降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂及制备方法

摘要

本发明涉及降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂及制备方法。降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂包括有效成分，有效成分包括凝结芽孢杆菌及硅酸钾，凝结芽孢杆菌与硅酸钾的质量比为7:(1～5)，凝结芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.13961。降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括(1)菌种活化；(2)种子液制备；(3)发酵培养；(4)测定发酵液中的菌体数量，待发酵液中芽孢含量≥1000亿/克时，停止发酵培养，然后将得到的发酵液进行喷雾干燥得到菌粉；(5)将干燥后得到的菌粉与硅酸钾按质量比例7:(1～5)进行混合，即得到降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂。

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物领域，涉及一种降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂及制备方法。

背景技术

近年来，我国重金属污染愈加严重，对农业、人体健康带来重大危害。重金属污染指由重金属或其化合物造成的环境污染。主要由采矿、废气排放、污水灌溉和使用重金属超标制品等人为因素所致。因人类活动导致环境中的重金属含量增加，超出正常范围，直接危害人体健康，并导致环境质量恶化。

重金属污染包括镉污染。镉不是人体的必要元素。镉的毒性很大，可在人体内积蓄，主要积蓄在肾脏，引起泌尿系统的功能变化；镉主要来源有电镀、采矿、冶炼、燃料、电池和化学工业等排放的废水；废旧电池中镉含量较高、也存在于水果和蔬菜中，尤其是蘑菇，在奶制品和谷物中也有少量存在。

镉能够取代骨中钙，使骨骼严重软化，骨头寸断，会引起胃脏功能失调，干扰人体和生物体内锌的酶系统，导致高血压症上升。易受害的人群是矿业工作者、免疫力低下人群。水中含镉0.1mg/L时，可轻度抑制地面水的自净作用，镉对白鲢鱼的安全浓度为0.014mg/L，用含镉0.04Mg/L的水进行灌溉时，土壤和稻米受到明显污染，农灌水中含镉0.007mg/L时，即可造成污染。

正常人血液中的镉浓度小于5微克/升，尿中小于1微克/升。镉能够干扰骨中钙，如果长期摄入微量镉，使骨骼严重软化，骨头寸断，引起骨痛病，其还会引起胃脏功能失调，并干扰人体和生物体内锌的酶系统，导致高血压症上升。

降解后的硅酸盐可以有效钝化土壤中重金属，减少植物中的重金属含量。凝结芽孢杆菌可以降解土壤和肥料中的硅酸盐，提高土壤肥力，促进植物生长，改善土壤微生态环境。

发明内容

发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明的第一个目的在于公开降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂。本发明的第二个目的在于公开降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂的制备方法。

技术方案：降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，包括有效成分，

所述有效成分包括凝结芽孢杆菌及硅酸钾，凝结芽孢杆菌与硅酸钾的质量比为7:(1～5)，

凝结芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.13961。

进一步地，菌剂的凝结芽孢杆菌的孢子含量为≥100亿/克。

降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤:

(1)菌种活化

将保藏号为CGMCC NO.13961的凝结芽孢杆菌的菌株在LB液体培养基中活化8～16h，备用；

(2)种子液制备

将步骤1)活化后的菌株，在26～37℃下震荡12～18h培养，得到种子液；

(3)发酵培养

(31)配置液态的发酵培养基，控制其初始pH值为6.5～7.5，然后高温灭菌；

(32)待经过高温灭菌的发酵培养基的温度降到30℃以下时，接入步骤(2)得到的种子液，再在温度为26～37℃，通气量150～200L/h，搅拌速度为150～230rpm的条件下发酵培养22～36h得到发酵液；

(4)测定发酵液中的菌体数量，待发酵液中芽孢含量≥1000亿/克时，停止发酵培养，然后将得到的发酵液进行喷雾干燥得到菌粉；

(5)将干燥后得到的菌粉与硅酸钾按质量比例7:(1～5)进行混合，即得到降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂。

进一步地，步骤(31)的液态的发酵培养基的组成为:酵母膏5～10g/L、可溶性淀粉8～16g/L、葡萄糖4～8g/L、黄豆饼粉8～16g/L、牛肉膏6～12g/L、玉米粉8～16g/L，其余为水。

更进一步地，步骤(31)的发酵培养基中还包括少量的消泡剂。

更更进一步地，所述消泡剂为植物油，植物油的含量为0.5～2.5wt％。

更更进一步地，所述消泡剂为二甲基硅油，二甲基硅油含量为0.2～1.2wt％。

上述降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，用于降解硅酸盐。

上述降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，用于钝化重金属，促进作物生长，改善土壤微生态环境。

有益效果：本发明公开的降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂及制备方法具有以下有益效果：

1、可以有效的钝化土壤中重金属，减少植物中的重金属含量；

2、可以降解土壤和肥料中的硅酸盐，提高土壤肥力，促进植物生长，改善土壤微生态环境。

具体实施方式：

下面对本发明的具体实施方式详细说明。

具体实施例1

1、筛选分离菌株

硅酸盐筛选培养基：蔗糖5克，FeCl₃(1％)1mL，Na₂HPO₄>2O>

将山东青岛大棚采集的土壤稀释10^-5，均匀涂布在筛选培养基上分离培养，挑选大型、透明、凸起很高、十分粘着而有弹性的菌落。

2、鉴定菌株

利用16s序列进行分子鉴定，鉴定为凝结芽孢杆菌；

3、菌株保藏

我们将筛选分离得到的凝结芽孢杆菌于2017年03月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.13961；

4、菌种活化

保藏号为CGMCC NO.13961的凝结芽孢杆菌菌株在LB液体培养基中活化12h，备用；

5、种子液制备

活化后的菌株，在26～37℃下震荡12～18h，培养后所得种子液；

6、发酵培养

配置液态的发酵培养基，初始pH值为6.5～7.5之间，高温灭菌，然后待温度降到30℃以下接入上述的种子液，再在温度为26～37℃，通气量150～200L/h，搅拌速度为150～230rpm的条件下发酵培养22～36h；

液态的发酵培养基的组成为:酵母膏5～10g/L、可溶性淀粉8～16g/L、葡萄糖4～8g/L、黄豆饼粉8～16g/L、牛肉膏6～12g/L、玉米粉8～16g/L，其余为水；发酵培养基中还加入植物油或者二甲基硅油作为消泡剂，该植物油的重量百分比为0.5～2.5％；该二甲基硅油的重量百分比为0.2～1.2％；

7、测定发酵液中菌体数量，待发酵液中芽孢含量达到≥1000亿/克时停止发酵培养，将得到的发酵液进行喷雾干燥；

8、干燥后得到的菌粉按照凝结芽孢杆菌：硅酸钾＝7:(1～5)进行混合。得到孢子含量≥100亿/克的菌剂。

验证试验

本试验采用盆栽方法，供试土壤为受镉污染的青岛小麦土，基础理化性质为全氮3.43g/kg，有机质59.4g/kg，碱解氮206mg/kg，有效磷28.7mg/kg，速效钾121mg/kg，pH6.3。

实验设4个处理，分别为不做处理的CK，只加入硅酸钾的处理1，只加入凝结芽孢杆菌的处理2和加入菌剂的处理3。每个处理设4个重复；

分别将土放入盆中，选择麦粒大小一致的，每盆栽种一棵；栽种后，CK每盆用无菌水300mL浇灌，处理1每盆将100g硅酸钾溶于200mL无菌水中浇灌，处理2每盆将100克实例1喷雾干燥得到的菌粉溶于200mL无菌水中浇灌，处理3每盆将100g实例1制得的菌剂溶于200mL无菌水中浇灌，以后都用无菌水浇灌，小麦成熟后测量株高和镉含量。

处理平均株高(cm)镉含量(mg/kg)CK620.29处理1730.18处理2850.22处理3910.07

由此可见，本发明的菌剂可以有效钝化重金属，促进植物生长。

具体实施例2

降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，包括有效成分，

有效成分包括凝结芽孢杆菌及硅酸钾，凝结芽孢杆菌与硅酸钾的质量比为7:1，

凝结芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.13961。

进一步地，菌剂的凝结芽孢杆菌的孢子含量为≥100亿/克。

降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤:

(1)菌种活化

将保藏号为CGMCC NO.13961的凝结芽孢杆菌的菌株在LB液体培养基中活化8h，备用；

(2)种子液制备

将步骤1)活化后的菌株，在26℃下震荡18h培养，得到种子液；

(3)发酵培养

(31)配置液态的发酵培养基，控制其初始pH值为6.5，然后高温灭菌；

(32)待经过高温灭菌的发酵培养基的温度降到30℃以下时，接入步骤(2)得到的种子液，再在温度为26℃，通气量200L/h，搅拌速度为150rpm的条件下发酵培养36h得到发酵液；

(4)测定发酵液中的菌体数量，待发酵液中芽孢含量≥1000亿/克时，停止发酵培养，然后将得到的发酵液进行喷雾干燥得到菌粉；

(5)将干燥后得到的菌粉与硅酸钾按质量比例7:1进行混合，即得到降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂。

进一步地，步骤(31)液态的发酵培养基的组成为:酵母膏5g/L、可溶性淀粉8g/L、葡萄糖4g/L、黄豆饼粉8g/L、牛肉膏6g/L、玉米粉8g/L，其余为水。

更进一步地，步骤(31)的发酵培养基中还包括少量的消泡剂。

更更进一步地，消泡剂为植物油，植物油的含量为0.5wt％。

更更进一步地，消泡剂为二甲基硅油，二甲基硅油含量为0.2wt％。

上述降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，用于降解硅酸盐。

上述降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，用于钝化重金属，促进作物生长，改善土壤微生态环境。

具体实施例3

降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，包括有效成分，

有效成分包括凝结芽孢杆菌及硅酸钾，凝结芽孢杆菌与硅酸钾的质量比为7:5，

凝结芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.13961。

进一步地，菌剂的凝结芽孢杆菌的孢子含量为≥100亿/克。

降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤:

(1)菌种活化

将保藏号为CGMCC NO.13961的凝结芽孢杆菌的菌株在LB液体培养基中活化16h，备用；

(2)种子液制备

将步骤1)活化后的菌株，在37℃下震荡12h培养，得到种子液；

(3)发酵培养

(31)配置液态的发酵培养基，控制其初始pH值为7.5，然后高温灭菌；

(32)待经过高温灭菌的发酵培养基的温度降到30℃以下时，接入步骤(2)得到的种子液，再在温度为37℃，通气量150L/h，搅拌速度为230rpm的条件下发酵培养22h得到发酵液；

(4)测定发酵液中的菌体数量，待发酵液中芽孢含量≥1000亿/克时，停止发酵培养，然后将得到的发酵液进行喷雾干燥得到菌粉；

(5)将干燥后得到的菌粉与硅酸钾按质量比例7:5进行混合，即得到降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂。

进一步地，步骤(31)的液态的发酵培养基的组成为:酵母膏10g/L、可溶性淀粉16g/L、葡萄糖8g/L、黄豆饼粉16g/L、牛肉膏12g/L、玉米粉16g/L，其余为水。

更进一步地，步骤(31)的发酵培养基中还包括少量的消泡剂。

更更进一步地，消泡剂为植物油，植物油的含量为2.5wt％。

更更进一步地，消泡剂为二甲基硅油，二甲基硅油含量为1.2wt％。

上述降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，用于降解硅酸盐。

上述降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，用于钝化重金属，促进作物生长，改善土壤微生态环境。

具体实施例4

降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，包括有效成分，

所述有效成分包括凝结芽孢杆菌及硅酸钾，凝结芽孢杆菌与硅酸钾的质量比为7:3，

凝结芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.13961。

进一步地，菌剂的凝结芽孢杆菌的孢子含量为≥100亿/克。

降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤:

(1)菌种活化

将保藏号为CGMCC NO.13961的凝结芽孢杆菌的菌株在LB液体培养基中活化12h，备用；

(2)种子液制备

将步骤1)活化后的菌株，在30℃下震荡15h培养，得到种子液；

(3)发酵培养

(31)配置液态的发酵培养基，控制其初始pH值为7，然后高温灭菌；

(32)待经过高温灭菌的发酵培养基的温度降到30℃以下时，接入步骤(2)得到的种子液，再在温度为30℃，通气量175L/h，搅拌速度为190rpm的条件下发酵培养28h得到发酵液；

(4)测定发酵液中的菌体数量，待发酵液中芽孢含量≥1000亿/克时，停止发酵培养，然后将得到的发酵液进行喷雾干燥得到菌粉；

(5)将干燥后得到的菌粉与硅酸钾按质量比例7:3进行混合，即得到降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂。

进一步地，步骤(31)的液态的发酵培养基的组成为:酵母膏7g/L、可溶性淀粉12g/L、葡萄糖6g/L、黄豆饼粉12g/L、牛肉膏9g/L、玉米粉12g/L，其余为水。

更进一步地，步骤(31)的发酵培养基中还包括少量的消泡剂。

更更进一步地，消泡剂为植物油，植物油的含量为1.5wt％。

更更进一步地，消泡剂为二甲基硅油，二甲基硅油含量为0.7wt％。

上述降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，用于降解硅酸盐。

上述降解硅酸盐及钝化重金属的凝结芽孢杆菌菌剂，用于钝化重金属，促进作物生长，改善土壤微生态环境。

上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。