一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用。本发明提供了一种蛋白质(IAA350/351/358VVV突变体蛋白)，为将二氢硫辛酰胺脱氢酶进行点突变甲和点突变乙和点突变丙得到的蛋白质；点突变甲为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第350位氨基酸残基由I突变为V；点突变乙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第351位氨基酸残基由A突变为V；点突变丙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第358位氨基酸残基由A突变为V。本发明提供的突变体蛋白，对NADH抑制的敏感性降低，使得PDH在厌氧大肠杆菌培养物中对NADH的耐受性增加，能有效提高PDH的活性。本发明对于大肠杆菌生产琥珀酸盐、乙醇、丁醇、1,3‑丙二醇等还原化学物质具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

大肠杆菌，兼性异养，在有氧和无氧条件下均能生长。丙酮酸脱氢酶(PDH)又称丙酮酸脱氢酶复合物(PDHC)，位于线粒体中，控制着碳水化合物利用的关键步骤，即丙酮酸转化为乙酰辅酶A和NADH。PDH的三个组分由单个操纵子编码，该操纵子包括调节基因(pdhR)和三个结构基因，三个结构基因为aceE基因(编码丙酮酸脱氢酶E1)、aceF基因(编码二氢硫辛酰胺乙酰转移酶E2)和lpd基因(编码二氢硫辛酰胺脱氢酶E3)。在厌氧条件下，大肠杆菌的细胞提取物中能检测到PDH活性，然而，大肠杆菌体内的PDH通常是无活性的。在有氧生长期间，糖酵解中产生的NADH最终被氧化，而在糖酵解过程中由葡萄糖产生的有机化合物用作电子受体，以维持氧化还原平衡，并且在厌氧条件下持续细菌的生长。由于两种生长模式之间的电子受体的差异，厌氧细胞所报导的[NADH]/[NAD⁺]比值远高于好氧细胞的比值。由于NADH的抑制，厌氧大肠杆菌培养物中的PDH活性非常低或检测不到其活性。进一步的研究已经证实，PDH的NADH敏感性位于二氢硫辛酰胺脱氢酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,Lpd)中，因为只有这种酶与NAD⁺作为底物相互作用。

工业发酵旨在有氧或厌氧的条件下，微生物利用便宜的原料生产有价值的产品。在厌氧发酵过程中，还原力NADH主要集中于产物的合成而不是被氧化，从而导致目标产物产量更高。例如，乳酸和琥珀酸等有机酸，二者均能通过厌氧发酵有效地产生。然而，乳酸和琥珀酸的最大理论得率均受NADH供应的限制。这是因为：在厌氧条件下，由于PDH的活力受到抑制，1摩尔的葡萄糖经糖酵解途径仅能提供2摩尔的NADH；然而在好氧条件下，1摩尔的葡萄糖可以产生4摩尔的NADH。可见，足够还原力的供应对于获得目标产物的最大理论得率是至关重要的。PDH催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A，同时伴随一分子NADH的生成。如果PDH酶被激活，NADH的可利用度就可以得到改善，导致代谢通路中NADH依赖型的产品的产量增加。

发明内容

本发明的目的是提供一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用。

本发明提供了一种蛋白质(IAA350/351/358VVV突变体蛋白)，为如下(a1)或(a2)：

(a1)将二氢硫辛酰胺脱氢酶进行点突变甲和点突变乙和点突变丙得到的蛋白质；所述点突变甲为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第350位氨基酸残基由I突变为V；所述点突变乙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第351位氨基酸残基由A突变为V；所述点突变丙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第358位氨基酸残基由A突变为V；

(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

所述标签见表1。

表1标签的序列

标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL

所述二氢硫辛酰胺脱氢酶为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)序列表的序列1所示的蛋白质；

(b2)来源于大肠杆菌且与序列表的序列1所示的蛋白质具有90％以上同一性的蛋白质；

(b3)来源于大肠杆菌且与序列表的序列1所示的蛋白质具有90％以上同一性且具有二氢硫辛酰胺脱氢酶功能的蛋白质。

所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌MG1655。

编码IAA350/351/358VVV突变体蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因为将序列表的序列2所示DNA分子进行如下突变得到的DNA分子：第1048-1053位核苷酸由“ATCGCC”突变为了“GTTGTT”，并且，第1072-1074位核苷酸由“GCA”突变为了“GTT”。

含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可为在pET-28a(+)质粒的多克隆位点(例如BamHI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列2所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述重组菌具体可为将以上任一所述重组载体导入出发菌得到的重组菌。所述出发菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还保护IAA350/351/358VVV突变体蛋白作为二氢硫辛酰胺脱氢酶的应用。

本发明还保护一种丙酮酸脱氢酶复合物，其特征在于：用IAA350/351/358VVV突变体蛋白代替了丙酮酸脱氢酶复合物中的二氢硫辛酰胺脱氢酶。

本发明还保护所述丙酮酸脱氢酶复合物作为丙酮酸脱氢酶复合物的应用。

本发明还保护一种制备IAA350/351/358VVV突变体蛋白的方法，包括发酵所述重组菌的步骤。

本发明还保护一种解除二氢硫辛酰胺脱氢酶受NADH抑制的方法，包括如下步骤：将二氢硫辛酰胺脱氢酶进行点突变甲和点突变乙和点突变丙；所述点突变甲为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第350位氨基酸残基由I突变为V；所述点突变乙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第351位氨基酸残基由A突变为V；所述点突变丙为将二氢硫辛酰胺脱氢酶第358位氨基酸残基由A突变为V。

为了获得厌氧条件下目标产品的最大产量，微生物必须提供足够的还原当量。丙酮酸脱氢酶催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A，同时伴随一分子NADH的生成。然而在厌氧条件下，由于二氢硫辛酰胺脱氢酶受NADH的抑制，大肠杆菌的PDH通常是没有活性的。本发明的发明人通过大量序列分析、结构分析建立了容量庞大的突变蛋白库，对多个单点突变蛋白和多点突变蛋白的酶活进行比较，寻找可以消除NADH对LPD的抑制作用(进而消除NADH对PDH的抑制)的关键的突变点，发现了一个三点突变的突变体蛋白(IAA350/351/358VVV)。

与野生型蛋白以及其他突变体蛋白相比，突变体蛋白(IAA350/351/358VVV)能更有效的提高厌氧条件下PDH的活力，降低PDH对NADH抑制的敏感性。即使存在较高水平的NADH，突变体蛋白IAA350/351/358VVV也是有活性的。突变体蛋白IAA350/351/358VVV的PDH活性在NADH]/[NAD⁺]比为0.15时是A358V突变体的6倍以上。据报道，在需氧条件下生长的大肠杆菌的细胞内[NADH]/[NAD⁺]比约为0.03至0.05。在这个比例下，PDH复合物保留了最大活性的几乎90％。预计厌氧细胞的[NADH]/[NAD⁺]比值将高于需氧细胞的浓度值得注意的是，在添加[NADH]/[NAD⁺]比为0.15的条件下，突变体蛋白IAA350/351/358VVV的PDH的活性仍然高于没有任何NADH添加的野生型蛋白PDH的活性。

本发明提供的突变体蛋白(IAA350/351/358VVV)，对NADH抑制的敏感性降低，使得PDH在厌氧大肠杆菌培养物中对NADH的耐受性增加，能有效提高PDH的活性。本发明对于大肠杆菌生产琥珀酸盐、乙醇、丁醇、1,3-丙二醇等还原化学物质具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例2的结果。

图2为实施例3的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

E.coli BL21(DE3)：Tiangen。pET-28a(+)：Novagan，Lausanne，Switzerland。

实施例1中所用的各个引物见表2。

表2

实施例1、重组菌的构架

一、重组质粒的构建

1、以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，采用F和R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、取步骤1得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶BamHI和XhoI进行双酶切，回收酶切产物。

3、取pET-28a(+)质粒，用限制性内切酶BamHI和XhoI进行双酶切，回收载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET-28a-LPD。根据测序结果，对重组质粒pET-28a-LPD进行结构描述如下：在pET-28a(+)质粒的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA分子。序列表的序列2所示的DNA分子，编码序列表的序列1所示的野生型蛋白。

5、以重组质粒pET-28a-LPD为模板，采用A358V+和A358V-组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pET-28a-LPD(A358V)。将重组质粒pET-28a-LPD(A358V)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET-28a-LPD相比，重组质粒pET-28a-LPD(A358V)的差异仅在于将序列2所示DNA分子第1072-1074位核苷酸由“GCA”突变为了“GTT”。突变后的DNA分子编码A358V突变体蛋白。

6、以重组质粒pET-28a-LPD为模板，采用IA350/351VV+和IA350/351VV-组成的引物对进行两点突变，得到重组质粒pET-28a-LPD(IA350/351VV)。将重组质粒pET-28a-LPD(IA350/351VV)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET-28a-LPD相比，重组质粒pET-28a-LPD(IA350/351VV)的差异仅在于将序列2所示DNA分子第1048-1053位核苷酸由“ATCGCC”突变为了“GTTGTT”。突变后的DNA分子编码IA350/351VV突变体蛋白。

7、以重组质粒pET-28a-LPD为模板，采用EA354/358KV+和EA354/358KV-组成的引物对进行两点突变，得到重组质粒pET-28a-LPD(EA354/358KV)。将重组质粒pET-28a-LPD(EA354/358KV)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET-28a-LPD相比，重组质粒pET-28a-LPD(EA354/358KV)的差异仅在于将序列2所示DNA分子第1060-1062位核苷酸由“GAA”替换为了“AAA”，并且将序列2所示DNA分子第1072-1074位核苷酸由“GCA”突变为了“GTT”。突变后的DNA分子编码EA354/358KV突变体蛋白。

8、以重组质粒pET-28a-LPD(A358V)为模板，采用IA350/351VV+和IA350/351VV-组成的引物对进行两点突变，得到重组质粒pET-28a-LPD(IAA350/351/358VVV)。将重组质粒pET-28a-LPD(IAA350/351/358VVV)进行测序，测序结果表明：与重组质粒pET-28a-LPD相比，重组质粒pET-28a-LPD(IAA350/351/358VVV)的差异仅在于将序列2所示DNA分子第1048-1053位核苷酸由“ATCGCC”突变为了“GTTGTT”，并且将序列2所示DNA分子第1072-1074位核苷酸由“GCA”突变为了“GTT”。突变后的DNA分子编码IAA350/351/358VVV突变体蛋白。

9、以重组质粒pET-28a-LPD(EA354/358KV)为模板，采用IA350/351VV+和IA350/351VV-组成的引物对进行两点突变，得到重组质粒pET-28a-LPD(IAEA350/351/354/358VVKV)。将重组质粒pET-28a-LPD(IAEA350/351/354/358VVKV)进行测序，测序结果表明，与重组质粒pET-28a-LPD相比，重组质粒pET-28a-LPD(IAEA350/351/354/358VVKV)的差异仅在于将序列2所示DNA分子第1048-1053位核苷酸由“ATCGCC”突变为了“GTTGTT”，并且将序列2所示DNA分子第1060-1062位核苷酸由“GAA”替换为了“AAA”，并且将序列2所示DNA分子第1072-1074位核苷酸由“GCA”突变为了“GTT”。突变后的DNA分子编码IAEA350/351/354/358VVKV突变体蛋白。

二、重组菌的构建

将重组质粒pET-28a-LPD导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌WT。

将重组质粒pET-28a-LPD(A358V)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌A358V。

将重组质粒pET-28a-LPD(IA350/351VV)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌IA350/351VV。

将重组质粒pET-28a-LPD(EA354/358KV)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌EA354/358KV。

将重组质粒pET-28a-LPD(IAA350/351/358VVV)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌IAA350/351/358VVV。

将重组质粒pET-28a-LPD(IAEA350/351/354/358VVKV)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌IAEA350/351/354/358VVKV。

实施例2、野生型蛋白以及各个突变体蛋白的制备以及酶活检测

一、蛋白的表达和纯化

分别采用实施例1制备的各个重组菌制备N端融合有His₆标签的各个蛋白质，具体步骤均如下：

1、将重组菌接种至含30μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、170rpm振荡培养至OD_600nm值＝0.6-0.8。

2、完成步骤1后，在体系中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)并使其浓度为1mM，25℃、120rpm振荡培养8小时。

3、完成步骤2后，离心收集细胞。

4、取步骤3得到的细胞，用结合缓冲液悬浮，然后进行超声破碎(10％的功率，破3秒停5秒，总时间10分钟)，然后12000g离心20分钟，收集上清液。

结合缓冲液(pH7.8)：含20mM Tris-HCl、500mM氯化钠和10mM咪唑，余量为水。

5、取步骤4得到的上清液，采用镍亲和层析纯化目的蛋白。

镍亲和层析的柱子为：Ni-Agarose亲和层析柱(15mL)。

纯化过程：①上样2mL上清液；②用结合缓冲液洗涤3个柱体积；③用2.5mL洗脱缓冲液洗脱，收集过柱后溶液。

洗脱缓冲液(pH7.8)：含20mM Tris-HCl、500mM氯化钠和300mM咪唑，余量为水。

6、取步骤5得到的过柱后溶液，采用GE Healthcare公司的脱盐柱，将蛋白的溶剂体系替换为pH7.0、0.01M的PBS缓冲液，得到蛋白溶液。

重组菌WT进行上述步骤得到的蛋白溶液命名为WT蛋白溶液。

重组菌A358V进行上述步骤得到的蛋白溶液命名为A358V蛋白溶液。

重组菌IA350/351VV进行上述步骤得到的蛋白溶液命名为IA350/351VV蛋白溶液。

重组菌EA354/358KV进行上述步骤得到的蛋白溶液命名为EA354/358KV蛋白溶液。

重组菌IAA350/351/358VVV进行上述步骤得到的蛋白溶液命名为IAA350/351/358VVV蛋白溶液。

重组菌IAEA350/351/354/358VVKV进行上述步骤得到的蛋白溶液命名为IAEA350/351/354/358VVKV蛋白溶液。

使用牛血清白蛋白作为标准，通过Bradford方法测定各个蛋白溶液中的蛋白质浓度。

二、酶活检测

取步骤一制备的各个蛋白溶液，分别作为待测溶液，检测其作为二氢硫辛酰胺脱氢酶的酶活。

反应体系(1.0ml)：含0.1M KH₂PO₄、3mM>+、NADH、3mM>

反应体系中，设置不同的NADH浓度，0浓度即不加入NADH。

反应体系中，蛋白浓度为3mg/ml(以总浓度计)，蛋白来源为待测溶液。

反应条件：30℃静置反应。

持续检测340nm处吸光度(A_340nm)，每10秒记一次值。

△A_340nm＝第30秒的A_340nm-第10秒的A_340nm。

将“NADH与NAD⁺的摩尔比为0，WT蛋白溶液作为待测溶液”这一条件下得到的△A_340nm作为参照值。计算其他条件下得到的△A_340nm与参照值的比值，即为LPD相对酶活。

结果见图1。图1中，横坐标为初始反应体系中NADH与NAD⁺的摩尔比。随着NADH浓度的增高，LPD酶活逐渐被抑制。IAA350/351/358VVV突变体蛋白的活性远高于野生型蛋白和所有其他突变体蛋白。值得注意的是，在[NADH]/[NAD⁺]比为0.15的“苛刻”条件下，IAA350/351/358VVV突变体蛋白的活性仍然高于没有任何NADH添加的野生型蛋白的活性。IAEA350/351/354/358VVKV突变体蛋白的活性低于野生型蛋白。

酶活性的一个单位定义为1mg蛋白在1min内生成1μmol NADH。当“NADH与NAD⁺的摩尔比为0，WT蛋白溶液作为待测溶液”时，野生型蛋白的酶活为1.51±0.03U/mg。

实施例3、各个丙酮酸脱氢酶复合物对NADH抑制的敏感性

为了证实IAA350/351/358VVV突变体蛋白对NADH抑制的较低敏感性转化为整个丙酮酸脱氢酶复合物对NADH抑制的较低敏感，使用全细胞提取物测量活性。

一、制备全细胞提取物

分别采用实施例1制备的各个重组菌制备全细胞提取物，具体步骤均如下：

1、将重组菌接种至含30μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、170rpm振荡培养至OD_600nm值＝0.6-0.8。

2、完成步骤1后，在体系中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)并使其浓度为1mM，25℃、120rpm振荡培养8小时。

3、完成步骤2后，离心收集细胞。

4、取步骤3得到的细胞，用结合缓冲液悬浮，然后进行超声破碎(10％的功率，破3秒停5秒，总时间10分钟)，然后12000g离心20分钟，收集上清液，即为全细胞提取物。

重组菌WT进行上述步骤得到的全细胞提取物命名为WT全细胞提取物。

重组菌A358V进行上述步骤得到的全细胞提取物命名为A358V全细胞提取物。

重组菌IAA350/351/358VVV进行上述步骤得到的全细胞提取物命名为IAA350/351/358VVV全细胞提取物。

二、酶活检测

取步骤一制备的各个全细胞提取物，分别作为待测溶液，检测其作为丙酮酸脱氢酶复合物的酶活。

初始体系(1ml)：含0.2mM焦磷酸硫胺素、0.1mM CoA、10mM MgCl₂、1mM>+、NADH和待测溶液，余量为pH7.5、100mM的Tris-HCl缓冲液。

初始体系中，设置不同的NADH浓度，0浓度即不加入NADH。

反应体系中，蛋白浓度为3mg/ml(以总浓度计)，蛋白来源为待测溶液。

向初始体系中加入丙酮酸并使其浓度为5mM以启动反应。

反应条件：30℃静置反应。

持续检测340nm处吸光度(A_340nm)，每10秒记一次值。

△A_340nm＝第30秒的A_340nm-第10秒的A_340nm。

将“NADH与NAD⁺的摩尔比为0，WT蛋白溶液作为待测溶液”这一条件下得到的△A_340nm作为参照值。计算其他条件下得到的△A_340nm与参照值的比值，即为相对酶活。

结果见图2。图2中，左上图为初始反应体系中NADH与NAD⁺的摩尔比为0条件下的相对酶活，右上图为初始反应体系中NADH与NAD⁺的摩尔比为0.08条件下的相对酶活，左下图为初始反应体系中NADH与NAD⁺的摩尔比为0.1条件下的相对酶活，右下图为初始反应体系中NADH与NAD⁺的摩尔比为0.15条件下的相对酶活。具有IAA350/351/358VVV突变体蛋白的丙酮酸脱氢酶复合物的活性高于具有野生型蛋白的丙酮酸脱氢酶复合物以及具有A358V突变体蛋白的丙酮酸脱氢酶复合物。IAA350/351/358VVV突变体蛋白能有效解除PDH对NADH的抑制敏感性。天然PDH在NADH]/[NAD⁺]比为0.15时被完全抑制，而具有IAA350/351/358VVV突变体蛋白的PDH仍然保留参照值的约30％。

酶活性的一个单位定义为1mg蛋白在1min内生成1μmol NADH。当“NADH与NAD⁺的摩尔比为0，WT蛋白溶液作为待测溶液”时，酶活为2.63±0.02U/mg。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用

<130> GNCYX171347

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 474

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 1

Met Ser Thr Glu Ile Lys Thr Gln Val Val Val Leu Gly Ala Gly Pro

1 5 1015

Ala Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Arg Cys Ala Asp Leu Gly Leu Glu Thr

202530

Val Ile Val Glu Arg Tyr Asn Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val

354045

Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Val Ala Lys Val Ile Glu

505560

Glu Ala Lys Ala Leu Ala Glu His Gly Ile Val Phe Gly Glu Pro Lys

65707580

Thr Asp Ile Asp Lys Ile Arg Thr Trp Lys Glu Lys Val Ile Asn Gln

859095

Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Gly Arg Lys Val Lys Val

100 105 110

Val Asn Gly Leu Gly Lys Phe Thr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Val Glu

115 120 125

Gly Glu Asn Gly Lys Thr Val Ile Asn Phe Asp Asn Ala Ile Ile Ala

130 135 140

Ala Gly Ser Arg Pro Ile Gln Leu Pro Phe Ile Pro His Glu Asp Pro

145 150 155 160

Arg Ile Trp Asp Ser Thr Asp Ala Leu Glu Leu Lys Glu Val Pro Glu

165 170 175

Arg Leu Leu Val Met Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly Thr

180 185 190

Val Tyr His Ala Leu Gly Ser Gln Ile Asp Val Val Glu Met Phe Asp

195 200 205

Gln Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Asp Ile Val Lys Val Phe Thr Lys

210 215 220

Arg Ile Ser Lys Lys Phe Asn Leu Met Leu Glu Thr Lys Val Thr Ala

225 230 235 240

Val Glu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Tyr Val Thr Met Glu Gly Lys Lys

245 250 255

Ala Pro Ala Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ile Gly

260 265 270

Arg Val Pro Asn Gly Lys Asn Leu Asp Ala Gly Lys Ala Gly Val Glu

275 280 285

Val Asp Asp Arg Gly Phe Ile Arg Val Asp Lys Gln Leu Arg Thr Asn

290 295 300

Val Pro His Ile Phe Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met Leu

305 310 315 320

Ala His Lys Gly Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Val Ile Ala

325 330 335

Gly Lys Lys His Tyr Phe Asp Pro Lys Val Ile Pro Ser Ile Ala Tyr

340 345 350

Thr Glu Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Leu Thr Glu Lys Glu Ala Lys

355 360 365

Glu Lys Gly Ile Ser Tyr Glu Thr Ala Thr Phe Pro Trp Ala Ala Ser

370 375 380

Gly Arg Ala Ile Ala Ser Asp Cys Ala Asp Gly Met Thr Lys Leu Ile

385 390 395 400

Phe Asp Lys Glu Ser His Arg Val Ile Gly Gly Ala Ile Val Gly Thr

405 410 415

Asn Gly Gly Glu Leu Leu Gly Glu Ile Gly Leu Ala Ile Glu Met Gly

420 425 430

Cys Asp Ala Glu Asp Ile Ala Leu Thr Ile His Ala His Pro Thr Leu

435 440 445

His Glu Ser Val Gly Leu Ala Ala Glu Val Phe Glu Gly Ser Ile Thr

450 455 460

Asp Leu Pro Asn Pro Lys Ala Lys Lys Lys

465 470

<210> 2

<211> 1425

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 2

atgagtactg aaatcaaaac tcaggtcgtg gtacttgggg caggccccgc aggttactcc 60

gctgccttcc gttgcgctga tttaggtctg gaaaccgtaa tcgtagaacg ttacaacacc 120

cttggcggtg tttgcctgaa cgtcggctgt atcccttcta aagcactgct gcacgtagca 180

aaagttatcg aagaagccaa agcgctggct gaacacggta tcgtcttcgg cgaaccgaaa 240

accgatatcg acaagattcg tacctggaaa gagaaagtga tcaatcagct gaccggtggt 300

ctggctggta tggcgaaagg ccgcaaagtc aaagtggtca acggtctggg taaattcacc 360

ggggctaaca ccctggaagt tgaaggtgag aacggcaaaa ccgtgatcaa cttcgacaac 420

gcgatcattg cagcgggttc tcgcccgatc caactgccgt ttattccgca tgaagatccg 480

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