一种恢复抗生素使用后奶牛瘤胃微生物群落的方法

摘要

本发明涉及一种恢复抗生素使用后奶牛瘤胃微生物群落的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)从健康奶牛获得包含健康瘤胃微生物菌群的瘤胃菌群液；(2)通过厌氧菌保护剂对瘤胃菌群进行保护；(3)将包含健康瘤胃菌群的瘤胃菌群液移植给抗生素使用后的奶牛。本发明的方法可以达到快速恢复瘤胃微生物群落的效果，从而降低抗生素对奶牛和环境的危害，必要时，可达到疾病防治的目的。同时，本方法简便易操作，适合牧场实际应用。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种恢复抗生素使用后奶牛瘤胃微生物群落的方法。

背景技术

抗生素是牧场治疗或预防病原菌感染的常用药品。由于抗生素能够直接快速的杀灭病原菌，达到预防和治疗致病微生物引起的相关疾病的目的，而且工业生产的抗生素价格低廉，作为奶牛疾病治疗和预防的常备药物而被广泛应用。

然而，越来越多的证据表明，无论抗生素的使用是否规范，都从两方面威胁着人类和动物的健康：1、抗生素的使用导致胃肠道微生物群落紊乱，对动物免疫调节、抗感染能力、食物消化吸收能力等产生不利影响；2、抗生素作为胁迫因子，会促进耐药细菌的不断进化，从而导致耐药微生物激增，降低了抗生素治疗人类和动物的致病菌感染的效果。2015年的调查发现，欧洲和美国当年因感染耐药病原菌导致的死亡人数为5万人，预计到2050年，这一数字可增加至1000万。而我国是世界上最大的抗生素生产国和使用国，2007年的调查发现，我国抗生素年产量为21万吨，其中46.1％应用于畜牧业，畜产品中抗生素残留及其累积携带的耐药微生物可通过食物链传递给人类，因此，抗生素的使用也正面临着巨大的挑战。人们在不断加快开发新型抗生素或抗生素的替代物，但现阶段抗生素的使用仍然具有不可替代性。因此，抗生素的使用不仅仅是保留或禁止的单项选择，本技术方案提供了一种降低或消除抗生素对奶牛瘤胃微生物群落危害的方法。

微生物紊乱后难以恢复是抗生素使用的另一个潜在危害。在人和小鼠上的研究均表明，抗生素导致的肠道微生物群落紊乱在数月乃至数年后仍不能恢复，从而长期影响了动物的代谢和健康。奶牛的营养消化高度依赖于健康的瘤胃微生物群落，抗生素的使用也导致了奶牛瘤胃微生物群落的长期紊乱，降低了奶牛生产性能和健康水平。目前，还未有通过瘤胃微生物群落移植技术促进抗生素使用后奶牛瘤胃微生物群落恢复的文献报道。

发明内容

为了填补现有技术空白，本发明的目的是提供一种通过瘤胃微生物群落移植技术促进抗生素使用后奶牛瘤胃微生物群落恢复的方法。

为了实现如上目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种快速恢复抗生素使用后牛瘤胃微生物群落的方法，主要步骤包括：(1)获得健康奶牛瘤胃菌群；(2)添加厌氧菌保护剂保护菌群；(3)移植给抗生素使用后的奶牛，达到快速恢复因抗生素而导致紊乱的瘤胃微生物群落的目的。

作为优选，步骤(1)的健康奶牛选取健康成年奶牛，近3个月未有疾病记录或使用抗生素，其所采食的日粮成分与受体奶牛保持一致。

作为优选，步骤(1)的瘤胃菌群液获取通过分离奶牛瘤胃菌群液获得，主要为两种途径：a，使用真空抽吸瘤胃菌群液采集器，通过奶牛口腔采集瘤胃菌群液；b，使用健康瘘管牛，从瘘管处用真空抽吸瘤胃菌群液采集器进行采集或人工手动采集。所获得瘤胃菌群液均需通过2层医用纱布(孔径为0.15mm)过滤去除食糜颗粒。

作为优选，步骤(1)所获得瘤胃菌群液通过带盖的水桶或密封塑料袋盛放。

作为优选，步骤(1)获得健康牛的瘤胃菌群液以后，使用pH计测定pH，pH为6.2～7范围内最佳，若pH<5.5，则瘤胃菌群液不能作为供体瘤胃菌群液使用。通过显微镜直接计数法进行瘤胃菌群液微生物浓度检测，达到1*10⁸以上，为质量合格的供体瘤胃菌群液。

作为优选，步骤(2)厌氧菌保护剂成分为葡萄糖和巯基乙酸钠，二者的质量比为10:1。使用时，将厌氧菌保护剂预先溶解在37摄氏度清水中得到厌氧菌保护剂溶液，使葡萄糖的浓度为10g/L，巯基乙酸钠的浓度为1g/L，现配现用。

作为优选，步骤(2)在获得瘤胃菌群液后及时加入厌氧菌保护剂溶液并轻柔搅拌，使其均匀分布在瘤胃菌群液中，厌氧菌保护剂溶液与瘤胃菌群液比例为1:9。

作为优选，步骤(3)中瘤胃菌群受体奶牛为因抗生素使用而导致瘤胃微生物群落紊乱的奶牛。移植时机为距离最后一次抗生素使用后的12-24h。

作为优选，步骤(3)移植给受体奶牛的方法为使用牛用口腔灌服器，将处理后的瘤胃菌群液泵入受体奶牛瘤胃。

作为优选，步骤(3)每头受体奶牛的移植量为5-15L。

作为优选，步骤(3)每头受体奶牛可以采用一次或多次灌注，如多次灌注，灌注间隔建议24h。

本发明的有益效果在于：

本发明通过使用健康瘤胃微生物群落移植的方法，能够快速恢复经过抗生素使用导致瘤胃微生物群落紊乱的牛的瘤胃微生物群落，紊乱微生物群落的恢复保证了奶牛营养物质消化的正常进行，同时也可抵御条件致病菌的入侵定植，必要时，可达到疾病防治的目的。

不仅如此，本发明所述方法操作简便，直接使用瘤胃菌群液进行菌群移植，减少了瘤胃菌群离心分离等繁琐步骤，也更大限度的保障了菌群的活性。并且通过厌氧菌保护剂的添加保护了瘤胃菌群的活性，不再需要体外培养和富集步骤，避免了体外培养导致的瘤胃菌群丢失；最后，简明的操作步骤在牧场实践中基本实现了瘤胃菌群的现采现用，并通过简单的保护剂添加保证了使用效果。因此，本发明所述的方法可广泛应用于动物医学领域、营养学领域、微生物技术领域。

附图说明

图1为本发明实施例的瘤胃菌群液移植后瘤胃微生物群落结构变化示意图。其中，小号图标代表每每头牛在不同时间点上的样品；大号图标代表每个组的均值；实线箭头，对照组瘤胃微生物群落变化；虚线箭头，瘤胃菌群液移植组微生物群落变化。

图2为本发明实施例中的瘤胃菌群液移植后瘤胃微生物丰富度和多样性示意图。其中，使用丰富度指数来评价瘤胃微生物群落的物种种类丰富性，数值越大，表明该处理组的奶牛瘤胃微生物种类越多，数值越小，表明该处理组的奶牛瘤胃微生物种类越少；使用多样性指数评价奶牛瘤胃中微生物微生物群落的多样性，不仅考虑了群落丰富度，也加权了物种丰度信息。使用Kruskal-Wallis法进行秩和检验，进行组间比较。多样性指数值越大，表明群落多样性越高；指数值越小，表明群落多样性越低。*p<0.1；**p<0.05；***p<0.01。

图3为本发明实施例中的瘤胃菌群液移植后组内瘤胃微生物群落结构稳定性示意图。其中，使用组内β多样性评价不同处理组微生物群落结构稳定性，使用Kruskal-Wallis法法进行秩和检验，进行组间比较。β多样性值越接近于1，说明组内微生物群落结构更稳定，值越接近于0，说明组内微生物群落结构越不稳定。*p<0.1；**p<0.05；***p<0.01。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

具体实施方式

1、试验动物和饲养条件

选取10头年龄、体况相近健康奶牛作为试验动物，5头瘤胃瘘管牛作为供体牛(本试验基地已具备)，饲养场群体饲养，给予相同日粮，自由采食，自由饮水。

2、试验处理和样品采集

(1)试验动物模型构建。每头试验牛均按照治疗剂量每次青霉素(800万单位)和链霉素(500万单位)进行肌肉注射，早晚各进行一次注射，连续注射14天。

(2)瘤胃菌群液获取。瘤胃菌群液通过瘤胃瘘管从供体奶牛获得，经2层医用纱布(孔径0.15mm)过滤，取过滤液于带盖水桶中，取5ml瘤胃菌群液进行pH值测定和显微镜计数，确认瘤胃菌群液符合质量要求。

(3)瘤胃菌群液保存。厌氧菌保护剂成分为为10g葡萄糖和1g巯基乙酸钠，厌氧菌保护剂预先溶解在1L的37摄氏度清水中，得到厌氧保护剂溶液，现配现用。瘤胃菌群液取样后，及时将厌氧菌保护剂溶液注入装有瘤胃菌群液的水桶中，配置好的厌氧保护剂溶液与瘤胃菌群液比例按1:9比例混合，并轻柔搅拌，使其均匀分布在瘤胃菌群液中，然后及时密封水桶。

(4)瘤胃菌群移植。接受抗生素的试验奶牛在完成模型构建后被随机分成2组，分别为对照组和瘤胃菌群液移植组。抗生素停用24小时后，对照组通过口腔插管法灌注10L清水；试验组通过口腔插管法灌注健康供体牛瘤胃菌群液，移植量为10L/头，每天一次，每次间隔24小时，连续移植3天。

(5)样品采集。在抗生素注射后第14天晨饲前采集瘤胃菌群液样品，并采集对照组和移植组停用抗生素后4、11和18天(即移植后1、8和15天)的瘤胃菌群液，液氮保存，并尽快转入-80℃冰箱中。

3、样品测定

瘤胃菌群液经过DNA提取和PCR扩增等处理后，以16S rDNA的V3-V4区于IlluminaMiseq高通量平台上测序，进行微生物区系分析。

4、试验结果

使用微生物群落结构PCoA分析描述抗生素使用后瘤胃微生物群落的恢复过程，对比不做处理的对照组，移植瘤胃菌群液以后，微生物群落在11天已经达到稳定，而对照组在18天后仍然没有恢复到稳定水平。图1所示，在抗生素注射后第4天，对照组和瘤胃菌群液移植组的微生物群落显著不同(P<0.01)；移植组第18天的瘤胃微生物群落结构于第11天没有明显差异，所以瘤胃菌群液移植组在第11天时，瘤胃微生物群落已经达到了稳定水平；对照组的瘤胃微生物，在第11天和第4天的群落结构差异显著(P<0.01)，第18天和第11天的群落结构差异显著(P<0.01)，对照组在18天内，瘤胃微生物群落一直处于恢复过程中。因此，瘤胃菌群液移植对于奶牛抗生素使用后瘤胃微生物群落的快速恢复具有显著效果。

通过微生物群落丰富度(richness)和多样性(diversity)指标来评估移植组和对照组瘤胃微生物在抗生素使用后的变化过程，结果表明瘤胃微生物群落移植促进了瘤胃微生物群落丰富度和多样性恢复。图2所示，瘤胃菌群液移植组在4天、11天和18天的微生物群落丰富度均显著高于抗生素使用后，而对照组在4天、11天和18天的丰富度与抗生素使用后没有显著差异。结果表明，瘤胃菌群液移植后，使得瘤胃微生物的丰富度快速上升并稳定保持；对照组在18天内微生物丰富度仍没有发生显著上升。试验组的微生物群落多样性在第4天和第18天也显著高于抗生素使用后，而对照组在18天内，与抗生素使用后相比，微生物多样性没有显著提升。因此，在奶牛经过抗生素使用后，采用本发明中瘤胃菌群液移植的方法，能够快速的提高瘤胃微生物群落的丰富度和多样性，并在群落恢复后保持稳定。

通过组内β多样性来评价不同时期微生物群落的稳定性，结果表明瘤胃微生物群落移植可快速恢复瘤胃微生物群落稳定性。图3所示，抗生素使用后，瘤胃微生物群落稳定性最低，对照组在自然恢复情况下稳定性需要18天才显著提高，而移植组在经过瘤胃菌群液移植后，微生物群落稳定性在第4、11和18天，均显著高于抗生素使用后。因此，使用本发明中瘤胃菌群液移植的方法，可以快速提高抗生素使用后瘤胃微生物群落结构的稳定性。

以上试验结果表明：使用瘤胃菌群液移植的方法，能够快速恢复瘤胃微生物群落，并显著增加微生物群落的丰富度和多样性，显著提高群落稳定性。因此，通过瘤胃菌群液移植的处理，可以显著降低或消除抗生素对瘤胃微生物群落的破坏，快速有效的恢复微生物群落的健康，降低因抗生素使用对人类和动物带来的危害。