一种匍匐筋骨草组织培养与快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种匍匐筋骨草组织培养与快速繁殖方法。包括：A，外植体选择：以生长健壮，无病虫害的植株做母株，剪取顶端幼嫩茎段作为外植体。B，外植体处理：先后用酒精和升汞溶液对外植体进行消毒处理。C，增殖：选择较为经济的6‑苄基嘌呤（6‑BA）和萘乙酸（NAA）两种激素对外植体进行诱导增殖。D，生根和移栽：增殖芽体剥离转至生根培养基，待根系发育良好后开瓶炼苗，洗净培养基，于泥炭与珍珠岩混合基质中种质。该方法操作简单，原材料经济实惠，可在短时间获得大量组培苗，供园林绿化应用。

说明书

技术领域

本发明属于观赏宿根地被植物的组培快繁技术领域。

背景技术

匍匐筋骨草是欧美原产，并从欧美引进入我国的一种新型宿根类地被花卉。匍匐筋骨草与中国原产并作为中药材长期使用的筋骨草（Ajuga>Bunge.）有本质不同。匍匐筋骨草株形矮小，四季常绿，三季彩叶，花葶30厘米左右，适合做花镜、地被、花坛、盆栽用花，花叶俱美，观赏效果极佳。然而匍匐筋骨草无法用种子繁殖，扦插繁殖系数极低，严重制约了其在园林市场的应用。急需发明一种组培繁殖配方和技术，以便其快速推向市场并在园林应用中。

发明内容

本发明提供了一种快速繁殖新型宿根花卉匍匐筋骨草的方法。通过该方法，可以在较短时间内低成本、高效率获得大量组培苗，供应市场。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种匍匐筋骨草组织培养与快速繁殖方法，包括以下步骤：

A. 外植体的选择预处理：选择生长健壮，无病虫害的植株作为取材母株，于采样前两天，应该使用80%代森锰锌或者10%甲基硫菌灵1000-1500倍液对取样母株进行全方位喷洒，使母株在后续操作中尽可能少的携带内生菌，保证外植体的消毒效果。取样时，剪取顶端幼嫩茎段，去掉叶片，只保留茎干，置于自来水中流水冲洗半小时。

B. 外植体消毒处理：将上述清洗过的外植体置于70-75%酒精中，摇动30秒，立即倒掉酒精，并用灭菌水清洗1遍，然后将外植体置于0.1%升汞溶液中，摇动8-10分钟，倒掉升汞溶液，并立即用121℃ 、0.105MPa条件下，高温高压灭菌25-30分钟并冷却的水冲洗4-5遍，每遍3-4分钟，倒掉灭菌水，外植体备用。

C. 培养基配制：接种外植体用培养基为附加了30g/L蔗糖，8g/L琼脂粉，1.5-2.0 mg/L 6-BA，0.1-0.3 mg/L NAA的通用MS培养基，用1mol/L的氢氧化钠溶液调整培养基PH值至5.7-6.0之间，121℃ ，0.105MPa条件下，高温高压灭菌25-30分钟，培养基分装放凉备用。

D. 外植体接种：将B步骤处理完毕的外植体用灭菌剪刀剪成长约1厘米的茎段，保证每个茎段上至少含有一个叶腋，然后按照生长极性插入配好的培养基中，密封，置于70-80μE/（m²·s）光照条件下，光照周期为16小时/天，培养温度为24℃±1℃。

E. 继代和生根培养：外植体在初次培养时，经过40-50天会从基部不经过愈伤，直接分化出新芽，待新芽长至2-3厘米时，就可以将新芽分离，置于新的培养基上增殖，每30-40天更换一次培养基。生根培养基配方是1/2MS培养基，附加30g/L蔗糖，以及8g/L琼脂粉，调节PH值到5.7-6.0之间，高温高压灭菌后备用。接种到生根培养基的无菌苗平均25-30天根系发育完成，即可炼苗移栽。

F. 炼苗移栽：完成生根培养的无菌苗，先拿到温室大棚，打开瓶盖一半左右，使瓶苗与外界环境相适应，两天后，将苗子连同培养基取出，流水冲洗掉培养基，适当修剪苗子基部叶片，准备移栽。移栽基质采用细泥炭和珍珠岩按照体积比3:1混合，先将含水量质量百分比80%左右的基质装填入穴盘，然后用镊子将洗净的苗子移入基质，种植完毕喷淋浇水，塑料薄膜覆盖保湿，20-30℃之间缓苗，15天左右即可成活并撤掉覆盖物。

本发明具有以下优点：

1、匍匐筋骨草目前尚未有成功的组培快繁报道，本方法为首次公开；

2、在本发明中，采用采样前预防性杀菌消毒手段，使外植体带菌率降低50%左右，大大提高了外植体的消毒效果。

3、本发明，尽可能的降低了生产成本，尤其是原材料成本，本发明所用到的6-苄基嘌呤，萘乙酸等生化试剂，都是常见，低成本的植物激素类生产原料；生根培养基无需添加任何植物激素，同样达到其他组培技术一样的生根效果，降低了生产成本，同时减少了配制难度。

4、本发明所采用的接种外植体用培养基配方，可以使外植体直接再生新芽，不经过愈伤阶段，缩短了增殖时间，提高了增殖效率，为工厂化生产极大降低了时间成本。

附图说明

图1是匍匐筋骨草的盆栽表现；

图2是匍匐筋骨草在增殖培养基中的表现；

图3是匍匐筋骨草在生根培养基中的生根表现。

具体实施方式

本发明实施例所使用的试剂，如未经特别说明，市售的均可实现本发明。

实施例1

A. 外植体的选择预处理：选择生长健壮，无病虫害的匍匐筋骨草‘勃艮第之光’作为取材母株，如图1。于采样前两天，使用80%代森锰锌或者10%甲基硫菌灵1000-1500倍液对取样母株进行全方位喷洒，使母株在后续操作中尽可能少的携带内生菌，保证外植体的消毒效果。取样时，剪取顶端幼嫩茎段，去掉叶片，只保留茎干，置于自来水中流水冲洗半小时。该预处理可以减少污染率50%左右，效果非常好。

B. 外植体消毒处理：将上述清洗过的外植体置于70-75%酒精中，摇动30秒，立即倒掉酒精，并用灭菌水清洗1遍，然后将外植体置于0.1%升汞溶液中，摇动8-10分钟，倒掉升汞溶液，并立即用121℃ 、0.105MPa条件下，高温高压灭菌25-30分钟并冷却的水冲洗4-5遍，每遍3-4分钟，倒掉灭菌水，外植体备用。

C. 培养基配制：接种外植体用培养基为附加了30g/L蔗糖，8g/L琼脂粉，1.5-2.0 mg/L 6-BA，0.1-0.3 mg/L NAA的通用MS培养基，用1mol/L的氢氧化钠溶液调整培养基PH值至5.7-6.0之间，121℃ ，0.105MPa条件下，高温高压灭菌25-30分钟，培养基分装放凉备用。

D. 外植体接种：将B步骤处理完毕的外植体用灭菌剪刀剪成长约1厘米的茎段，保证每个茎段上至少含有一个叶腋，然后按照生长极性插入配好的培养基中，密封，置于70-80μE/（m²·s）光照条件下，光照周期为16小时/天，培养温度为24℃±1℃。培养状态如图2。

E. 继代和生根培养：外植体在初次培养时，经过40-50天会从基部不经过愈伤，直接分化出新芽，待新芽长至2-3厘米时，就可以将新芽分离，置于新的培养基上增殖，每30-40天更换一次培养基。生根培养基配方是1/2MS培养基，附加30g/L蔗糖，以及8g/L琼脂粉，调节PH值到5.7-6.0之间，高温高压灭菌后备用。接种到生根培养基的无菌苗平均25-30天根系发育完成，如图3，即可炼苗移栽。步骤E所用生根培养基，不添加任何植物激素，只需要1/2MS培养基附加蔗糖和琼脂粉即可实现匍匐筋骨草快速生根，最大限度的降低生产成本，减少培养基配制难度。

F. 炼苗移栽：完成生根培养的无菌苗，先拿到温室大棚，打开瓶盖一半左右，使瓶苗与外界环境相适应，两天后，将苗子连同培养基取出，流水冲洗掉培养基，适当修剪苗子基部叶片，准备移栽。移栽基质采用细泥炭和珍珠岩按照体积比3:1混合，先将含水量质量百分比80%左右的基质装填入穴盘，然后用镊子将洗净的苗子移入基质，种植完毕喷淋浇水，塑料薄膜覆盖保湿，20-30℃之间缓苗，15天左右即可成活并撤掉覆盖物。

上述MS培养基配方如下：以下数据为母液用量，实际使用按照大量元素50 毫升/升，微量元素、有机成分、铁盐按照5毫升/升的用量进行稀释。

1/2MS的配制为上述成分各自减半使用。

本方法可以由一个茎段外植体直接诱导出幼芽，再不断繁殖得到更多的丛芽，初代增殖45天增殖系数可达到6，后代45天的增殖系数达到10，幼苗生根良好，移栽成果率达到90%以上。

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