一种果蝇转基因表达水平的调控方法

摘要

本发明涉及一种果蝇转基因表达水平的调控方法，属于生物技术领域。本发明主要解决现有Gal4/UAS对靶基因表达水平操控不够灵活的问题。技术方案是：一种果蝇转基因表达水平的调控方法，包括以下步骤：1)首先将靶基因的过表达转基因序列和RNAi转基因序列进行重组；2)用同一Gal4驱动该品系；3)将子代在16‑18℃低温下培养，控制靶基因温和地过表达；4)在29‑30℃高温下进行培养，抑制靶基因表达；5)低温(16‑18℃)培养后转入高温(29‑30℃)培养，使靶基因的过表达，再抑制表达；6)高温(29‑30℃)培养后转入低温(16‑18℃)，控制靶基因先抑制表达，再转为过表达。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种果蝇转基因表达水平的调控方法。

背景技术

在经典模式生物黑腹果蝇Drosophila melanogaster中，Gal4/UAS系统是目前最常用的转基因表达工具。Gal4(Galactose 4)是酵母半乳糖/蜜二糖代谢系统中的转录激活因子，可结合DNA序列UAS(upstream activating sequence)的特异性位点并激活其下游基因的表达(Johnston and Hopper,1982；Giniger et al.,1985)。Fischer等(1988)首次发现果蝇中转基因Gal4可特异性激活UAS转基因的表达。Brand和Perrimon(1993)基于转基因果蝇技术，选用特定启动子(或增强子)驱动的Gal4，结合UAS序列后可驱动下游靶基因的异位过表达，从而实现对转基因表达的操控。根据RNAi原理，UAS下游设计靶基因特异性序列，可实现对内源基因表达的特异性干扰(Dietzl G,et al.,2007)。

然而在GAL4/UAS系统中，过度升高或干扰基因表达水平往往引起细胞凋亡和早期致死等作用，影响对基因功能的研究。果蝇器官中，一些重要基因产物如信号分子以浓度梯度方式扩散(例如Dpp和Wg)，不同浓度能激活不同的下游靶基因，如Wg在高浓度时激活Senseless(Sens)，在中浓度时激活Distal-less(Dll)，在低浓度时激活Vestigial(Vg)，从而协调翅芽的整体发育(Couso et al.,1994；Cook et al.,2004；欧俊等,2013)。因此，在研究基因功能时，需要按需操控转基因的表达强度，否则不能全面揭示基因的功能机理。此外，不同细胞群对同一种基因信号改变的应答效应也不同，如DSNX3突变后，Wg浓度在分泌细胞中升高，在接收细胞中下降(Zhang et al.,2011)。因此转基因表达量的灵活控制在信号通路调控研究中极其重要。

目前关于转基因表达水平调控的研究甚少。前人研究发现，Gal4驱动UAS转基因过表达的能力几乎是确定的，要调节基因的表达水平，需要重新构建品系，而构建新的品系非常不便(Pfeiffer et al.,2010)。但是在较高温度(29℃)比低温(22℃)RNA干扰的效率更高该规律同样适用于果蝇Gal4/UAS系统中对靶基因的干扰研究(Fortier E and Belote JM,2000)。然而以上两种现象均未进行系统地研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种果蝇转基因表达水平的调控方法，解决现有重组品系转基因表达水平调控研究不系统、无法确定温度转变对重组品系转基因表达水平的影响的技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种果蝇转基因表达水平的调控方法，其包括以下步骤：

1)假设靶基因为X，首先将携带UAS-X转基因的过表达果蝇品系和携带有另一个转基因UAS-X-RNAi的RNAi品系进行重组，得到重组果蝇品系中包含UAS-X和UAS-X-RNAi转基因；

2)该重组品系与另一个Gal4品系杂交，用Gal4驱动该重组品系的UAS-X和UAS-X-RNAi转基因表达，使得靶基因X过表达和RNAi介导的表达抑制得以同时进行；

3)将步骤2)中Gal4驱动重组品系后的杂交子代分别放置在16-18℃低温下、25℃和29-30℃高温下进行培养，长至某一特定年龄时，检测其靶基因表达水平；16-18℃低温下靶基因X得到温和的过表达，29-30℃高温下靶基因表达受到抑制；

4)对步骤2)中Gal4驱动重组品系后的杂交子代进行16-18℃低温培养，长至一定年龄时，检测靶基因表达水平，同期其它子代转移至29-30℃高温培养，继续生长至一定年龄时，检测靶基因表达水平；在发育前期靶基因过表达，发育后期靶基因的表达受到抑制；

5)对步骤2)中Gal4驱动重组品系后的杂交子代进行29-30℃高温培养，长至一定年龄时，检测靶基因表达水平，同期其它子代转移至16-18℃低温培养，继续生长至一定年龄时，检测靶基因表达水平；在发育前期靶基因的表达受到抑制，发育后期靶基因过表达。

进一步，所述果蝇转基因表达水平的调控方法适用于其它Gal4/UAS的系统模式。

本发明将转基因的过表达序列和RNAi序列重组后，检测不同温度下转基因表达的特征；然后检测转基因的过表达序列和RNAi序列重组后，经过温度转变在不同发育时期目标转基因表达的转变；通过调节培养温度，在某一特定发育时期，将基因表达控制在特定水平，之后又调节至另一水平，实现深入基因的发育过程中的功能研究，提升基因研究的层次。

与现有技术相比，本发明具有操作简单、可实现转基因表达量的灵活控制的优点。

附图说明

图1是果蝇三龄幼虫wg内源表达部位和dpp-Gal4驱动UAS-GFP表达部位检测，其中：A：野生型果蝇中wg抗体染色显示内源wg在翅囊的轮廓以及D/V边界表达；B：dpp-Gal4驱动UAS-GFP转基因在前隔间靠近A/P边界处；

图2是果蝇三龄幼虫翅芽在不同温度下dpp-Gal4驱动UAS-wg后wg表达水平变化，其中：A：18℃；B：25℃；C：30℃；

图3是果蝇三龄幼虫翅芽在不同温度下dpp-Gal4驱动UAS-wg-RNAi后wg表达水平变化，其中：A：18℃；B：25℃；C：30℃；

图4是果蝇三龄幼虫翅芽在不同温度下dpp-Gal4同时驱动UAS-wg和UAS-wg-RNAi后wg表达水平变化，其中：A：18℃；B：25℃；C：30℃；

图5是果蝇翅芽不同发育时期温度转变后dpp-Gal4同时驱动UAS-wg和UAS-wg-RNAi后wg表达水平变化，其中：A：18℃培养时三龄早期翅芽；B：从18℃转移至30℃后三龄末期翅芽；C：30℃培养时三龄早期翅芽；D：从30℃转移至18℃后三龄末期翅芽。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1

一种果蝇转基因表达水平的调控方法，其包括以下步骤：

1)假设靶基因为wg，首先将携带UAS-wg转基因的过表达果蝇品系和携带有另一个转基因UAS-wg-RNAi的RNAi品系进行重组，得到重组果蝇品系中包含UAS-wg和UAS-wg-RNAi转基因；

2)该重组品系与另一个dpp-Gal4品系杂交，用dpp-Gal4驱动该重组品系的UAS-wg和UAS-wg-RNAi转基因表达，使得靶基因wg过表达和RNAi介导的表达抑制得以同时进行；

3)将步骤2)中dpp-Gal4驱动重组品系后的杂交子代分别放置在18℃低温下、25℃和30℃高温下进行培养，长至某一特定年龄时，检测其靶基因表达水平；18℃低温下靶基因wg得到温和的过表达，30℃高温下靶基因表达受到抑制；

4)对步骤2)中dpp-Gal4驱动重组品系后的杂交子代进行18℃低温培养，长至一定年龄时，检测靶基因表达水平，同期其它子代转移至30℃高温培养，继续生长至一定年龄时，检测靶基因表达水平；在发育前期靶基因过表达，发育后期靶基因的表达受到抑制；

5)对步骤2)中dpp-Gal4驱动重组品系后的杂交子代进行30℃高温培养，长至一定年龄时，检测靶基因表达水平，同期其它子代转移至18℃低温培养，继续生长至一定年龄时，检测靶基因表达水平；在发育前期靶基因的表达受到抑制，发育后期靶基因过表达。

如图1至图3所示，dpp-Gal4与UAS-wg杂交后子代三龄幼虫在不同温度下Wg抗体染色后显示wg表达水平无明显差异；dpp-Gal4与UAS-wg-RNAi杂交后子代三龄幼虫在wg抗体染色后显示wg表达水平随温度升高而降低。

如图4所示，dpp-Gal4与重组品系UAS-wg-RNAi；UAS-wg杂交后子代三龄幼虫在不同温度下Wg抗体染色后显示wg表达水平在18℃过表达，且表达水平比图1中明显降低；25℃时，wg过表达水平较18℃低，但内源wg表达正常；30℃时，dpp区域内wg和内源wg表达均明显受抑制。

如图5所示，dpp-Gal4与重组品系UAS-wg-RNAi；UAS-wg杂交后子代翅芽，18℃处理时三龄幼虫早期wg过表达，转到30℃长至末期后，wg表达被抑制；反之30℃处理时三龄幼虫早期wg表达被抑制，转到18℃长至末期后，wg过表达。

实施例2

一种果蝇转基因表达水平的调控方法，其包括以下步骤：

1)假设靶基因为omb，首先将携带UAS-omb转基因的过表达果蝇品系和携带有另一个转基因UAS-omb-RNAi的RNAi品系进行重组，得到重组果蝇品系中包含UAS-omb和UAS-omb-RNAi转基因；

2)该重组品系与另一个dpp-Gal4品系杂交，用dpp-Gal4驱动该重组品系的UAS-omb和UAS-omb-RNAi转基因表达，使得靶基因omb过表达和RNAi介导的表达抑制得以同时进行；

3)将步骤2)中dpp-Gal4驱动重组品系后的杂交子代分别放置在16℃低温下、25℃和29℃高温下进行培养，长至某一特定年龄时，检测其靶基因表达水平；16℃低温下靶基因omb得到温和的过表达，29℃高温下靶基因表达受到抑制；

4)对步骤2)中dpp-Gal4驱动重组品系后的杂交子代进行16℃低温培养，长至一定年龄时，检测靶基因表达水平，同期其它子代转移至29℃高温培养，继续生长至一定年龄时，检测靶基因表达水平；在发育前期靶基因过表达，发育后期靶基因的表达受到抑制；

5)对步骤2)中dpp-Gal4驱动重组品系后的杂交子代进行29℃高温培养，长至一定年龄时，检测靶基因表达水平，同期其它子代转移至16℃低温培养，继续生长至一定年龄时，检测靶基因表达水平；在发育前期靶基因的表达受到抑制，发育后期靶基因过表达。

本发明能够以多种形式具体实施而不脱离发明的精神或实质，所以应当理解，上述实施例不限于前述的细节，而应在权利要求所限定的范围内广泛地解释，因此落入权利要求或其等效范围内的变化和改型都应为权利要求所涵盖。