一种可同时检测氯化汞和溴化汞的方法

摘要

一种可同时检测氯化汞和溴化汞的方法，该方法包括如下步骤：（1）检测条件；（2）样品处理；（3）氯化汞和溴化汞储备液的配制：(4)图谱分析：（5）含量计算。本方法通过气相色谱‑质谱联用法，能够有针对性的检测出生物样品中的氯化汞和溴化汞，而不是仅仅检测生物样品中总汞的含量，提高了检测的灵敏度，同时大大简化了检测步骤，节省了时间和成本。

说明书

技术领域

本发明属于生物材料检测领域，具体涉及一种可同时检测氯化汞和溴化汞的方法。

背景技术

卤族高汞化合物包括氯化汞和溴化汞，均为无机剧毒物，其化学结构和理化性质均有相似之处。其中，氯化汞，俗称升汞，是分析化学的重要试剂，同时可用于木材和解剖标本的保存、皮革鞣制和钢铁镂蚀等，在工业生产领域有广泛的应用。溴化汞，也是药物分析试验中常用的化学试剂。氯化汞和溴化汞均属于无机剧毒物品范畴，可通过呼吸道、消化道或皮肤吸收。实际生产中常有因防护措施不到位而引起的中毒案例报道。职业中毒主要是经呼吸道吸入金属汞蒸气或汞化合物气溶胶所致。

常规测定氯化汞的方法多为原子荧光光谱法和冷原子吸收光谱法测定生物样品中总汞的含量，需要经过高压消解或微波消解步骤，通常需要3-4小时，耗时过长且程序繁琐，不适用于临床急救检验。

发明人在研究中发现，可通过气相色谱-质谱联用法检测生物检材中的氯化汞（《气相色谱-质谱联用法检测生物检材中的氯化汞》，中国卫生检验杂志，2016，Vo.l26,No.17）,但是该方法具有很大的局限性：1、只对样品中的氯化汞进行检测，不能对溴化汞同时进行检测；2、定量限较高，最低定量限为5μg/g，灵敏度有待进一步提高；3、氯化汞和溴化汞的分离度未达到要求，二者不能实现分离，因而不能分别检测；4、不适用检测血浆样品中的氯化汞和溴化汞。

因此，研制开发一种可同时检测氯化汞和溴化汞的方法一直是亟待解决的新课题。

发明内容

本发明提供一种同时检测生物材料中氯化汞和溴化汞的方法，通过气相色谱-质谱联用法，能够有针对性的检测出生物样品中的氯化汞和溴化汞，而不是仅仅检测生物样品中总汞的含量，提高了检测的灵敏度，同时大大简化了检测步骤，节省了时间和成本。

本发明的目的是这样实现的：一种可同时检测氯化汞和溴化汞的方法，其特征在于。

该方法包括如下步骤。

（1）检测条件。

气质联用仪：采用7890B-5977A气质联用仪。

色谱柱：HP-5ms毛细管柱，规格：30 m×0.25 mm，0.25 μm。

电子离子轰击源(EI源，70 eV)，全离子扫描，扫描质量范围为40 amu～600 amu。

载气为高纯氦气(99.9%)，流速1.0 ml/min。

升温程序: 初始柱温为60 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升温至180℃,保持8 min，再以30 ℃/min升温至260 ℃, 进样口温度为265 ℃，离子源温度为230 ℃。

（2）样品处理。

取生物材料0.5 g，加入skf-525a内标物500 ng，加入0.01mol/L盐酸溶液1 ml，用2 ml乙酸乙酯涡旋混合提取，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，常温下氮气吹干，用20μl乙酸乙酯复溶，取1 μl进样分析。

（3）氯化汞和溴化汞储备液的配制。

氯化汞标准储备液（1.0 mg/ml）：精密称取0.135 4 g经干燥的氯化汞，用重铬酸钾的硝酸溶液（0.5 g/L）溶解，并转移至100 ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀，于4 ℃冰箱保存备用。

溴化汞标准储备液（50.0 mg/ml）：取溴化汞2.5g，加乙醇50ml，微热使溶解，即得。本液应置玻璃塞瓶内，在暗处保存。

(4) 图谱分析。

氯化汞和溴化汞的保留时间均在8 min左右，氯化汞谱图中m/z 272为分子离子峰，m/z 237为失去一个氯离子的碎片离子峰，m/z 202为失去两个氯离子的碎片离子峰。

溴化汞谱图中m/z 360为分子离子峰，m/z 281为失去一个溴离子的碎片离子峰，m/z 202为失去两个溴离子的碎片离子峰，m/z 79为单一溴离子的碎片离子峰。

（5）含量计算。

向生物材料中添加氯化汞和溴化汞储备液，制成标准工作曲线，以氯化汞和溴化汞的峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，以氯化汞和溴化汞的浓度为横坐标，分别计算回归方程；计算含量时，将待测样品中氯化汞或溴化汞的峰面积代入回归方程即得到待测样品含量。

该检测方法所使用的生物材料为尿液、胃内容物或血浆样品。

该方法的最低检出限以S/N=3进行计算，对于氯化汞的最低检出限为0.2 μg/g，该方法对于溴化汞的最低检出限为0.5 μg/g。

与现有技术相比，具有如下有益效果。

1、常规测定生物检材中汞的方法多为原子荧光光谱法和冷原子吸收光谱法，仅仅检测生物样品中总汞的含量，不能够有针对性的检测出生物样品中的氯化汞和溴化汞。本专利不仅简化了检测步骤，提高了检测的灵敏度。可同时检测氯化汞和溴化汞，并进行定量分析。

2、本发明采用液液萃取方法，通过筛选不同的提取溶剂，调节不同的pH值，以及调整不同的离子浓度。使定量限降低，灵敏度提高，最低检出限以S/N=3进行计算，对于氯化汞的最低检出限为0.2 μg/g，该方法对于溴化汞的最低检出限为0.5 μg/g。

3、本发明调整了气相色谱的程序升温模式，使目标物质的峰形更加尖锐，提高了氯化汞和溴化汞的分离度，能够实现分别检测。

4、可检测的生物材料包括尿液、胃内容物或血浆样品。

附图说明

图1为不同pH值对氯化汞和溴化汞提取回收率的影响图。

图2为不同升温程序对对氯化汞和溴化汞分离效果的影响图，A：使用本发明的升温程序，B：使用对比文献的升温程序。

图3为实施例二氯化汞、溴化汞和内标的选择离子监测色谱图。

图4为实施例二氯化汞和溴化汞的质谱图，A：氯化汞质谱图；B：溴化汞质谱图。

具体实施方式

实施例一。

1、不同提取溶剂的筛选。

为了提高氯化汞和溴化汞的提取回收率，本发明考察了不同极性的提取溶剂对氯化汞和溴化汞提取回收率的影响。

实验过程如下：分别取三份空白尿液各0.5 g，加入等量的氯化汞和溴化汞标准储备液，加入skf-525a内标物500 ng，加入0.01mol/L盐酸溶液1 ml，分别用2 ml乙酸乙酯、2ml二氯甲烷和2 ml环己烷涡旋混合提取，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，常温下氮气吹干，用20 μl乙酸乙酯复溶，取1 μl进样分析。分别计算氯化汞和溴化汞的提取回收率。

实验结果见表1,结果可知乙酸乙酯为溶剂时提取效率最高。

2、不同pH值对提取回收率的影响。

实验考察了不同pH值对提取回收率的影响。

实验过程如下：分别取三份空白尿液各0.5 g，加入等量的氯化汞和溴化汞标准储备液，加入skf-525a内标物500 ng，分别在检材中加入1 mL 0.01 M的盐酸溶液，1 mL 蒸馏水和1 mL 0.01 M的氢氧化钠溶液，使pH值分别为酸性pH=2、中性pH=7和碱性pH=12，用2 ml乙酸乙酯涡旋混合提取，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，常温下氮气吹干，用20 μl乙酸乙酯复溶，取1 μl进样分析。分别计算氯化汞和溴化汞的提取回收率。

实验结果见图1,经计算在酸性条件下回收率最高。可知在酸性条件下氯化汞和溴化汞能更好地以分子形式存在，故本发明加入0.01mol/L盐酸溶液。

3、不同离子强度对提取回收率的影响。

实验考察了离子强度对提取回收率的影响。

实验过程如下：分别取2分空白尿液各0.5 g，加入等量的氯化汞和溴化汞标准储备液，加入skf-525a内标物500 ng，分别在检材中加入1 mL 蒸馏水和1 mL 饱和氯化钠溶液，使溶液呈现不同的离子强度，用2 ml乙酸乙酯涡旋混合提取，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，常温下氮气吹干，用20 μl乙酸乙酯复溶，取1 μl进样分析。分别计算氯化汞和溴化汞的提取回收率。

结果表明，加入饱和氯化钠溶液后，不能从检材中提取出氯化汞和溴化汞。分析原因可能是离子强度的改变影响了氯化汞和溴化汞的分子结构，使其不能被提取分离出来。

4、不同升温程序对于分离效果的影响。

为了比较不同的升温程序对于氯化汞和溴化汞的分离效果，采用了不同的程序升温，其余检测方法相同。

A组：本发明的升温程序，初始柱温为60 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升温至180℃保持8 min，再以30 ℃/min升温至260 ℃。

B组：对比文献（《气相色谱-质谱联用法检测生物检材中的氯化汞》，中国卫生检验杂志，2016，Vo.l26,No.17）中的升温程序：初始柱温为60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升温至260 ℃。

结果表明，本发明升温条件下氯化汞和溴化汞实现基线分离氯化汞和溴化汞的分离度明显提升，色谱图上两峰达到基线分离，能够实现同时检测；而对比文献条件下氯化汞与溴化汞不能完全分离，见图2。

实施例二。

（1）检测条件。

气质联用仪：采用Aglient公司生产的7890B-5977A气质联用仪。

色谱柱：HP-5ms毛细管柱，规格：30 m×0.25 mm，0.25 μm；

电子离子轰击源(EI源，70 eV)，全离子扫描，扫描质量范围为40 amu～600 amu。

载气为高纯氦气(99.9%)，流速1.0 ml/min。

升温程序: 初始柱温为60 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升温至180℃,保持8 min，再以30 ℃/min升温至260 ℃, 进样口温度为265 ℃，离子源温度为230 ℃。

（2）样品处理。

取人体尿液0.5 g，加入skf-525a内标物500 ng，加入0.01mol/L盐酸溶液1 ml，用2 ml乙酸乙酯涡旋混合提取，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，常温下氮气吹干，用20μl乙酸乙酯复溶，取1 μl进样分析。

（3）氯化汞和溴化汞储备液的配制。

氯化汞标准储备液（1.0 mg/ml）：精密称取0.135 4 g经干燥的氯化汞，用重铬酸钾的硝酸溶液（0.5 g/L）溶解，并转移至100 ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀，于4 ℃冰箱保存备用。

溴化汞标准储备液（50.0 mg/ml）：取溴化汞2.5g，加乙醇50ml，微热使溶解，即得。本液应置玻璃塞瓶内，在暗处保存。

(4)图谱分析。

氯化汞和溴化汞的保留时间均在8 min左右，氯化汞谱图中m/z 272为分子离子峰，m/z 237为失去一个氯离子的碎片离子峰，m/z 202为失去两个氯离子的碎片离子峰。

溴化汞谱图中m/z 360为分子离子峰，m/z 281为失去一个溴离子的碎片离子峰，m/z 202为失去两个溴离子的碎片离子峰，m/z 79为单一溴离子的碎片离子峰。

（5）含量计算。

向人体尿液中添加氯化汞和溴化汞储备液，制成标准工作曲线，以氯化汞和溴化汞的峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，以氯化汞和溴化汞的浓度为横坐标，分别计算回归方程；计算含量时，将待测样品中氯化汞或溴化汞的峰面积代入回归方程即得到待测样品含量。尿中氯化汞标准工作曲线为y>x>r）为0.999>y =0.0002x>r）为0.999>

含量计算：取待测尿液0.5 g，加入skf-525a内标物500 ng，加入0.01 mol/L盐酸溶液1 ml，用2 ml乙酸乙酯涡旋混合提取，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，常温下氮气吹干，用20 μl乙酸乙酯复溶，取1 μl进样分析。记录氯化汞的峰面积为20453，溴化汞的峰面积为30100，内标的峰面积为24435114。代入标准工作曲线，得到氯化汞含量为2.66 μg/g，溴化汞的含量为6.05 μg/g。

实施例三。

取待测血浆0.5 g，按照上述方法测定血浆中氯化汞含量为1.34 μg/g，溴化汞的含量为2.76 μg/g。

实施例四。

取待测胃内容物0.5 g，按照上述方法测定血浆中氯化汞含量为8.86 μg/g，溴化汞的含量为10.48 μg/g。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。