一种基因编辑系统及应用其对植物基因组进行编辑的方法

摘要

本发明公开了一种基因编辑系统及应用其对植物基因组进行编辑的方法。该基因编辑系统包括sgRNA转录单元，以及由顺次连接的来源于玉米的DMC1基因启动子和Cas9基因组成的DMC1p‑Cas9转录单元，其中，sgRNA识别的靶位点符合5’‑Nx‑NGG‑3’或者5’‑CCN‑Nx‑3’序列规则，N代表A、T、C和G中的任何一种，14≤X≤30，且X为整数，N

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种基因编辑系统及应用其对植物基因组进行编辑的方法。

背景技术

传统的育种技术主要依赖于自然界发生的遗传变异，通过杂交和回交等手段获得拥有优良性状的作物品种。但是自然的变异往往是随机的、有限的。最近几十年发展的转基因技术为作物育种提供了良好的机遇，基因工程育种也取得了巨大的成绩。转基因技术是通过将外源的目的DNA片段用人工的手段将其导入到植物的基因组从而获得某些优良性状如抗虫、抗除草剂等。转基因技术的特点使得获得的转基因植物含有外源的遗传物质，因此转基因食品的安全也为公众所担忧。近些年发展起来的基因组编辑(Genome editing)技术为作物功能基因组研究以及育种提供了新的机遇。

目前主要的基因组编辑技术包括三种，即：锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator like effectornuclease，TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9，CRISPR/Cas9)。这三种技术均能实现在基因组中的特异的靶位点产生DNA双链断裂(Doublestrand break，DSB)，借助细胞内源的DSB修复机制，获得基因组特异位点的插入或缺失等变异，实现基因组的编辑。由于CRISPR/Cas9系统的利用相对简单和高效，目前已经被广泛用于植物的基础以及应用研究。CRISPR/Cas9系统在主要的农作物如水稻、小麦、玉米、大豆等均已经获得了成功的应用，展现出了强大的育种应用潜力。

CRISPR/Cas9系统的编辑效率对其在作物基础研究以及应用研究中是必须考虑的一个因素。高的编辑效率不但可以节省人力和资源成本，也使得全基因组的大规模基因编辑容易实现，因而促进新的基因或遗传位点的发掘。而CRISPR/Cas9系统的编辑效率主要受到以下一些因素的影响：如用于驱动Cas9表达的启动子，用于驱动sgRNA表达的启动子，编辑的靶位点等等。对这些因素进行有针对性的优化(如寻找在愈伤组织中更高效表达的启动子)将有提高基因编辑效率的潜力。目前CRISPR/Cas9系统对作物的实践研究中用于驱动Cas9基因表达的主要用到两种组成型表达的启动子：烟草花叶病毒的35S启动子和玉米的ubiquitin基因启动子。在玉米中，基于农杆菌的转化体系，已有的报道中产生纯合或双等位突变体植株的平均频率分别为<1％(35S)、13％(Ubi)和30％(Ubi)。小麦中已报道的编辑效率在10％左右，且基于基因枪转化体系。基于农杆菌转化体系的在小麦中目前还未见有报道。因此，有必要在农作物中发掘和探索新的启动子用于驱动Cas9基因的表达实现更高效的基因组编辑，从而节约时间和人力成本，也使得作物全基因组的大规模编辑更容易实现，促进CRISPR/Cas9系统在作物的基础和应用研究中发挥更强大的作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种新的基因编辑系统及应用其对植物基因组进行编辑的方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。

为实现上述目的，本发明提供一种新的基因编辑系统，其包括sgRNA(SingleGuide RNA)转录单元，以及由顺次连接的来源于玉米的DMC1基因启动子和Cas9基因组成的DMC1p-Cas9转录单元，其中，sgRNA识别的靶位点符合5’-Nx-NGG-3’或者5’-CCN-Nx-3’序列规则，N代表A、T、C和G中的任何一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。

其中，所述DMC1基因启动子表示为DMC1p，其序列优选如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种包括前述基因编辑系统的重组载体。

本发明还提供前述重组载体的构建方法，其包括如下步骤：

(1)克隆获得DMC1基因启动子并将其与Cas9基因顺次连接，组成DMC1p-Cas9转录单元；

(2)构建识别靶位点的sgRNA转录单元，并将DMC1p-Cas9转录单元和sgRNA转录单元同时导入双元载体，得到重组载体，其中，sgRNA识别的靶位点符合5’-Nx-NGG-3’或者5’-CCN-Nx-3’序列规则，N代表A、T、C和G中的任何一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。

步骤(1)中，所述DMC1基因启动子的序列优选如SEQ ID NO.1所示。

步骤(1)中，克隆获得DMC1基因启动子优选采用如下方法：以玉米B73的基因组DNA为模板，以序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物为扩增引物对进行PCR反应，扩增得到序列如SEQ ID NO.1所示的片段，即为DMC1基因启动子。

步骤(1)中，在克隆获得DMC1基因启动子之后，所述将其与Cas9基因顺次连接优选采用如下方法：将得到的DMC1基因启动子替换35S-Cas9-SK载体中的35S启动子，得到pDMC1-Cas9-SK重组载体，再利用Xma I和EcoR I两个酶切位点将DMC1p-Cas9转录单元转移到双元载体pTF101.1，得到重组载体pDMC1-Cas9。

步骤(2)优选采用如下操作：将符合5’-Nx-NGG-3’或者5’-CCN-Nx-3’序列规则的靶位点的DNA序列通过引物退火连入pU3-sgRNA载体中，然后通过Hind III酶切位点将sgRNA的转录单元亚克隆到重组载体pDMC1-Cas9中，得到包括sgRNA转录单元，以及由顺次连接的来源于玉米的DMC1基因启动子和Cas9基因组成的DMC1p-Cas9转录单元的重组载体。

本发明还提供一种对前述重组载体的编辑活性进行鉴定的方法，其包括：将所述重组载体转化植株原生质体，通过鉴定在原生质中发生基因组编辑的效率从而确定所述重组载体的编辑活性。

本发明还提供一种包括前述重组载体的基因工程菌。

本发明还提供一种应用前述基因编辑系统对植物基因组进行编辑的方法，其包括：将前述基因工程菌转化受体植物组织，获得被编辑的转基因植物材料。

其中，所述植物优选单子叶植物，更优选玉米或小麦。

其中，所述受体植物组织优选未成熟的幼胚。

与现有技术相比，本发明取得了以下积极进步效果：

应用本发明的基因编辑系统对植物基因组进行编辑，在玉米中实现了在T0代获得高比例的纯合或双等位突变体的植株；对于T0代获得的含突变比例低的植株，自交的后代T1代也能产生新的突变植株；对于小麦基于农杆菌的转化体系可以获得含有一定比例突变的嵌合体植株，预期在T1代可以获得纯合或双等位突变体的植株。对该启动子应用于植物基因组编辑系统，在本发明之前未有报道，本发明属于首创。本发明的改良后CRISPR/Cas9系统将有望提高单子叶植物中的基因组编辑效率，促进作物遗传改良以及基础研究。

附图说明

图1显示实施例4中以玉米基因1(国际通用编号为GRMZM2G027059)为靶基因获得的4个转基因事件的抗性愈伤组织(各取3份样品)利用PCR(Polymerase Chain Reaction)-酶切的方法进行突变鉴定的结果。

图2显示实施例4中获得的纯合或双等位基因的突变体的表型结果。

图3显示实施例4中T1代植株突变鉴定的PCR-酶切后电泳结果。

图4显示实施例4中T0代转基因小麦植株中缺失突变的结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明的发明人在研究的过程中，通过大量的筛选实验和反复的实践验证，在玉米中发掘了一个新的启动子用于驱动Cas9基因的表达，同时构建了方便其应用的重组载体和基因工程菌株。农杆菌的转化实验表明，和现有技术中已报道的其他启动子相比，本发明能够显著提高在植物特别是单子叶植物玉米中利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的效率，在转基因T0代100％的抗性愈伤能再生获得纯合或双等位突变体植株，纯合或双等位突变体植株在所有再生获得的植株中的比例在65％以上。本发明同时有望在小麦T1代获得多基因位点的纯合或双等位突变体植株。

下述各实施例中，所使用的实验材料的来源如下：

质粒35S-Cas9-SK在文献“Feng Z.Y.et al.,Efficient genome editing inplants using a CRISPR/Cas system.Cell Res 2013”中公开过；

质粒pU3-sgRNA在文献“Feng C.et al.,Efficient Targeted GenomeModification in Maize Using CRISPR/Cas9 System.J Genet.Genomics 2016”中公开过；

质粒pTF101.1在文献“Paz M.M.et al.,Assessment of conditions affectingAgrobacterium mediated soybean transformation using the cotyledonary nodeexplant.Euphytica 2004”中公开过；

农杆菌菌株EHA105可以从商业公司购买，如优宝生物公司，产品编号：ST1140；

玉米品种HiII在文献“Armstrong C.L.，Green C.E.&Phillips R.L.Developmentand availability of germplasm with high type II culture formationresponse.Maize Genet.Coop.News Lett.65，92-93(1991)”中公开过；公众可从玉米遗传学和基因组学数据库(MaizeGDB)网站获取；

玉米品种B73在文献“Russell W.A.Registration of B70 and B73 parentallines of maize.Crop Sci.12，721(1972)”中公开过；公众可从玉米遗传学和基因组学数据库(MaizeGDB)网站获取；

小麦品种苏麦3号记载于“江苏太湖地区农科所等.小麦赤霉病最优抗源-苏麦3号.江苏农业科学,1988”一文，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；

DNA提取试剂盒(货号：DP305-03)、质粒提取试剂盒(DP103-03)、EsayGeno快速重组克隆试剂盒(货号：VI201-02)等购自天根生化科技(北京)有限公司；

PCR产物克隆用的T载体(货号：CT111-01)购自北京全式金生物技术有限公司；

限制性内切酶购自纽英伦生物技术(北京)有限公司；

引物序列由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成；

测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成；

实验中用到的其他材料试剂或仪器设备若未作特殊说明，均表示为本领域常规市售可得。

实施例1 玉米中DMC1基因启动子的克隆以及pDMC1-Cas9重组载体的构建

从玉米遗传学和基因组学数据库(MaizeGDB)网站获取玉米DMC1基因的序列全长(基因ID为GRMZM2G109618)。根据全长的序列在该基因的5’端非编码区设计引物dmc-F(序列如SEQ ID NO.2所示)和dmc-R(序列如SEQ ID NO.3所示)作为扩增引物对，以玉米B73(Zea mays L.)基因组DNA为模板，PCR扩增获得一个3614bp长的片段(序列如SEQ ID NO.1所示)，该片段紧邻起始密码子。利用引物dmc-F2(序列如SEQ ID NO.4所示)和dmc-R2(序列如SEQ ID NO.5所示)作为扩增引物对，上述3614bp长的片段DNA为模板进行PCR扩增，然后利用EsayGeno快速重组克隆试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)将扩增的片段整合到35S-Cas9-SK(XhoⅠ酶切)载体中替换35S启动子，得到重组的pDMC1-Cas9-SK载体。然后利用XmaⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点将DMC1p-Cas9转录单元亚克隆到双元载体pTF101.1上，得到重组载体pDMC1-Cas9。

玉米基因组中符合5’-Nx-NGG-3’或者5’-CCN-Nx-3’(N代表A、T、C和G中的任何一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸)序列规则的位点被选择为CRISPR/Cas9系统编辑的靶位点。靶位点的DNA序列可以通过引物退火连入pU3-sgRNA载体(BbsⅠ酶切)。然后通过HindⅢ酶切位点将sgRNA的转录单元亚克隆到前述的pDMC1-Cas9载体。然后将pDMC1-Cas9载体转入农杆菌菌株EHA105，得到的重组基因工程菌株用于玉米的转化。

实施例2 玉米原生质体转化

玉米原生质体转化的方法参见已有的报道(Feng C.et al.,Efficient TargetedGenome Modification in Maize Using CRISPR/Cas9 System.J Genet.Genomics 2016)。本实施例中所用玉米材料为B73。试剂配制及主要的步骤如下：

主要溶液配方如下：

(1)酶解液：1.5％纤维素酶，0.4％离析酶R10，0.4M甘露醇，20mM氯化钾，20mM脂肪酸甲酯磺酸盐，pH5.7。55℃水浴10min后加入10mM的氯化钙，0.1％的牛血清蛋白以及5mM的β巯基乙醇；

(2)W5溶液：154mM氯化钠，5mM氯化钾，125mM氯化钙，2mM脂肪酸甲酯磺酸盐，pH5.7；

(3)MMg溶液：4mM脂肪酸甲酯磺酸盐，0.4M甘露醇，15mM氯化镁，pH5.7；

(4)40％PEG溶液：40％PEG4000，100mM氯化钙，0.6M甘露醇。

实验步骤如下：

(1)25℃黑暗条件下萌发幼苗，待幼苗长至10cm左右选取最幼嫩的叶片切成0.5mm宽的碎片；

(2)切好的叶片放入新配制的酶解液中真空抽气0.5h，然后在摇床上40rpm酶解4h，最后在80rpm条件下处理5分钟；

(3)用41μm的尼龙网滤膜过滤酶解后的原生质体到圆底离心管中，100g离心3min，吸取上清，用W5溶液洗涤2次；

(4)洗涤后的原生质体在冰上放置30min，然后离心，吸去上清，加入适量的MMg溶液重悬至细胞数为5×10⁵g/ml；

(5)将实施例1获得的重组载体pDMC1-Cas9转入大肠杆菌菌株DH5α，以备抽提质粒。用天根生化科技(北京)有限公司生产的质粒提取试剂盒抽提质粒。取190μl原生质体溶液，加入10μl质粒(大于5μg)，再加入200μl 40％PEG溶液，用枪头轻轻混匀，25℃放置18min；

(6)加入1.4ml W5溶液，颠倒混匀，100g离心3min，弃掉上清，加入1.5ml W5溶液重悬，然后将原生质体悬液转移到6孔板中，28℃黑暗下培养1.5d。

实施例3 农杆菌介导的玉米遗传转化

玉米遗传转化的方法主要参考已有的报道(Frame B.R.et al.,Agrobacterium-mediated transformation of maize embryos using a standard binary vectorsystem.Plant Physiol.2002)。转化的受体材料为HiII。试剂配制及主要的步骤如下：

主要溶液及培养基配方如下：

(1)N6维生素贮存液(1000×)：2.0g/L甘氨酸，1.0g/L维生素B1，0.5g/L维生素B6，0.5g/L烟酸，过滤除菌；

(2)MS维生素贮存液(1000×)：2.0g/L甘氨酸，0.5g/L维生素B1，0.5g/L维生素B6，0.05g/L烟酸，过滤除菌；

(3)侵染培养基：4.0g/L N6盐，1ml/L N6维生素贮存液，1.5mg/L 2,4-D，0.7g/LL-脯氨酸，68.4g/L蔗糖，36.0g/L葡萄糖，pH5.2，过滤除菌，临用添加100.0μM的乙酰丁香酮；

(4)共培养培养基：4.0g/L N6盐，1.5mg/L 2,4-D，0.7g/L L-脯氨酸，30.0g/L蔗糖，3.0g/L植物凝胶，pH5.8；高温高压灭菌后添加1ml/L N6维生素贮存液，100.0μM乙酰丁香酮，300.0mg/L L-半胱氨酸，5.0μM硝酸银；

(5)静息培养基：4.0g/L N6盐，1.5mg/L 2,4-D，0.7g/L L-脯氨酸，30.0g/L蔗糖，0.5g/L脂肪酸甲酯磺酸盐，8.0g/L琼脂，pH5.8；高温高压灭菌后添加1ml/L N6维生素贮存液，100.0mg/L头孢噻肟，100.0mg/L万古霉素，5.0μM硝酸银；

(6)选择培养基I：4.0g/L N6盐，1.5mg/L 2,4-D，0.7g/L L-脯氨酸，30.0g/L蔗糖，0.5g/L脂肪酸甲酯磺酸盐，8.0g/L琼脂，pH5.8；高温高压灭菌后添加1ml/L N6维生素贮存液，100.0mg/L头孢噻肟，100.0mg/L万古霉素，5.0μM硝酸银，1.5mg/L除草剂；

(7)选择培养基II：4.0g/L N6盐，1.5mg/L 2,4-D，0.7g/L L-脯氨酸，30.0g/L蔗糖，0.5g/L脂肪酸甲酯磺酸盐，8.0g/L琼脂，pH5.8；高温高压灭菌后添加1ml/L N6维生素贮存液，100.0mg/L头孢噻肟，100.0mg/L万古霉素，5.0μM硝酸银，3.0mg/L除草剂；

(8)再生培养基I：4.3g/L MS盐，1.0ml/L MS维生素贮存液，100.0mg/L肌醇，60.0g/L蔗糖，3.0g/L植物凝胶，pH5.8；高温高压灭菌后添加100.0mg/L头孢噻肟，3.0mg/L除草剂；

(9)再生培养基II：4.3g/L MS盐，1.0ml/L MS维生素贮存液，100.0mg/L肌醇，30.0g/L蔗糖，3.0g/L植物凝胶，pH5.8；高温高压灭菌。

主要实验步骤如下：

(1)农杆菌侵染

在侵染实验的前一天接种实施例1得到的重组EHA105基因工程菌株到10ml的YEP培养基中，在摇床中28℃，200rpm振荡培养16-20h。离心收集农杆菌，重悬到侵染培养基中(OD₅₅₀值为0.3-0.4)。从玉米幼穗中剥出未成熟的幼胚(1.5-2.0mm)，幼胚随后置于含有农杆菌的侵染培养基的2ml>

(2)共培养

侵染后的幼胚随后置于无菌的滤纸上并紧接着转移到共培养的培养基中，幼胚的盾片朝上。然后放到培养箱中20℃黑暗下培养3天。

(3)静息培养

经过3天的共培养后，转移所有的幼胚到静息培养基，置于培养箱中，28℃黑暗下培养7天。

(4)抗性愈伤的选择培养

经过7天的静息培养，转移所有的幼胚到选择培养基I，置于培养箱中，28℃黑暗下培养14天。然后转移所有的愈伤组织到选择培养基II，置于培养箱中28℃黑暗下培养14天。愈伤组织在选择培养基II中重复继代3-5次，直至陆续选出所有的抗性愈伤组织。

(5)抗性愈伤组织的再生

经过选择培养，筛选到的抗性愈伤组织培养到足够大后转移到再生培养基I，置于培养箱中25℃黑暗下培养14天。然后选取含有体细胞胚的愈伤组织转移到再生培养基II，置于培养箱中25℃光照下培养，直到再生出所有的幼苗。

实施例4 基因编辑效率检测

(1)收集实施例2中的已转化原生质体或实施例3中的转基因玉米愈伤、植株叶片的样品以及转基因小麦样品。用DNA抽提试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA；

(2)用相应靶位点的引物进行PCR扩增，获得的PCR产物取其中一部分用相应靶位点的限制性内切酶(购自NEB公司)做酶切实验，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳(图1)；图1显示以玉米基因1(国际通用编号为GRMZM2G027059)为靶基因获得的4个转基因事件的抗性愈伤组织(各取3份样品)突变鉴定结果；通过PCR扩增得到含靶位点的651bp的DNA片段，如果序列没有突变则可以被酶切成501bp和150bp的两个片段，反之则不能被切开。图1中各泳道对应的样品从左到右为：4个转基因事件#1、#3、#4、#6(各3份样品)，对照和Marker，从图1中可以看出4个愈伤样品中其中3个都含有纯合或双等位突变。

(3)对于含有纯合或双等位基因的突变的样品，PCR产物可以直接送到测序公司进行测序；对于其他类型的含有突变的样品，回收酶切未切开的突变序列条带，克隆到商业化的T载体，然后挑取单克隆送公司测序；

(4)分析酶切和测序的结果，统计突变类型和比例。

对于玉米基因1(国际通用编号为GRMZM2G027059)作为一个标记基因，该基因突变理论上植株会出现白化的表型。两批次的转化实验共获得10个转基因事件，其中的9个事件中均获得了白化表型的植株，并且经鉴定为纯合或双等位基因突变体(图2)；此外一个事件中获得了叶片黄化的植株，经鉴定也是双等位基因突变体。因此，再生获得含有纯合或双等位基因突变植株的转基因事件为100％；所有的再生植株中纯合或双等位基因突变植株比例大于65％。将T0代中突变比例较低的植株自交或杂交获得T1代，鉴定结果表明在T1代部分植株中突变比例较T0代明显提高(图3)，图3显示的为一棵T0代植株和野生型杂交的后代中靶基因突变的鉴定结果；左侧为T0代植株鉴定的结果，泳道对应样品依次为转基因T0植株、对照和Marker；右侧为T1代植株鉴定的结果，泳道对应样品依次为T1代的8棵转基因植株、对照和Marker。

其中，T0代中突变体基因型统计见表1：

表1 实施例4中的突变体基因型统计

对于玉米基因2(国际通用编号为GRMZM2G456570)，已知该基因突变理论上会产生致死的表型，在其它物种中已证实这种致死的表型，转化了大量的幼胚但是只获得两个抗性事件的愈伤组织，转化效率显著降低。这从一定程度地表明大部分的阳性转基因事件中产生了纯合或双等位基因的突变。另外，对两个阳性事件的愈伤组织进行突变鉴定发现在这两个样品为嵌合突变体，突变比例分别也在50％以上。

对于小麦，我们选择了苏麦3号材料中的fhb1基因等作为靶基因，到目前已经鉴定的T0代6棵转基因植株中其中4棵可以检测到缺失突变(图4)。

综上所述，本发明提供了一种新的用于植株基因编辑的重组载体。通过在单子叶植物特别是玉米中的实验表明：利用该重组载体基于农杆菌的遗传转化体系，玉米中在T0代可以获得高比例的纯合或双等位突变体植株材料。并且对于T0代含低突变比例的植株，自交或杂交得到的T1代中部分植株中突变比例会显著提高。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 一种基因编辑系统及应用其对植物基因组进行编辑的方法

<130> IB177450

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3614

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 1

ttttcaaagc gcatcctctc gcaaaggagc aggaagtttt tcagtataga acaaaatccc 60

ctggactaaa ccatccaggt atctcagcag ttttccactg gttttcattt tcaaaaacag 120

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<213> 人工序列

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<400> 5

tcgtggtcct tatagtccat gtgcctgcac tagtagcccg atc 43