一种调控半滑舌鳎亲鱼性激素分泌的营养学方法

摘要

一种调控半滑舌鳎亲鱼性激素分泌的营养学方法，属于水产营养领域，所述方法在半滑舌鳎亲鱼不同发性腺发育阶段和不同性别亲鱼中采用不同的长链多不饱和脂肪酸营养供给。本发明方法能够对半滑舌鳎亲鱼性类固醇激素的分泌实现在不同阶段和不同性别间的精准调控，促进性激素分泌，提高繁育性能；该技术基于对半滑舌鳎亲鱼饲料中必需营养素的调配，可操作性强；且成本在可控范围内，经济性高。

说明书

技术领域

本发明属于水产营养领域，具体地涉及一种调控半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)亲鱼性激素分泌的营养学方法。

背景技术

半滑舌鳎是我国近海暖温性大型底层鱼类。该鱼性格温顺、生长迅速、肉质鲜嫩，是我国北方重要的高价值养殖经济鱼类。自2002年半滑舌鳎规模化人工繁育技术取得成功以来，半滑舌鳎的养殖量逐年攀升。但是，近年来，半滑舌鳎亲鱼繁育性能出现逐步下降的趋势。野生半滑舌鳎资源量的逐步减少、养殖世代的增加及不合理的投喂策略是导致半滑舌鳎亲鱼繁育性能下降的主要原因。因此，如何提高半滑舌鳎亲鱼的繁育性能成为半滑舌鳎养殖产业中一项迫切的任务。性类固醇激素分泌是鱼类繁育的启动环节，并在鱼类整个繁育过程中都起到重要的作用。所以，要调控半滑舌鳎的繁育性能，需要首先关注对半滑舌鳎亲鱼性类固醇激素的调控。

目前，在调控半滑舌鳎性类固醇激素分泌的技术手段中，通过光照和温度的调控已经有所报道。然而，通过营养学手段进行的调控却还没有报道。尤其是通过某一类营养素进行的针对不同性腺发育阶段的精准调控更没有报道。营养水平是决定动物繁育性能的重要因素。在目前的半滑舌鳎亲鱼培育中，大多使用鲜杂鱼投喂的粗放投喂方式，忽视了半滑舌鳎亲鱼对各种营养素的精准需求，从而导致其亲鱼培育阶段不合理的营养供给。另一方面，在亲鱼性腺发育的不同时期，事实上其营养需求也不尽相同，而在实际生产中，这一点也往往被忽视，亲鱼培育过程中自始至终单一的营养策略违背了亲鱼性腺发育过程中的生理代谢变化规律和营养需求变化规律，导致了繁育性能的下降。因此，需要针对亲鱼性腺发育的不同阶段提供不同的营养策略，以促进半滑舌鳎亲鱼的性腺发育。而且，事实上，不但在性腺发育的不同阶段中其营养需求不同，在雌雄亲体间，其营养需求也存在较大差异，同样需要针对雌雄亲鱼的不同生理特性提供不同的营养策略。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种调控半滑舌鳎亲鱼性激素分泌的营养学方法，所述方法聚焦半滑舌鳎亲鱼性腺发育和性激素分泌中最重要的一类营养物质脂肪酸，尤其是长链多不饱和脂肪酸(二十二碳六烯酸(C22:6n-3， DHA)、二十碳五烯酸(C20:5n-3，EPA)和二十碳四烯酸(C20:4n-6，ARA))，针对不同性腺发育阶段摸索出了针对雌雄亲体的不同的长链多不饱和脂肪酸的供给策略，通过改变饲料中各种长链多不饱和脂肪酸的添加量和比例来调控半滑舌鳎亲鱼性激素分泌，以实现对半滑舌鳎亲鱼培育过程中性激素分泌的精准调控，弥补该领域现有技术的不足。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种调控半滑舌鳎亲鱼性激素分泌的营养学方法，它的方法如下：

(1)对于性腺发育I-III期的雌鱼，在饲料蛋白质占饲料干重的质量比55％以上，脂肪占饲料干重的质量比10％以上的条件下，饲料中DHA和EPA的含量分别占饲料总脂肪酸的质量比为9.9％和14.5％，DHA/EPA的质量比为0.68；不额外添加ARA；

(2)对于性腺发育I-III期的雄鱼，在饲料蛋白质占饲料干重的质量比55％以上，脂肪占饲料干重的质量比10％以上的条件下，饲料中DHA和EPA的含量分别占饲料总脂肪酸的质量比为15.3％和7.5％，DHA/EPA的质量比为2.1；ARA 的含量占饲料总脂肪酸的质量比为5％，EPA/ARA的质量比为1.5；

(3)对于性腺发育IV期至排卵的雌鱼，在饲料蛋白质占饲料干重的质量比 55％以上，脂肪占饲料干重的质量比10％以上的条件下，饲料中DHA和EPA的含量分别占饲料总脂肪酸的质量比为11.7％和10.7％，DHA和EPA的质量比为 1.1；ARA含量占饲料总脂肪酸的质量比为2％，EPA/ARA的质量比为5.4；

(4)对于性腺发育IV期至排精的雄鱼，在饲料蛋白质占饲料干重的质量分比55％以上，脂肪占饲料干重的质量比10％以上的条件下，饲料中DHA和EPA 的含量分别占饲料总脂肪酸的质量比为15.3％和7.5％，DHA/EPA的质量比为2.1； ARA含量占饲料总脂肪酸的质量比为15％～18％，EPA/ARA的质量比为0.4～0.5。

本发明与现有技术相比的有益效果：

(1)能够对半滑舌鳎亲鱼性类固醇激素的分泌实现在不同性腺发育阶段和不同性别间的精准调控，促进性类固醇激素分泌(提高幅度在60％-136％间)，进而能够提高亲鱼的产卵(精)量(提高幅度在47％-63％间)和配子质量(提高幅度32％)，提高受精率(提高55％)、孵化率(提高43％)及仔鱼质量(以 7日龄体长为指标，提高41％)。(2)该技术基于对半滑舌鳎亲鱼饲料中必需营养素的调配，有非常强的可操作性。(3)成本在可控范围内，经济性高。

附图说明

图1、饲料中不同含量的DHA和EPA对未发育成熟的半滑舌鳎雌鱼血清中雌二醇含量的影响。数据以平均值±标准误表示(n＝3)；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异(P<0.05)。处理1，9.91％DHA+14.53％EPA；处理2， 11.71％DHA+10.72％EPA；处理3，15.3％DHA+7.48％EPA。脂肪酸含量为占总脂肪酸含量的百分比。

图2、饲料中不同含量的DHA和EPA对发育成熟的半滑舌鳎雌鱼血清中雌二醇含量的影响。数据以平均值±标准误表示(n＝3)；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异(P<0.05)。处理1，9.91％DHA+14.53％EPA；处理2， 11.71％DHA+10.72％EPA；处理3，15.3％DHA+7.48％EPA。脂肪酸含量为占总脂肪酸含量的百分比。

图3、饲料中不同含量的DHA和EPA对未发育成熟的半滑舌鳎雄鱼血清中睾酮含量的影响。数据以平均值±标准误表示(n＝3)；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异(P<0.05)。处理1，9.91％DHA+14.53％EPA；处理2， 11.71％DHA+10.72％EPA；处理3，15.3％DHA+7.48％EPA。脂肪酸含量为占总脂肪酸含量的百分比。

图4、饲料中不同含量的DHA和EPA对发育成熟的半滑舌鳎雄鱼血清中睾酮含量的影响。数据以平均值±标准误表示(n＝3)；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异(P<0.05)。处理1，9.91％DHA+14.53％EPA；处理2，11.71％DHA+10.72％EPA；处理3，15.3％DHA+7.48％EPA。脂肪酸含量为占总脂肪酸含量的百分比。

图5、饲料中不同含量的ARA对未发育成熟的半滑舌鳎雌鱼血清中雌二醇含量的影响。数据以平均值±标准误表示(n＝3)；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异(P<0.05)；TFA：总脂肪酸。

图6、饲料中不同含量的ARA对发育成熟的半滑舌鳎雌鱼血清中雌二醇含量的影响。数据以平均值±标准误表示(n＝3)；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异(P<0.05)；TFA：总脂肪酸。

图7、饲料中不同含量的ARA对未发育成熟的半滑舌鳎雄鱼血清中睾酮含量的影响。数据以平均值±标准误表示(n＝3)；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异(P<0.05)；TFA：总脂肪酸。

图8、饲料中不同含量的ARA对发育成熟的半滑舌鳎雄鱼血清中睾酮含量的影响。数据以平均值±标准误表示(n＝3)；不含相同字母的数据柱间具有显著性差异(P<0.05)；TFA：总脂肪酸。

图9、技术方案整体应用评价实验技术路线图。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术特征作进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1、不同性腺发育阶段雌雄半滑舌鳎亲鱼饲料中DHA和EPA添加量筛选实验(固定ARA含量)

1、实验设计和实验饲料配方

以鱼粉、酪蛋白、高筋粉为主要蛋白源，以大豆卵磷脂、橄榄油、豆油作为主要脂肪源配制成基础饲料。在基础饲料中添加DHA、EPA，配制成3种不同 DHA和EPA水平的等氮等脂饲料(蛋白含量57.8％、脂肪含量12.5％)，并且使饲料中(DHA+EPA)的总量占饲料含量的2.8％。同时，向饲料中添加一定量的ARA来满足实验鱼对n-6长链多不饱和脂肪酸(n-6LC-PUFA)的需要。饲料配方和脂肪酸组成分别见表1和表2。

表1实验饲料的饲料配方和粗成分(％干物质)

¹维生素混合料(mg>12，>3，10mg；肌醇，800mg；泛酸，60mg；烟酸，200mg；叶酸，20mg；生物素，1.2mg；视黄醇乙酸酯，32mg；胆钙化醇，5mg；α-生育酚，120mg；次粉，13.67g。

²矿物质混合料(mg>

³ARA纯化油：含有41％ARA(总脂肪酸)；甘油三酯的形式。

⁴EPA纯化油：含有52％的EPA(总脂肪酸)；甘油三酯的形式。

⁵DHA纯化油：含有70％的DHA(总脂肪酸)；甘油三酯的形式。

表2实验饲料的脂肪酸组成(％总脂肪酸)

¹SFA：饱和脂肪酸；²MUFA：单不饱和脂肪酸；³n-6PUFA：n-6系列多不饱和脂肪酸；⁴n-3PUFA：>

2、实验用鱼和养殖管理

本实验采用3龄未发育的半滑舌鳎亲鱼。正式试验前，实验鱼在水泥池(25 ㎡)中暂养7天以适应养殖环境条件。实验开始前，将实验鱼随机分到9个玻璃钢(直径：230cm，高：100cm)中，每组三个重复。每缸25尾鱼(10尾雌鱼， 15尾雄鱼)，采用室内流水养殖，水流量50L/min，每天饱食投喂两次。养殖实验在半滑舌鳎亲鱼自然产卵期7月-11月进行，养殖周期90天。在中国山东省海阳市的自然光周期和环境温度(N36°41'，E121°07')的养殖环境下进行，在实验过程中，水温范围为盐度，pH，溶解氧， L^-1。每天摄食结束后半小时进行残余饲料和粪便清理。

3、样品采集及血清中雌二醇以及睾酮的分析

养殖实验结束后，每缸收集获得3尾发育成熟的雌鱼(性腺V期左右)、2 尾未发育成熟的雌鱼(性腺II-III期间)，3尾发育成熟的雄鱼(性腺V期左右) 及2尾发育未成熟的雄鱼(性腺II-III期间)用后续分析研究，每条鱼取血液及性腺样品。雌鱼的成熟以观察到自然排卵为确认标志。由于难以用表观观察的方法来精确确定未成熟雌鱼的具体发育阶段，因此，每缸取4尾具有相似成熟阶段的未成熟雌鱼，然后使用卵母细胞形态学显微镜检查方法来精确确定卵巢成熟的阶段。显微镜检查显示，大多数未成熟卵巢处于早期卵黄生成阶段，从每缸的4 个样品中选取2个具有典型早期卵黄生成特征(即集中出现球形的、嗜酸性的卵黄颗粒/小球)的样品来作为未发育成熟卵巢样品。雄鱼的成熟通过挤压释放精液来确认。未发育成熟精巢的发育鉴定及取样方法同未发育卵巢。用丁香酚 (1:10,000)将鱼麻醉后，通过尾静脉收集血液样品分离血清。然后将鱼解剖以收集性腺样品。所有样品立即用液氮冷冻，然后储存在-80℃。

血清中雌二醇和睾酮的测定采用的是电化学发光法，用青岛大学医学院附属医院(中国青岛)罗氏COBAS-6000自动电化学发光免疫分析仪测定。

4、实验结果

饲料中不同DHA和EPA含量对不同性腺发育阶段和不同性别半滑舌鳎亲鱼中性类固醇激素的影响的结果如图1(未发育成熟雌鱼雌二醇分泌量)、图2(发育成熟雌鱼雌二醇分泌量)、图3(未发育成熟雄鱼睾酮分泌量)和图4(发育成熟雄鱼睾酮分泌量)所示。

对未发育成熟的半滑舌鳎雌性亲鱼，随着饲料中DHA含量的升高或EPA含量的降低，亲鱼雌二醇分泌量呈现显著下降趋势(图1，P<0.5)。在处理组1(DHA 占总脂肪酸含量的9.91％，EPA占总脂肪酸含量的14.53％)，雌二醇的分泌量达到最高。

对发育成熟的半滑舌鳎雌性亲鱼，在处理组2(DHA占总脂肪酸含量的 11.71％，EPA占总脂肪酸含量的10.72％)亲鱼具有最高的雌二醇分泌量(图2)，且处理组2亲鱼的血清雌二醇含量显著高于处理组1(DHA占总脂肪酸含量的 9.91％，EPA占总脂肪酸含量的14.53％)。处理组3(DHA占总脂肪酸含量的15.3％， EPA占总脂肪酸含量的7.48％)亲鱼的雌二醇分泌量与处理组1及处理组2相比均没有显著性差异(P>0.5)。

对未发育成熟的半滑舌鳎雄性亲鱼，在处理组3(DHA含量占总脂肪酸含量的15.3％，EPA占总脂肪酸含量的7.48％)亲鱼具有最高的睾酮分泌量(图3)，显著高于处理组1(DHA占总脂肪酸含量的9.91％，EPA占总脂肪酸含量的 14.53％)，而处理组2(DHA占总脂肪酸含量的11.71％，EPA占总脂肪酸含量的 10.72)与其他两个处理组相比均没有显著性差异(P>0.5)。

对发育成熟的半滑舌鳎雄性亲鱼，在处理组3(DHA含量占总脂肪酸含量的15.3％，EPA占总脂肪酸含量的7.48％)亲鱼具有最高的睾酮分泌量(图4)，显著高于处理组1(DHA占总脂肪酸含量的9.91％，EPA占总脂肪酸含量的14.53％)，而处理组2(DHA占总脂肪酸含量的11.71％，EPA占总脂肪酸含量的10.72％) 与其他两个处理组相比均没有显著性差异(P>0.5)。

实施例2、不同性腺发育阶段雌雄半滑舌鳎亲鱼饲料中ARA添加量筛选实验(固定DHA和EPA含量)

1、实验设计和实验饲料配方

以鱼粉、酪蛋白和小麦粉为主要蛋白源，以大豆卵磷脂、橄榄油、三硬脂酸甘油酯等作为主要脂肪源配制5种不同ARA水平的等氮等脂实验饲料(蛋白含量55.5％、脂肪含量13％)。用ARA纯化油(ARA含量，占总脂肪酸的41％；甘油三酯形式；江苏天凯生物科技有限公司，中国南京)替代对照组中的三硬脂酸甘油酯制成5个实验组饲料，饲料中ARA占总脂肪酸的含量比例分别为0.6％， 2.0％，5.1％，10.3％和15.4％。并且向每个饲料组添加一定量的n-3LC-PUFA(含有37％DHA和21％EPA，甘油三酯形式；河北海源康健生物科技，中国沧州) 来满足实验鱼对n-3LC-PUFA的需要。饲料配方和脂肪酸组成分别如表3和表4 所示。

表3实验饲料的饲料配方和粗成分(％干物质)

¹维生素混合料(mg>12,0.1mg；维生素K₃，10mg；肌醇，800mg；泛酸，60mg；烟酸，200mg；叶酸，20mg；生物素，1.2mg；视黄醇乙酸酯，32mg；胆钙化醇，5mg；α-生育酚，120mg；次粉，13.67g。

²矿物质混合料(mg>

³防霉剂：含有50％的丙酸钙和50％的富马酸。

⁴n-3长链多不饱和脂肪酸：含有37％DHA和21％EPA(总脂肪酸)；甘油三酯的形式。

⁵ARA纯化油：含有41％ARA(总脂肪酸)；甘油三酯的形式。

⁶三硬脂酸甘油酯：沪东日化有限公司，中国嘉兴。

表4实验饲料的脂肪酸组成(％总脂肪酸)

¹SFA：饱和脂肪酸；²MUFA：单不饱和脂肪酸；³n-6PUFA：n-6系列多不饱和脂肪酸；⁴n-3PUFA：>

2、实验用鱼和养殖管理

本实验采用3龄未发育的半滑舌鳎亲鱼。正式试验前，实验鱼在水泥池(25 ㎡)中暂养7天以适应养殖环境条件。实验开始前，将实验鱼随机分到15个玻璃钢(直径：230cm，高：100cm)中，每组三个重复。每缸25尾鱼(10尾雌鱼， 15尾雄鱼)，采用室内流水养殖，水流量50L/min，每天饱食投喂两次。养殖实验在半滑舌鳎亲鱼自然产卵期7月-11月进行，养殖周期90天。在中国山东省海阳市的自然光周期和环境温度(N36°41'，E121°07')的养殖环境下进行，在实验过程中，水温范围为20～26℃；盐度，30～31；pH，7.4～8.5；溶解氧，5～7mgL^-1。每天摄食结束后半小时进行残余饲料和粪便清理。

3、样品采集及血清中雌二醇以及睾酮的分析

养殖实验结束后，每缸收集获得3尾发育成熟的雌鱼(性腺V期左右)、2 尾未发育成熟的雌鱼(性腺II-III期间)，3尾发育成熟的雄鱼(性腺V期左右) 及2尾发育未成熟的雄鱼(性腺II-III期间)用后续分析研究，每条鱼取血液及性腺样品。雌鱼的成熟以观察到自然排卵为确认标志。由于难以用表观观察的方法来精确确定未成熟雌鱼的具体发育阶段，因此，每缸取4尾具有相似成熟阶段的未成熟雌鱼，然后使用卵母细胞形态学显微镜检查方法来精确确定卵巢成熟的阶段。显微镜检查显示，大多数未成熟卵巢处于早期卵黄生成阶段，从每缸的4 个样品中选取2个具有典型早期卵黄生成特征(即集中出现球形的、嗜酸性的卵黄颗粒/小球)的样品来作为未发育成熟卵巢样品。雄鱼的成熟通过挤压释放精液来确认。未发育成熟精巢的发育鉴定及取样方法同未发育卵巢。用丁香酚 (1:10,000)将鱼麻醉后，通过尾静脉收集血液样品分离血清。然后将鱼解剖以收集性腺样品。所有样品立即用液氮冷冻，然后储存在-80℃。

血清中雌二醇和睾酮的测定采用的是电化学发光法，用青岛大学医学院附属医院(中国青岛)罗氏COBAS-6000自动电化学发光免疫分析仪测定。

4、实验结果

饲料ARA对不同发育阶段和不同性别半滑舌鳎亲鱼中性类固醇激素的影响的结果如图5(未发育成熟雌鱼雌二醇分泌量)、图6(发育成熟雌鱼雌二醇分泌量)、图7(未发育成熟雄鱼睾酮分泌量)和图8(发育成熟雄鱼睾酮分泌量) 所示。

对未发育成熟的半滑舌鳎雌鱼来说(图5)，当饲料中ARA为0.6％(％总脂肪酸)时，获得了最高的雌二醇分泌量，并且显著高于其他处理组(P<0.05)。

对发育成熟的半滑舌鳎雌鱼来说(图6)，当饲料中ARA为0.6％或2.0％(％总脂肪酸)时，相较于其他处理组获得了显著高的雌二醇分泌量(P<0.05)，并且，在2％处理组，具有最高的雌二醇分泌量。

对未发育成熟的半滑舌鳎雄鱼来说(图7)，当饲料中ARA为5.1％(％总脂肪酸)时，获得了最高的睾酮分泌量，并且显著高于除10.3％处理组外的其他处理组(P<0.05)。0.6％处理组获得了最低的睾酮分泌量，且显著低于其他处理组 (P<0.05)。

对发育成熟的半滑舌鳎雄鱼来说(图8)，当饲料中ARA为15.4％(％总脂肪酸)时，获得了最高的睾酮分泌量，并且显著高于0.6％和2.0％处理组(P<0.05)。

实施例3、本发明技术方案在半滑舌鳎亲鱼培育实验中的整体应用—对亲鱼性激素分泌及其他繁育性能的影响

1、实验设计和实验饲料配方

实验处理组：在半滑舌鳎促熟阶段的不同时期实施上述实验中筛选的不同的长链多不饱和脂肪酸供给策略。在3个月的促熟期中，前一个半月投喂上述实验中筛选的适合未发育成熟阶段的供给策略(即本发明方法描述中的第1条和第2 条)，在后一个半月中投喂上述实验中筛选的适合发育成熟阶段的供给策略(即本发明方法描述中的第3条和第4条)。具体见图9所示技术路线图。技术路线图中①、②、③和④过程分别对应实验饲料配方1、2、3和4。实验饲料配方和脂肪酸组成如表5和表6所示。

对照组：采用等蛋白等脂肪含量的商业饲料在繁育全程持续投喂(雌雄亲鱼亦无差别投喂)。

表5实验饲料的饲料配方和粗成分(％干物质)

¹维生素混合料(mg>12，0.1mg；维生素K₃，10mg；肌醇，800mg；泛酸，60mg；烟酸，200mg；叶酸，>

²矿物质混合料(mg>

³ARA纯化油：含有41％ARA(总脂肪酸)；甘油三酯的形式。

⁴EPA纯化油：含有52％的EPA(总脂肪酸)；甘油三酯的形式。

⁵DHA纯化油：含有70％的DHA(总脂肪酸)；甘油三酯的形式。

表6实验饲料的脂肪酸组成(％总脂肪酸)

¹SFA：饱和脂肪酸；²MUFA：单不饱和脂肪酸；³n-6PUFA：n-6系列多不饱和脂肪酸；⁴n-3PUFA：>

2、实验用鱼和养殖管理

同前述实验，仅养殖规模加倍。

3、样品采集及血清中雌二醇以及睾酮的分析

同前述实验。

4、产卵及孵化管理

养殖结束后，每组挑选6-10尾性腺发育良好的亲鱼，注射鱼用促黄体素释放素类似物催产，33h后人工挤卵，并测定每条亲鱼的重量和产卵质量。将卵子加入精液混匀后加海水，静置11-16min，取上浮卵布入孵化网箱。孵化期间微充气，水温控制在23±0.5℃，盐度30～33，pH值8.0～8.3，溶氧量>6mg/L，氨氮≤0.1mg/L。孵化30h后，每组取100ml上浮卵平均分配到4个圆形玻璃缸 (直径180cm、高125cm)中。培育用水为砂滤海水，水温控制在23±0.5℃，盐度30～32，pH值7.9～8.2，溶氧量>6mg/L以上，总氨氮≤0.1mg/L，初期水量为玻璃缸容积的3/5，前五日加水至满，以后采用流水培育，换水量逐渐增大，至10日龄时，换水量为50％。在仔鱼开口前开始投喂小球藻，保持水体内小球藻密度大于3×10⁸L^-1，3日龄开始投喂轮虫，每次投喂量为5～6个/mL。

5、卵子及仔鱼质量评价

每条产卵亲鱼取1mL卵于培养皿，加海水后测定浮卵率，其中质量好的卵子会上浮，质量较差或死卵会沉在培养皿底部，每条亲鱼重复取3次卵子；受精2h后，从每个孵化网箱三个不同位置共取100粒受精卵在显微镜下观察并拍照记录，统计受精率，从上述100粒卵子中随机挑选20粒卵子测量卵径，挑选25个油球测量油球直径，重复3次；受精30h后，从各实验组孵化网箱中取1ml受精卵布入1000ml烧杯中，每组3个重复，待仔鱼全部孵出后，统计孵化率，并统计7日龄时仔鱼体长。

6、实验结果

与未使用本发明方法的对照组相比，使用本方法的处理组性腺发育前期(投喂1.5月取样)和后期(投喂3月取样)，雌鱼雌二醇的分泌量平均分别提高110％ (0.823nmol/L-1.728nmol/L)及60％(10.128nmol/L-16.205nmol/L)；在性腺发育前期和后期，雄鱼睾酮的分泌量平均分别提高136％(0.114nmol/L-0.270nmol/L) 及65％(0.265nmol/L-0.437nmol/L)。

与未使用本发明方法的对照组相比，使用本方法的处理组雌鱼平均产卵量提高47％(1.65×10⁵粒/kg-2.43×10⁵粒/kg)，平均浮卵率提高32％(70.1％-92.5％)，平均精液浓度提高63％(2.2×10⁹/ml-3.6×10⁹/ml)。

与未使用本发明方法的对照组相比，使用本方法的处理组平均受精率提高55％(55.23％-85.6％)，平均孵化率提高43％(61％-87.2％)。

与未使用本发明方法的对照组相比，使用本方法的处理组7日龄仔鱼体长提高41％(4.72mm–6.65mm)。