一株用于脱色和絮凝的海洋细菌及其脱色絮凝剂制法

摘要

从菲律宾蛤仔黏附淤泥中分离获得一株需氧活性海洋细菌JP，鉴定为Pseudoalteromonas undina，即水蛹交替假单胞菌。经种子液培养、扩大发酵培养、胞外多糖提取和精制得到脱色絮凝剂。有益效果为：本发明制备的脱色絮凝剂脱色效果很好，对高岭土的絮凝率值达到90％以上；对高浓度废水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝、墨水蓝、孔雀石绿、结晶紫的脱色率达92％以上、99％以上和98％以上；絮凝剂性质稳定，制备步骤简单，原料成本低廉，经济效益高，可大规模生产。

说明书

技术领域

本发明涉及净水技术领域，具体是一株用于脱色和絮凝的海洋细菌及其脱色絮凝剂制法。

背景技术

絮凝技术被广泛应用在给水、废水絮凝净化、发酵工业、固液分离等方面，絮凝效果取决于选取的絮凝剂的种类。目前，用于水处理行业的絮凝剂主要有两大类：以铝系、铁系及其聚合物为代表的无机絮凝剂和以PAM及其衍生物为代表的有机高分子絮凝剂。它们凭借其在使用过程中絮凝效果好且成本低得到广泛的应用，但是它们对环境存在不安全性已引起人们足够的重视。铝系絮凝剂中铝离子易引起老年性痴呆症；铁系絮凝剂中铁离子对金属有腐蚀作用，容易引起处理后水中带有颜色，增加污泥处理负荷；PAM的单体有很强的神经毒性，有很强的致癌性。因此，目前众多学者、专家开发研究被称为第三代絮凝剂的新型絮凝剂---微生物絮凝剂。微生物絮凝剂是一类由微生物产生的具有絮凝活性的高分子物质，具有生物分解性和环境安全性，主要由蛋白质、多糖、纤维素、脂类和 DNA 等组成。

微生物絮凝剂生产开发中存在絮凝剂产生菌的获得的难题：目前应用的絮凝剂微生物分别属于细菌、放线菌、杆菌和酵母菌等，絮凝菌不同，产生的絮凝剂的分子结构也不同。因此，获得能高效产生絮凝剂的菌株是微生物絮凝剂开发研究的中心。

现有技术如授权公告号为CN 101580550 B的中国发明专利，公开了一株好氧罗氏菌属菌株代谢产物胞外多糖、制法和用途。从中国渤海海域野生菲律宾蛤仔黏附污泥中分离获得的好氧菌株ZHT4-13、鉴定为罗氏菌属(Ruthia sp.)。经种子培养、扩大培养，其发酵液经乙醇沉淀离心分离得到细胞外多糖MBF4-13。经测定出该细胞外多糖MBF4-13 具有较高的絮凝活性，对高岭土的FR 值达到80％以上；对六价铬离子去除率达69.3％；对高浓度废水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝、墨水蓝、孔雀石绿、结晶紫的脱色率达86.11％、99.49％和97.84％；对活性污泥的性能及结构也有明显改善作用。现在能高效产生絮凝剂的菌株种类较少，还需要继续分离筛选出新的菌种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单，制备的脱色絮凝剂脱色率高，性能稳定，絮凝效果好的脱色絮凝剂制法。

本发明针对背景技术提到的问题，采用的技术方案为：一株需氧活性海洋细菌JP是从菲律宾蛤仔黏附淤泥中分离获得，该菌株合适的生长盐度范围为1%-15%。依据《Bergy’s manual of systematical bacteriology》(Brenner, D.J., Krieg, N.R., Staley,J.T. &Garrity, G.M. (eds., 2005),2nd ed., vol. 2, Springer-Verlag, New York,NY.)，鉴定为Pseudoalteromonas>，即交替假单胞菌，具体为水蛹交替假单胞菌（Pseudoalteromonas>）。已于2016年8月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（其简称为CGMCC），保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No. 12914。

海洋菌株JP的16S rDNA全基因（1279 bp）已向美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702268。其全序列如下：

AATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAACCTCGGTTCTGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACCTGCGAAGGTAAGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA CACCGCC。

一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的筛选方法为：采集新鲜菲律宾蛤仔，放入无菌水中吐泥，取1ml泥，采用梯度稀释倒平板分离和划线纯化，经活性测试筛选出具有高絮凝和脱色活性的菌株JP。

一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的脱色絮凝剂制法，包括以下步骤：

种子液培养：将保藏号为CGMCC No. 12914的海洋细菌接种于斜面培养基，恒温培养后，培养温度为22-27℃，培养时间为24-72h。加入无菌水，培养基与无菌水体积比为1:0.7-1.3，振荡制得种子液。上述种子液的培养可将菌种从保藏状态恢复到活力旺盛的生长繁殖状态，并且能得到数量充足的菌种；

扩大发酵培养：在每100ml液体发酵培养基接入0.2-0.5ml种子液，恒温摇床培养。发酵温度为22-27℃，摇床速率为120-140r/min，发酵培养时间为3-4d。在发酵培养期间，菌种利用培养基中的营养成分进行旺盛的新陈代谢，产生大量的代谢产物---胞外多糖；

胞外多糖提取：将发酵完成的菌液离心，取上清液，在上清液中加入乙醇，乙醇体积为上清液体积的3-6倍。在2-5℃下静置10-18h，离心取沉淀，真空干燥得胞外多糖粗制品。亲水的多糖的水化层被乙醇破坏，多糖在水中的溶解度大幅下降，以沉淀形式与其他成分分离，同时多糖的活性不会被破坏；

精制：在胞外多糖粗制品中加水，粗制品体积为水的1-2倍。振荡后加入乙醇，乙醇体积为水溶液体积的3-6倍，乙醇温度为2-5℃。静置后离心取沉淀，真空干燥得到海洋细菌脱色絮凝剂。

作为优选，斜面培养基成分及其浓度为：葡萄糖10-25g/L、尿素0.43-0.52g/L、硫酸铵0.18-0.24g/L、酵母膏0.4-0.6g/L、磷酸氢二钾1.25-5 g/L、磷酸二氢钾0.5-2g/L、琼脂12-16g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.2-7.4，110-120℃高压灭菌26-33min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁2. 0 g/L、硫酸镁3.2 g/L、氯化钙1.2 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.7 g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.06 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.013 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0013 g/L、蒸馏水余量。斜面培养基去除琼脂即为液体发酵培养基。上述培养基不仅能提供适合本发明海洋细菌适宜的环境，还能提供菌种生长繁殖所需的碳源、氮源及生长因子，菌种的繁殖速度快，并且能诱导菌种分泌产生大量的胞外多糖，降低产品成本。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明从菲律宾蛤仔黏附淤泥中分离纯化并筛选出一株用于脱色和絮凝的海洋细菌，鉴定为交替假单胞菌（Pseudoalteromonas>sp），并提取胞外多糖制得脱色絮凝剂。本发明制备的脱色絮凝剂脱色效果很好，对高岭土的絮凝率达到90％以上；对高浓度废水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝、墨水蓝、孔雀石绿、结晶紫的脱色率达92％以上、99％以上和98％以上；絮凝剂性质稳定，制备步骤简单，原料成本低廉，经济效益高，可大规模生产。

具体实施例

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一株用于脱色和絮凝的海洋细菌，鉴定为交替假单胞菌（Pseudoalteromonas>），具体为水蛹交替假单胞菌（Pseudoalteromonas>），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 12914。

一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的筛选方法为：采集新鲜菲律宾蛤仔，放入无菌水中吐泥，取1ml泥，采用梯度稀释倒平板分离和划线纯化，经活性测试筛选出具有高絮凝和脱色活性的菌株JP。

一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的脱色絮凝剂制法，包括以下步骤：

1）种子液培养：将保藏号为CGMCC No. 12914的海洋细菌接种于斜面培养基，于25℃恒温培养36h。加入等体积无菌水，振荡制得种子液。上述种子液的培养可将菌种从保藏状态恢复到活力旺盛的生长繁殖状态，并且能得到数量充足的菌种；

2）扩大发酵培养：在每100ml液体发酵培养基接入0.4ml种子液，于25℃恒温摇床培养3.5d，摇床速率为130r/min。在发酵培养期间，菌种利用培养基中的营养成分进行旺盛的新陈代谢，产生大量的代谢产物---胞外多糖；

3）胞外多糖提取：将发酵完成的菌液离心，取上清液，在上清液中加入5倍体积的乙醇。在4℃下静置16h，离心取沉淀，真空干燥得胞外多糖粗制品。亲水的多糖的水化层被乙醇破坏，多糖在水中的溶解度大幅下降，以沉淀形式与其他成分分离，同时多糖的活性不会被破坏；

4）精制：在胞外多糖粗制品中加等体积水，振荡溶解完全后加入5倍体积乙醇，乙醇温度为4℃。静置后离心取沉淀，真空干燥得到海洋细菌脱色絮凝剂。

斜面培养基成分及其浓度为：培养基成分及其浓度为葡萄糖18g/L、尿素0.5g/L、硫酸铵0.2g/L、酵母膏0.5g/L、磷酸氢二钾3.6g/L、磷酸二氢钾1.6g/L、琼脂15g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.3，115℃高压灭菌30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁2. 0 g/L、硫酸镁3.2 g/L、氯化钙1.2 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.7g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.06 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝0.013 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0013 g/L、蒸馏水余量。斜面培养基去除琼脂即为液体发酵培养基。上述培养基不仅能提供适合本发明海洋细菌适宜的环境，还能提供菌种生长繁殖所需的碳源、氮源及生长因子，菌种的繁殖速度快，并且能诱导菌种分泌产生大量的胞外多糖，降低产品成本。

实施例2：

一株用于脱色和絮凝的海洋细菌，鉴定为交替假单胞菌（Pseudoalteromonas>），具体为水蛹交替假单胞菌（Pseudoalteromonas>），于2016年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 12914。

一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的筛选方法为：采集新鲜菲律宾蛤仔，放入无菌水中吐泥，取1ml泥，采用梯度稀释倒平板分离和划线纯化，经活性测试筛选出具有高絮凝和脱色活性的菌株JP。

一株用于脱色和絮凝的海洋细菌的脱色絮凝剂制法，包括以下步骤：

1）种子液培养：将保藏号为CGMCC No. 12914的海洋细菌接种于斜面培养基，于25℃恒温培养36h。加入1.2倍体积无菌水，振荡制得种子液。斜面培养基成分及其浓度为：葡萄糖20g/L、尿素0.5g/L、硫酸铵0.2g/L、酵母膏0.45g/L、磷酸氢二钾2.8g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、琼脂14g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.3，115℃高压灭菌30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁2. 0 g/L、硫酸镁3.2 g/L、氯化钙1.2 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.7 g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.06 g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002g/L、六氯化二铝 0.013 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂 0.0013 g/L、蒸馏水余量；

2）扩大发酵培养：在每100ml液体发酵培养基接入0.4ml种子液，于25℃恒温摇床培养3d，摇床速率为130r/min。液体发酵培养基葡萄糖20g/L、尿素0.5g/L、硫酸铵0.2g/L、酵母膏0.45g/L、磷酸氢二钾2.8g/L、磷酸二氢钾1.3g/L和余量陈化海水或人工海水；调节pH为7.3，115℃高压灭菌30min。其中，人工海水配方为：氯化钠25.0 g/L、氯化镁2. 0 g/L、硫酸镁3.2 g/L、氯化钙1.2 g/L、碳酸氢钠0.2 g/L、氯化钾0.7 g/L、溴化钠0.06 g/L、硼酸0.06g/L、硅酸钠0.0024 g/L、磷酸0.002 g/L、六氯化二铝 0.013 g/L、氨水 0.002 g/L、硝酸锂0.0013 g/L、蒸馏水余量；

3）胞外多糖提取：将发酵完成的菌液离心，取上清液，在上清液中加入5.3倍体积的乙醇。在4℃下静置14h，离心取沉淀，真空干燥得胞外多糖粗制品；

4）精制：在胞外多糖粗制品中加1.2倍体积水，振荡溶解完全后加入5.3倍体积乙醇，乙醇温度为4℃。静置后离心取沉淀，真空干燥得到海洋细菌脱色絮凝剂。

实施例3：絮凝活性的测定

采用对高岭土悬浊液的絮凝活性测试法 (R.Kurane，K.Takeda，T.Suzuki.Screeningand Characteristeristics of Microbial Flocculants.Agric.Biol.Chem.1986 ：2301-2307)取5g/L的高岭土悬浊液93ml，加入5ml 1％(m/v)CaCl₂做助凝剂，加入>

实施例4：脱色活性测定

取10ml亚甲基蓝和孔雀石绿(10mg/L)以及10mL结晶紫(20mg/L)于大试管中，加入 1ml浓度为 2g/L 的实施例2样品，漩涡振荡 1min，调节溶液 pH 值为9，静置 30min 后取水平面下 1cm 处溶液，测定相应染料在最大吸收波长处的吸光度，计算脱色率，DR(％) ＝ (A-A 0)/A×100％。则海洋细菌脱色絮凝剂对亚甲基蓝、孔雀石绿和结晶紫的脱色率分别为92.13％、99.35％和 98.44％。

实施例5：活性污泥性能改善实验

在新鲜活性污泥中加入实施例2样品，投加量为 2g/L，搅拌均匀，适量曝气，2天后测SV 30 、SVI，并做活性污泥压片显微观察污泥中微生物种类。实验结果表明 SV 30 、SVI分别由原活性污泥的390、80.42降至340、74.13，说明活性污泥沉降性能有了一定的提高。显微观察表明絮凝培养后菌胶团结构变得更紧密、丝状菌相对减少、出现了能显示良好水质的指示生物-轮虫等原生动物，表明该微生物絮凝剂的投加对活性污泥起到了良好的改善性能及结构的作用。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大学

<120> 一株用于脱色和絮凝的海洋细菌及其脱色絮凝剂制法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1279

<212> DNA

<213> 海洋菌株Pseudoalteromonas undina JP

<400> 1

aatgcttggg aacatgcctt gaggtggggg acaacagttg gaaacgactg ctaataccgc 60

ataatgtcta cggaccaaag ggggcttcgg ctctcgcctt tagattggcc caagtgggat 120

tagctagttg gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgatc cctagctggt ttgagaggat 180

gatcagccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 240

tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggccttcgg 300

gttgtaaagc actttcagtc aggaggaaag gttagtagtt aatacctgct agctgtgacg 360

ttactgacag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg 420

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tgaaagcccc gggctcaacc tgggaactgc atttcgaact ggcaaactag agtgtgatag 540

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ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtct actagaagct cggaacctcg 720

gttctgtttt tcaaagctaa cgcattaagt agaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt 780

aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat 840

gcaacgcgaa gaaccttacc tacacttgac atacagagaa cttaccagag atggtttggt 900

gccttcggga actctgatac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgagatgt 960

tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc tatccttagt tgctagcagg taatgctgag 1020

aactctaagg agactgccgg tgataaaccg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca 1080

tggcccttac gtgtagggct acacacgtgc tacaatggcg catacagagt gctgcgaacc 1140

tgcgaaggta agcgaatcac ttaaagtgcg tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga 1200

ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc gtatcagaat gacgcggtga atacgttccc 1260

gggccttgta cacaccgcc 1279

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