一种利福平胶囊中利福平及其杂质的含量测定方法

摘要

本发明涉及一种利福平胶囊中利福平及其杂质的含量测定方法，所述方法包括以下步骤：步骤1，对照品溶液的配制：精密称取利福平对照品适量，精密称取醌式利福平对照品与N‑氧化利福平对照品各适量，加乙腈(各约10mg加1ml乙腈)使溶解；步骤2，供试品溶液的配制：取利福平胶囊内容物适量，精密称定，加少量乙腈(约利福平10mg加1ml乙腈)溶解；步骤3，测定法：精密量取利福平对照品溶液与供试品溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，根据色谱图，采用峰面积法计算利福平胶囊内容物中利福平以及醌式利福平，N‑氧化利福平的含量。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种药物制剂的中有效成分的含量及杂质的含量测定方法，特别涉及一种抗结核药物利福平胶囊中利福平及其杂质的含量测定方法。

背景技术：

利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，通用名：利福平，英文名：RIFAMPICINTABLETS。抗结核病药，对多种病原微生物均有抗菌活性。利福平口服吸收良好，服药后1.5～4小时血药浓度达峰值。本品与其他抗结核药联合用于各种结核病的初治与复治，包括结核性脑膜炎的治疗。

现有技术报道了多种应用高效液相色谱法测定利福平胶囊中利福平含量的方法，如以下方法：采用LichrospherRP-8柱，0.075mol/L的KH2PO4：乙腈：甲醇＝1：1：1为流动相，254nm检测，

其测定方法为：取利福平胶囊20粒,将内容物研细混匀,精确称取适量(约相当于利福平30mg)，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液，精确量取滤液5ml置50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，取10ul注入液相色谱仪测定。

另现有技术报道了以下方法

色谱条件为：辛基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按利福平峰计算应不低于1500。2.1流动相：甲醇：乙腈：0.075mol/L磷酸二氢钾溶液：1.0mol/L枸橼酸溶液＝30：30：36：4，检测波长：254nm，柱温：室温

对照品溶液的制备：精密称取利福平对照品适量，用乙腈溶解并定量稀释成每1mL中约含0.08mg的溶液，即为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取供试品，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于利福平80mg)，用乙腈溶解并定量稀释成每1mL中约含0.8mg的溶液，用0.45μm滤膜滤过，精密量取续滤液适量，用乙腈定量稀释成每1mL中约含0.08mg的溶液，即为供试品溶液。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10mL，注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器于波长254nm处测定利福平(C43H58N4O12)的峰面积，计算出其含量。

另现有技术报道了以下方法

高效液相色谱法测定利福平胶囊的含量

溶液制备:对照品溶液制备:精密称取干燥至恒重的利福平和卡马西平对照品适量,分别置100mL量瓶中,用甲醇溶解，得到含有利福平和卡马西平浓度分别为0.25g/L和0.15g/L的对照品溶液。

供试品溶液制备:取利福平胶囊20粒,倾出内容物,混合均匀。精密称取适量(约相当于利福平80mg),置100mL量瓶中,加液5mL置100mL量瓶中,用流动相稀释至刻度，摇匀，

色谱条件:色谱柱:SphorisorbC18柱(5m,4mm 150mm)；流动相:甲醇:0.02mol/L磷酸二氢钾(75:25)；280nm处检，

测定法：取不同批号的利福平胶囊进行测量,计算标示量。

现有技术的缺点在于，灵敏度精确度不高，稳定性差。

发明内容：

本发明经过筛选得到一种新的利福平胶囊中利福平及其杂质的含量测定方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1，对照品溶液的配制：精密称取利福平对照品适量，加少量乙腈(约10mg加1ml乙腈)溶解；精密称取醌式利福平对照品与N-氧化利福平对照品各适量，加乙腈(各约10mg加1ml乙腈)使溶解；

步骤2，供试品溶液的配制：取利福平胶囊内容物适量，精密称定，加少量乙腈(约利福平10mg加1ml乙腈)溶解；

步骤3，测定法：精密量取利福平对照品溶液与供试品溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，根据色谱图，采用峰面积法计算利福平胶囊内容物中利福平以及醌式利福平，N-氧化利福平的含量；

其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下：以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表洗脱；检测波长为254nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃

优选的，本发明的方法，步骤如下：

步骤1，对照品溶液的配制：称取醌式利福平对照品与N-氧化利福平对照品各适量，加乙腈(各约10mg加1ml乙腈)使溶解，用乙腈-水(1∶1)定量稀释制成每1ml中约含醌式利福平约40μg、N-氧化利福平约40μg的混合溶液；

步骤2，利福平对照品溶液的配制：精密称取利福平对照品适量，加少量乙腈(约10mg加1ml乙腈)溶解后，用乙腈-水(1∶1)定量稀释制成每1ml中约含10μg的溶液，作为利福平对照品溶液；

步骤3，供试品溶液的配制：临用新制。取本品内容物适量，精密称定，加少量乙腈(约利福平10mg加1ml乙腈)溶解后，用乙腈-水(1∶1)定量稀释制成每1ml中约含利福平1mg的溶液，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

步骤4，测定法：精密量取利福平对照品溶液与供试品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算利福平含量；

其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下：以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表洗脱；检测波长为254nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃，

本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

(1)采用中国药典2015年版的方法：以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Symmetry C8，4.6×150mm，3.5μm)，以甲醇-乙腈-0.075mol/L磷酸二氢钾溶液-1.0mol/L枸橼酸溶液(30∶30∶36∶4)为流动相。进行利福平杂质分离情况测试，结果见图1。结果显示：杂质混合溶液中醌式利福平和杂质A无法达到基线分离。

(2)采用USP40的方法：以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Symmetry C8，4.6×150mm，3.5μm)，以水-乙腈-pH3.1磷酸二氢钾溶液-1.0mol/L枸橼酸溶液-5.0mol/L高氯酸钠溶液(51∶35∶10∶2∶2)为流动相，进行利福平杂质分离情况测试，结果见图2。结果显示：N-氧化利福平和3-甲酰利福霉素SV不能充分分离。

(3)方法优化1：

以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Symmetry C8，4.6×150mm，3.5μm)；以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；检测波长为254nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。洗脱程序如下：

采用上述测定方法对利福平进行杂质分离情况测试，结果见图3。结果显示：醌式利福平和杂质A基线分离，运行时间较长，需进一步优化。

(4)方法优化2：

以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Symmetry C8，4.6×150mm，3.5μm)；以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；检测波长为254nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。洗脱程序如下：

采用上述测定方法对利福平进行杂质分离情况测试，结果见图4。结果显示：醌式利福平和杂质A基线分离，运行时间适中，但存在RRT＝0.61和0.64的两个大于0.6％的杂质无法完全分离，且现行原料药供应商提供的原料药会持续存在这两个杂质，故色谱条件仍需进一步优化。

(5)方法优化3：

以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent Zorbax Eclipse XDB C8,4.6*250mm,5μm)；以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；检测波长为254nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。洗脱程序如下：

采用上述测定方法对利福平进行杂质分离情况测试，结果见图5。结果显示：RRT＝0.61和0.64的两个大于0.6％的杂质分离度分别为24和14分离良好，其余杂质也分离良好，但是主峰前面有未知杂质为分离，进一步优化。

(6)方法优化4：以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent Eclipse Plus C8，4.6×250mm，5μm或性能相近)；以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；检测波长为254nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。洗脱程序如下：

采用上述测定方法对利福平进行杂质分离情况测试，结果见图6。结果显示：此条件下，利福平中已知杂质和未知杂质分离情况良好，该方法满足含有利福平、含有利福平的药物组合物中利福平含量测定。

附图说明

图1中国药典2015版利福平胶囊条件下杂质分离情况

图2 USP40版利福平胶囊条件下杂质分离情况

图3方法优化1色谱图

图4方法优化2色谱图

图5方法优化3色谱图

图6方法优化后利福平杂质分离情况

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

步骤1，对照品溶液的配制：称取醌式利福平对照品与N-氧化利福平对照品各适量，加乙腈(各约10mg加1ml乙腈)使溶解，用乙腈-水(1∶1)定量稀释制成每1ml中约含醌式利福平约40μg、N-氧化利福平约40μg的混合溶液；

步骤2，利福平对照品溶液的配制：精密称取利福平对照品适量，加少量乙腈(约10mg加1ml乙腈)溶解后，用乙腈-水(1∶1)定量稀释制成每1ml中约含10μg的溶液，作为利福平对照品溶液；

步骤3，供试品溶液的配制：临用新制。取本品内容物适量，精密称定，加少量乙腈(约利福平10mg加1ml乙腈)溶解后，用乙腈-水(1∶1)定量稀释制成每1ml中约含利福平1mg的溶液，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

步骤4，测定法：精密量取利福平对照品溶液与供试品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算利福平含量；

其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下：以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表洗脱；检测波长为254nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃，

4、适用范围：利福平、含有利福平的药物组合物。