三维细胞外基质结构、特定组织/器官中体液与细胞比率以及生理流体剪切力等条件都难以满足[9]。

在细胞实验证明药物有效的前提下,会进行下一步的研究——动物实验,动物实验用于进一步验证药物疗效,但是,与人体内药效相比,动物实验结果的准确性并不高[10]。主要原因如下:(1)人体内代谢与动物体内代谢并不一致；(2)动物实验的肿瘤是植入的而不是自发性的；(3)通常动物实验使用的是裸鼠,其免疫功能缺陷；(4)动物实验难以对纳米给药系统的靶向运输进行实时监测[11]。即使细胞实验和动物实验效果非常好,也不能保障临床实验的成功,据统计抗肿瘤药物的成功率只有5％[12]。此外,动物实验往往引发道德争议,特别是动物实验结果并不能很好地预测药物在人体内的药效特性前提下。好的体外实验模型与动物代谢模型能够更好地提高药物筛选的效率,节约新药开发的花费和时间[13,14]。因此，开发更接近体内微环境的体外模型来克服以上常规筛选方法的不足，是亟待解决的关键科学问题之一。

近几年发展的微流控芯片技术可有效地解决以上问题。20世纪90年代初微全分析系统(Miniaturized Total Analysis Systems,μ-TAS)概念的提出在分析仪器和生命科学领域产生了重大影响，引导化学分析设备向着微型化、自动化、快速化、集成化与便携化的趋势发展[15,16]。以微机电加工技术(MicroElectromechanical Systems,MEMS)为基础，在芯片上制作微泵、微阀、微管道、微电极、微反应器、微流量传感器、微检测器等功能单元构成微型化学系统，把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等全化学过程集成在方寸大小的芯片上来实现，可称之谓“芯片上的实验室”(Lab on a Chip)[17,18]。微流控芯片可将生物、化学、医学分析过程中的多种单元技术灵活的集成在一个可控的微小平台上，相比传统实验具有集成度高、检测时间短、试剂消耗少，并且能够与较多检测装置联合使用等优势，在分析化学和生命科学等领域占据了前沿领导地位[19-21]。其相关产业急剧增长已成为不争的事实。例如从事基因测序样本制备的Illumina，从事集成流路生产的Fluidigm，。应用于药物毒性试验的肝脏芯片的Oxford，生产数字PCR仪的Rain Dance和老牌的Bio-rad等公司，其中有的已经上市。2004年美国Business杂志将lab-on-a-chip列为“改变未来的七种技术之一”。BCC研究报道2011年和2012年微流控技术市场值分别是51亿美元和56亿美元,从最近五年13％的平均增长率发展来看,到2017年其市场值预计将达103亿美元。

随着微流控芯片技术的发展，其在细胞领域的发展相对于其他生物芯片具有独特的优势：(1)芯片微结构与人体内细胞生活组织结构尺寸相当，可与多种细胞进行三维共培养，模拟体内的细胞外基质等微环境，因而更能接近体内的真实情况；(2)芯片的微环境有利于生长因子等对细胞培养有利的重要因子的积累，通过流体的控制，实现对细胞排泄的废物清除，及时补充营养物质，形成更有利细胞生长的微环境；(3)便于对药物的运输过程进行有效的实时监测；(4)容易实现对细胞的操控，易于与检测仪器联用进行后续的研究等，这些都是传统方法无法实现的[22,23]。如Prabhakarpandian等在微流控芯片上设计和构建了与体内相似的血管网络的微通道，并利用中间的微阵列结构形成三维的肿瘤多细胞微球，从而实现在体外对靶向给药系统运输情况的实时监测[24]。哈佛大学Ingber课题组于2010年首次利用肺细胞、渗透膜以及毛细血管细胞在微流控芯片上构建了如橡皮檫大小的“肺芯片”，能在外界机械泵和调节阀的作用下模拟人体肺部的呼吸运动[25]。该“肺芯片”能够精确地模拟大鼠肺脏的很多功能，包括肺部吸入纳米粒子后作出的反应等，有望用于新药药效评价以及人体肺部毒素影响。

此外，微流控芯片的检测技术，是微流控芯片能否发挥其重要作用的关键因素。目前，微流控芯片上基于细胞的药物分析检测多采用荧光标记的方法，通过荧光显微成像装置获取数据，难以对其准确定量，且不利于系统的集成化和高通量的药物筛选[26-28]。多功能酶标仪，作为药物筛选中最重要的检测手段之一，不仅具有更高的分析速度和灵敏度，而且稳定性好，价格便宜，对细胞的刺激小，将微流控芯片与酶标仪结合进行在线的细胞活性研究，将会极大加快药物研发的进程。近年来，该联用体系用于药物筛选的研究也有少量报道[29-31]。大量的研究表明，开发高集成化、微型化的微流控芯片体外模型，如何将微流控芯片与酶标仪结合，进行全面的纳米给药系统研究，开展药物运输、分布和毒性检测等进行药效评价，将对创新药物研究起到非常重要的促进作用。

综上所述，将具有国际前沿领先技术的微流控芯片技术引入到纳米给药的药效评价研究中，可克服常规评价分析方法中模型简单、药物筛选集成性差，分析结果准确和可靠性差等问题。现拟开发新颖的具有肿瘤靶向性的纳米给药系统过设计合理的微流控芯片微通道结构，构建含有肿瘤多细胞球体、细胞外和周围血管的肿瘤微环境体外模型，对纳米给药系统的靶向输送和可控释能进行研究，同时建立微流控芯片与酶标仪联用平台，对纳米给药系统的学进行在线评价，并利用传统分子生物学手段，探索其潜在的药物作用机项目的研究成果为纳米给药系统的体外评价提供了新颖的技术平台，对药物早期研发和临床前评价研究具有十分重要的学术意义和应用价值。

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发明内容

本发明的目的在于提供一种基于三维实体瘤模型的微流控芯片。

本发明的另一目的在于提供上述芯片在纳米给药系统筛选的研究。

一种给药系统筛选用三维实体瘤模型的微流控芯片，该芯片由键合在一起的基片和盖片组成；盖片上设置有相互贯通的三个平行微通道，分别为药物灌注和单层血管形成的给药微通道(1)，包含细胞外基质层的连接微通道(2)，和具有多个“U”型槽结构(3)的三维肿瘤多细胞球微通道(4)；基片上对应于三维肿瘤多细胞球微通道的位置设置有条形凹槽的平行通道(5)。

所述连接微通道内设置有细胞外基质模拟物，优选为基底膜提取物(BME)。在给药微通道和连接微通道之间设置有脐静脉血管内皮细胞层。

给药微通道和连接微通道的内壁上设置亲水性涂层，优选为修饰聚乙烯醇(PVA)或普郎尼克PF-127涂层。

所述微流控芯片的尺寸与细胞培养板上的每个细胞培养孔孔径相匹配,且U型槽的位置能够全部容纳在一个细胞培养孔中。

所述微流控芯片的“U”型槽的内直径为150-250μm，优选为200μm,深度为250-350μm，优选为300μm,“U”型槽开口处的宽度为100-200μm，优选为150μm。有助于细胞的捕获，其形成的肿瘤多细胞球体为150-200μm，符合药物筛选研究细胞球体尺寸的要求。

所述微流控芯片的“U”型槽的位置是交叉间隔的，且基片上的有深度为10μm平行通道覆盖在此通道上，在流体力学上更大程度地让细胞进入槽中，增加细胞捕获的效率。

所述微流控芯片的连接微通道的深度比其他微通道浅，且连接微通道的两侧设置有用于贯通给药微通道和三维肿瘤多细胞球微通道的连接口，连接微通道的的宽度是连接口宽度2-3倍。使细胞外基质较大程度地保留在此通道中。

所述微流控芯片在灌注细胞前需要进行亲水性处理，如修饰聚乙6、12、24、48烯醇(PVA)或普郎尼克PF-127。

所述微流控芯片的基片和盖片以生物相容性材料制成，优选为聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。其生物兼容性强，透光性好，适合于细胞培养和荧光监测。

一种与前述微流控芯片相匹配使用的细胞培养板，所述细胞培养板上设置有容纳微流控芯片的卡槽，卡槽的位置能够使微流控芯片上的U型槽与细胞培养板上的其中一个细胞培养孔的位置相对应。

所述细胞培养板为6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。

本发明芯片在纳米给药系统筛选方面的应用，其操作步骤如下：由于表面张力和材料的疏水性，首先在连接微通道(2)中以较慢的流速灌注基底膜提取物(BME)，而后将其余(1)，(4)，(5)微通道进行亲水性处理，将1×10⁶个/mL的肿瘤细胞流入微通道(4)和(5)，使细胞捕获在“U”型槽中，培养24h。将通道(1)通入1×10⁵个/mL浓度的脐静脉内皮细胞，将所述芯片垂直放置，使内皮细胞以BME为支架形成单层的血管壁细胞层，6h后将所述芯片水平放置，并将多余的细胞清除，此时完成三维实体瘤模型的构建。将纳米给药系统通入(1)，利用纳米载体的荧光性质对其在实体瘤模型中的运输情况进行实时观测。然后将经过机械加工的96孔板装载所述芯片，可直接与酶标仪联用进行肿瘤细胞的活性检测。最后，将所述芯片中的细胞收集，进行后续的药物作用机理的研究。

本发明芯片的制作方法：

1)芯片设计：所述的芯片选取聚二甲基硅氧烷作为加工制作材料，采用近年来应用十分普遍的软光刻法进行微流控芯片的加工制作，能够大大简化制作流程并降低成本。该微流控芯片主要由三个平行通道构成，平行通道之间由连接通道相连。其中，三维肿瘤多细胞球微通道由上下层结构组成，上层结构由许多“U”型槽构成，下层基片由较浅的直通道构成，有助于肿瘤细胞的捕获和三维肿瘤多细胞球体的形成。

2)以PDMS为材料的芯片制作方法：

a.将设计的微流控芯片图形制成掩膜，图形区为透明区，可透射光，非图形区为黑色区，吸光而不能透射光。

b.在干净的硅片上甩涂一薄层负性SU-8光刻胶，采用不同类型、粘度的SU-8，胶层厚度可控制在1-300μm之间。将掩膜覆盖在硅片上，紫外线通过光掩膜使光刻胶曝光，未曝光区域用显影液溶解。硅片及表面上剩下的凸起SU-8结构用作制作PDMS基片的模阳模。

c.PDMS基片的制作：将PDMS单体(二甲基硅氧烷)与引发剂以10:1的重量比例混合，脱气后浇铸于基片阳模板上，在80℃聚合1.5小时，冷却至室温，剥离模板，得无色透明PDMS芯片。

d.将PDMS盖片和基片裁剪成相同的尺寸。在盖片的通道入口位置处打孔，作为芯片储液池。

e.将玻璃基片一起放入氧等离子体真空管中，抽真空90秒，打开高频电源，90秒后取出基片和盖片，立即键合。

有益效果

本发明所采取的细胞培养法与常规的细胞培养方法(培养瓶、微孔板等)相比，能够更好地控制和反映细胞与胞外基质之间以及细胞相互之间的调制作用，是一种更接近体内的培养方法。

另外，本发明应用于药物筛选研究可以对药物在肿瘤微环境的动态进行实时监测，这是其他培养模式难以实现的。

本发明将具有国际前沿地位的微流控芯片技术引入到靶向纳米给药系统的体外评价中，并与高灵敏度的酶标仪联用，实现药物毒性的准确、快速、高通量的检测。

本发明可同时对药物的渗透性，药物毒性以及药物作用机制进行检测，大大提高了药物筛选的效率。

整个药物筛选过程中不需要使用昂贵的仪器，并且试剂的消耗量非常的小，芯片制造成本低，易于批量生产，实现了药物筛选检测的微型化、集成化和简单化。该发明为药效学研究提供了新的技术平台，有助于药物的临床前评价和药物的早期研发等。

附图说明

图1为实施例1的微流控芯片的立体结构图a)和截面图b)；1为给药微通道，2为连接微通道，3为U型凹槽，4为三维肿瘤多细胞球体微通道，5为平行通道。

图2为实施例2制作的盖片连接通道掩膜尺寸设计图。

图3为实施例2制作的盖片左侧和右侧通道的掩膜尺寸设计图。

图4为实施例2制作的基片通道的掩膜尺寸设计图。

图5为实施例4制作的可与酶标仪联用的经过机械加工的96孔板实物图。

图6为本发明的立体结构示意图。其中，1-4为设置在盖片上的装置，5为设置基片上的装置，1为给药微通道，2为连接微通道，3为U型凹槽，4为三维肿瘤多细胞球体微通道，5为平行通道。

具体实施方式

实施例1本发明芯片的结构

本发明芯片由键合在一起的PDMS基片和盖片组成。其结构如图1所示，盖片的结构为三个平行通道，平行通道之间由连接通道相连。其中，包括药物灌注和单层血管形成的微通道(1)，细胞外基质的连接通道(2)，和三维肿瘤多细胞球体形成的具有14个“U”型槽结构的微通道(3)；基片有一个利于细胞捕获的较浅的平行通道。本发明形成的微组织与体内实体瘤微环境十分相似，可以实时观测药物在微组织的渗透情况，其“U”型结构与96孔板的每个孔相对应，有利于准确，快速的药物毒性研究。经过药物毒性研究的细胞可以从微通道中流出进行后续的药物机理研究。

实施例2以PDMS为基片和盖片的本发明芯片制作

(1)将硅片放入到浓H₂SO₄/H₂O₂(3/1)溶液煮微沸30分钟，待冷却后取出用去离子水冲洗至中性，乙醇超声5分钟后在加热板上加热30分钟。

(2)在硅片上甩涂一薄层SU-8光刻胶，通过控制甩胶速度使胶层厚度大约为50μm。将具有图2结构的掩膜与硅片贴合，紫外线通过光掩膜使光刻胶曝光。在该硅片上再进行一次甩胶厚度大约为50μm，将具有图3结构的掩膜与硅片贴合，利用紫外线进行二次曝光，未曝光的部分用显影液溶解。硅片表面上凸起的SU-8结构作为PDMS基片的阳模。然后将硅阳模进行硅烷化1小时。基片的芯片制作也是利用SU-8光刻胶，胶层厚度约为10μm。将具有图4结构的掩膜与硅片贴合，进行紫外曝光后显影，硅烷化。

(3)PDMS预聚体(单体/固化剂＝10/1混合)浇注在硅阳模上并真空脱气，然后放入70℃烘箱中固化2小时左右，然后将PDMS从阳模剥离，形成了PDMS的基片和盖片。将PDMS上的结构单元切割，盖片进行打孔。

(4)将PDMS基片与钙片盖片一起放到氧等离子体真空管中，抽真空90秒，打开高频电源，90秒后取出基片和盖片，立即键合。

实施例3利用实施例2制得的芯片形成三维实体瘤微组织

(1)如图1，将本发明所得的芯片的通道(2)灌注基底膜提取物(BME)凝胶模拟细胞外基质，接着用1％(w/v)聚乙烯醇(PVA)修饰通道(1)和(3)，防止细胞粘着在PDMS上。

(2)将浓度为1×10⁵个/mL肿瘤细胞灌注入通道(3)，使细胞均匀，有效地捕获在“U”型槽中，培养48h后形成均一的肿瘤多细胞微球。

(3)将浓度为5×10⁴个/mL人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)流入通道(1)，垂直放置芯片，使细胞贴向BME胶上生长，2h后将芯片水平放置，去除通道中多余的细胞。由于BME具有利于细胞贴壁的粘附因子和生长因子，细胞容易在BME上粘附形成血管细胞层。

实施例4利用实施例3形成的三维乳腺癌微组织进行药物毒性研究

(1)将不同浓度的药物通入通道(1)，使其透过血管壁和ECM到达肿瘤细胞所处的位置。药物处理一段时间后，加入10μL CCK-8溶液孵育2h。

(2)如图5所示，对常规的96孔板进行机械加工，能装载实施例3形成的微组织芯片，并使每孔覆盖每张芯片上所有的“U”型槽结构。

(3)把用CCK-8处理后的芯片放置在加工后的96孔板上，用多功能酶标仪测定在450nm处的吸光值。