一种同时检测小麦叶片中七种内源激素的方法

摘要

本发明公开了一种同时检测小麦叶片中七种内源激素的方法，所述内源激素为ZR、ZT、JA、SA、ABA、GA3、GA4，采用UPLC‑MS/MS，色谱条件为：流动相A：0.1％乙腈、0.05％甲酸水溶液，流动相B：甲醇，梯度洗脱。本发明的方法，特异性强，灵敏度高，通量高，结果客观易于分析，不仅可以对小麦生长发育中内源激素的失衡等进行确定，还可以为小麦外源激素的补充提供指导，减少盲目补充外源激素的现象的发生。

说明书

技术领域

本发明涉及小麦叶片内源激素的检测方法，尤其涉及一种同时检测小麦叶片中七种内源激素的方法。

背景技术

植物激素是由植物自身代谢产生的一类有机物质，并自产生部位移动到作用部位，在极低浓度下就有明显的生理效应。

植物基因的表达、生长发育以及植物对某种环境刺激的反应均受其体内多种激素的调控。植物激素是植物体内天然存在的有机化合物，虽然含量很低，但是调控植物生命活动的整个过程，因此它们与植物生长发育的基本规律和代谢的调控都密切相关。植物内源激素的研究是植物生理学领域的重要内容之一，植物内源激素在植物体内含量的准确测定，对植物生命活动和作物遗传育种、栽培等领域具有重要的意义。

赤霉素(GA)能够促进麦芽糖的转化、影响生长，防止器官脱落和打破休眠。脱落酸(ABA)能够抑制生长、促进休眠、促进果实与叶的脱落、促进气孔关闭、影响开花和性分化。茉莉酸(JA)抑制植物生长、萌发、促进衰老、提高抗性等生理作用。水杨酸(SA)是一种简单的酚类化合物，在植物的防御方面起重要作用。玉米素核苷(ZR)能够维持叶片功能，抑制衰老。玉米素(ZT)能够促进愈伤组织发芽，并且促进坐果。

目前，小麦栽培育种等过程中激素使用意识不断增强，但是由于缺乏科学的指导，激素使用现状比较混乱，为了达到提高小麦的产量与品质的目的，盲目的大量使用外源激素，而忽略植物本身激素含量水平，导致小麦体内激素含量不均衡，非但没有起到有利的效果，甚至还会出现影响小麦籽粒灌浆等问题。

如何了解小麦生长发育过程中需要的相关激素的含量，只有通过检测小麦叶片等器官中激素的真实状态，根据检测结果有针对性的调整需要的激素，检测是科学评估和个性化使用激素的科学依据。

早期植物激素的测定，基本都是采用生物测试方法，但因灵敏度和选择性不足，已被逐渐淘汰。气相色谱-质谱(GC-MS)和以单克隆抗体为基础的免疫法，都是现代植物激素检测的新技术，在GC-MS法中，选择性离子检测技术更加迅速有效，它不仅具有高的灵敏度，而且能准确鉴定激素的分子结构，但这些方法均需经冗长的样品纯化程序，设备昂贵，使用和维护成本高。目前超高效液相色谱串联质谱分析植物内源激素含量的已有报道，但是由于ABA对光敏感，JA和SA遇热不稳定，ZR和ZT在叶片尤其是衰老叶片中含量极低，GA₃、GA₄差异仅在于双键、羧基数目和位置的不同，所以还没有利用该方法同时检测小麦叶片中七种内源性激素ZR、ZT、JA、SA、ABA、GA₃、GA₄的报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种同时检测小麦叶片中七种内源激素的方法，所述内源激素为ZR、ZT、JA、SA、ABA、GA₃、GA₄，采用UPLC-MS/MS，色谱条件为：流动相A：0.1％乙腈、0.05％甲酸水溶液，流动相B：甲醇，梯度洗脱(优选的：0-0.2min，90％A，0.2-2min，90％A-10％A线性降低，2-3min，10％A，3-3.1min，10％A-90％A线性提高，3.1-5min，90％A)。

优选的：所述色谱柱为C18，1.7m，2.1×100mm，柱温为40℃。

优选的：所述质谱条件为：MS系统：ACQUITY XEVO TQ-S，电离模式：ZR、ZT为电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，JA、SA、ABA、GA₃、GA₄为电喷雾离子源负离子模式(ESI-)；源温度：150℃，脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：800L/h，锥孔气流速：30L/h，碰撞气流速：0.20mL/min，毛细管电压：正离子为3.0KV，负离子为2.5KV；脱溶剂气温度：450℃；扫描模式：多反应监测MRM；雾化气：氮气。

一种同时检测小麦叶片中七种内源激素的方法，具体步骤如下：

(1)样品处理：将液氮条件下磨碎的小麦叶片中加入萃取剂后混匀，所述萃取剂为丙酮：柠檬酸水溶液＝70:30(体积比)，所述柠檬酸水溶液的浓度为50mM；优选的：所述萃取剂与小麦叶片的比例为4:1，mL：g。

(2)加入混合内标混匀，所述混合内标包含DHJA、D₆-SA、D₆-ABA、D₂-GA₄、D₅-ZR、D₅-ZT>

(3)将步骤(2)中的混合物于避光条件下，低温条件下(优选的：4℃)摇床上摇匀；优选：摇床转速为200rpm，时间为3h。

(4)将步骤(3)处理后的混合物去除丙酮后，加入乙醚混匀，离心(优选：4000g离心10min，温度设置为4℃)取上清液；所述乙醚的加入量与小麦叶片的比例为：3:1，mL：g；优选的：重复该步骤2-5次。

(5)将步骤(4)得到的上清液去除色素(优选的：去除色素的方法为：将上清液中加入石墨化炭黑，混匀，离心即得)，挥发乙醚后加入甲醇溶解，过滤后用于JA、SA、ABA、ZR、ZT的测定；

(6)将步骤(4)得到的上清液进行固相萃取，挥发乙醚后加入甲醇溶解，过滤后用于GA₃、GA₄的测定。

所述步骤(5)、(6)的测定方法为LC-MS，色谱条件为：流动相A：0.1％乙腈、0.05％甲酸水溶液，流动相B：甲醇，所述质谱条件为：MS系统：ACQUITY XEVO TQ-S，电离模式：ZR、ZT为电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，JA、SA、ABA、GA₃、GA₄为电喷雾离子源负离子模式(ESI-)；源温度：150℃，脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：1000L/h，锥孔气流速：150L/h，碰撞气流速：0.15mL/min，毛细管电压：正离子为3.0KV，负离子为2.5KV；脱溶剂气温度：450℃；扫描模式：多反应监测MRM；雾化气：氮气。

优选的：所述步骤(6)中的固相萃取具体如下：活化：甲醇、2％氨水(体积分数)，体积比为1:1，上样，淋洗1：2％氨水(体积分数)，淋洗2：甲醇，洗脱：1％甲酸-甲醇(体积分数)。

优选的：所述固相萃取的固相萃取柱为：Waters Oasis MAX固相萃取小柱(3cc/60mg)。

本发明的目的之二是提供一种同时检测小麦幼穗或根部七种内源激素的方法，包括上述任一所述的方法，所述七种激素为：ZR、ZT、JA、SA、ABA、GA₃、GA₄。

本发明的目的之三是提供上述任一所述的方法在检测小麦幼穗或根部中七种内源激素的应用，所述七种激素为：ZR、ZT、JA、SA、ABA、GA₃、GA₄。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过对小麦样品前处理和超高效液相色谱串联质谱方法的优化，建立了一种同时检测小麦叶片等样品中多种含量极低、差异非常小、见光易分解的内源激素，特别是同时检测ZR、ZT、JA、SA、ABA、GA₃、GA₄七种激素，该方法既可以进行精确的定性又可以精准的定量，是一种简单、高通量、结果可靠的检测方法。

本发明所使用的小麦叶片的前期处理方法，可以有效的去除叶片中的色素、脂肪酸、酚类、糖苷等基质干扰物质，降低检测时样品基质成分和目标化合物在电喷雾离子源进行离子化时相互竞争等的基质效应，且操作简单快捷，可以灵敏的检测出多种激素的含量，尤其是结构相近的GA₃、GA₄，对光敏感的ABA，遇热不稳定的JA和SA，在衰老叶片中含量极低的ZR和ZT。

ZR、ZT、JA、SA、ABA、GA₃、GA₄是小麦叶片中重要的内源激素，任何一种激素的缺乏都会导致小麦产量以及品质，本发明的方法可以同时检测这七种内源激素，一是降低了成本，二是节省了时间，三是减少了所取样品的用量，避免影响小麦后期的光合作用，四是可以对七种外源激素的施用提供依据。

本发明的方法，特异性强，灵敏度高，通量高，结果客观易于分析，不仅可以对小麦生长发育中内源激素的失衡等进行确定，还可以为小麦外源激素的补充提供指导，减少盲目补充外源激素的现象的发生。

附图说明

图1为流动相A为0.1％乙腈和0.05％甲酸水时SA、D₆-SA、JA、DHJA、ABA、D₆-ABA色谱图；

图2为流动相A为0.1％甲酸水时SA、D₆-SA、JA、DHJA、ABA、D₆-ABA色谱图；

图3为流动相A为0.1％NH₃OH时SA、D₆-SA、JA、DHJA、ABA、D₆-ABA色谱图；

图4为流动相A为0.1％乙腈和0.05％甲酸水时GA₄、D₂-GA₄、GA₃的色谱图；

图5为流动相A为0.1％甲酸水时GA₄、D₂-GA₄、GA₃的色谱图；

图6为流动相为0.1％氨水时GA₄、D₂-GA₄、GA₃的色谱图；

图7花后25天小麦叶片SA、D₆-SA、JA、DHJA、ABA、D₆-ABA色谱图；

图8为花后25天小麦叶片ZR、ZT色谱图；

图9为花后25天小麦叶片GA₄、GA₃色谱图。

具体实施方式

为了更好的了解本发明的技术方案，下面结合说具体实施例对本发明作进一步说明。

试验仪器：

研钵；真空离心浓缩仪(Eppendolf)；1mL移液器(Eppendolf)；5mL移液器(Eppendolf)；控温摇床；10mL离心管；万分之一电子天平；多功能涡旋振荡混匀器；4℃冰箱；超声波清洗器；超纯水仪(Milli-Q A10)；0.22μm有机系滤膜(Millipore,Ireland,GNWP04700)；0.22μm水系滤膜(Millipore,Ireland,JCWP04700)；0.2μm有机系滤器(waters)；进样小瓶(Waters,12×32mm)；Waters Oasis MAX固相萃取小柱(3cc/60mg)；超高效液相-三重四级杆质谱联用仪(ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S,Waters)；C18色谱柱(ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm,2.1×100mm,Waters)。

试剂及标准品：

丙酮；柠檬酸(Sigma-Aldrich)；乙醚；甲醇(色谱级，CNW)；乙腈(色谱级，CNW)；石墨化炭黑(GCB,Waters,cat.no.186004835)；甲酸(色谱级,Fluka)

JA(Jasmonic acid,Sigma,cat.no.J2500)；

DHJA((±)-9,10-DIHYDROJASMONIC ACID,Olchemim,cat.no.0145321)；

SA(Salicylic acid,Sigma,cat.no.S5902)

D₆-SA(2-hydroxybenzoic>2H₆]；Sigma>

ABA(Abscisic acid,CAS.14375-45-2)；

D₆-ABA((±)-2-cis-4-trans-Abscisic>6,Olchemim,cat.no.ID1001)；

GA₃(Gibberellic>

GA₄(Gibberellin,Sigma,CAS.468-44-0)；

D₂-GA₄([²H₂]GIBBERELLIN>

ZR(Trans-zeatin-riboside,Sigma,CAS.6025-53-2)；

D₅-ZR([²H₅]trans-ZEATIN>

ZT(Trans-zeatin,Sigma,cat.no.Z0164)；

D₅-ZT([²H₅]trans-ZEATIN,Olchemim,CAS.72963-19-0)。

实施例1

1.激素受热不稳定，因此需要将研磨样品的研钵和称量样品的药匙放入液氮中预冷，萃取剂提前配好放在4℃冰箱中预冷，10mL离心管的试管架放在盛有碎冰中的保温泡沫盒中。

2.取放于-80℃冰箱中的小麦叶片或鲜叶片样品，将样品放置在装有液氮的保温桶里，用剪刀将叶片最上部和最下部的叶片剪掉，留叶片中部，将中部叶片剪碎，混匀。混匀的样品放在预冷的研钵中，加入液氮，磨碎样品成粉末，准确称取样品粉末1.0g，加入10mL离心管中，将离心管放在试管架上。

3.用移液枪准确加入4mL萃取剂(萃取剂为丙酮：柠檬酸水溶液＝70:30，体积比，柠檬酸水溶液的浓度为50mM)。

4.用多功能涡旋振荡混匀器将离心管中的萃取剂和样品振荡混匀2min。

5.加入20μL混合内标(内标包含DHJA、D₆-SA、D₆-ABA、D₂-GA₄、D₅-ZR、D₅-ZT>

6.再次向离心管中加入2mL萃取剂。

7.将放有10mL的离心管的离心管架放在超声波清洗器中，常温条件下超声15-20min。

8.将装有样品的离心管用不透光的锡箔纸进行遮光，然后放到控温摇床上摇3h(摇床设定温度为4℃，转速为200rpm，时间设定为3h)，为使样品充分摇匀，离心管架倾斜放置在摇床上，倾斜的角度为30-45°。

9.摇床摇3h后，将离心管取出开盖，放置在盛有碎冰的保温泡沫盒中，将保温泡沫盒放在通风橱中，过夜保存14h(这一步是将上清液中的丙酮相蒸发，剩余的柠檬酸相进行下步处理)。

10.经过第9步处理的样品中加入3mL Diethyl Ether(乙醚)，涡旋振荡混匀1min。

11.4000g离心10min，温度设置为4℃，用移液枪小心取上清，转移到新的10mL离心管中。

12.样品残渣中再次加入2mL乙醚，涡旋振荡混匀1min，离心(4000g，10min)，用移液枪小心取上清，转移到相应的新的10mL离心管中。

13.剩余样品残渣中加入1mL乙醚，涡旋振荡混匀1min，离心(4000g，10min)，用移液枪小心取上清，转移到相应的离心管中。

14.将上述三次上清液合并。

15.将步骤14的上清液平均分成两份，每份为3mL，一半用于JA、SA、ABA、ZR、ZT的测定，另一半需要经过Waters Oasis MAX固相萃取小柱萃取，用于GA₃、GA₄的测定。

16.JA、SA、ABA、ZR、ZT的测定：上清液中加入石墨化炭黑0.2mg(加入石墨化炭黑的量为色素含量的5％)，涡旋混匀，离心(12000rpm，离心20min)，取上清液，将上清液转移到新的10mL离心管中。(去除色素的优点：小麦生育后期叶片色素含量很高，最高浓度约为10mg/g，如果不除去部分叶绿素，最终提取液蒸发后再用500μL的甲醇定容后溶液很粘稠，会导致超高效液相-三重四级杆质谱联用仪流路堵塞、柱压过高，影响仪器正常工作，且色素含量过高会影响目标物的离子响应强度，使用石墨化炭黑既可以有效去除色素又不影响激素含量的测定，也不会带入其他的杂质)。

17.将步骤16所得的上清液放在真空离心浓缩仪中，待蒸干后加入500μL纯甲醇溶解。

18.样品过0.20μm的有机系滤器后，使用超高效液相-质谱方法用于JA、SA、ABA、ZR、ZT的测定，具体的参数如表1、2。

19.GA₃、GA₄的测定：将另一半提取液3mL通过Waters>

活化：2mL甲醇、2％氨水2mL

上样：3mL

淋洗1：2％氨水2mL

淋洗2：100％甲醇2mL

洗脱：4mL 1％甲酸-甲醇

20.洗脱得到的提取液放在真空离心浓缩仪中，待蒸干后加入500μL纯甲醇溶解。

样品过0.20μm的有机系滤器后，使用超高效液相-质谱方法用于GA₃、GA₄的测定，具体的参数如表1、2。

表1各激素及其内标的质谱参数表

*表示定量离子

表2液相方法表

流动相A:0.1％乙腈、0.05％甲酸水溶液，流动相B:纯甲醇，进样5μL，柱温设为40℃，样品温度设定为10℃，图1-图6为各激素标准品浓度为100ppb时色谱图，比较图1、图2与图3，图4、图5与图6，可以看出：流动相A为0.1％乙腈和0.05％甲酸水时，SA、D₆-SA、JA、DHJA、ABA、D₆-ABA、GA₄、D₂-GA₄、GA₃的响应强度最高，均高于流动相A为0.1％甲酸水和流动相A为0.1％NH₃OH。

图7-图9为实际样品的检测的色谱图，保留时间与标准品相比是相同的，且定量离子和定性离子的保留时间与标准品的保留时间也是相同的，可以确定样品中检测的激素分别为SA、JA、ABA、GA₄、GA₃、ZR、ZT。

表3花后25天小麦叶片中7种内源激素的含量

以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。