一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法

摘要

本产品涉及一种新发现的菌株热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201，该菌株一方面能保持现有高水平发酵生产DC12的能力，又具有高度专一的α，ω‑氧化能力，使得产品一元酸的含量大大降低，本发明的DC12产品具有令人满意的晶体状形态，更容易满足欧洲无尘化、低粉尘产品出口要求。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物法合成生产长链十二碳二元酸的方法与菌株。

背景技术

长链二元酸是指碳原子数在十个以及以上的二元酸，一般指直链二元酸。十二碳二元酸(DC12)是合成高性能尼龙工程塑料尼龙1212和服装用高档尼龙热熔胶和高级涂料的重要原料。

DC12可以通过微生物发酵或化学合成两种方法制备生产。传统的生产长链二酸的化学方法需要9个复杂的反应步骤,高温、高压和催化剂；生产时需要防火、防爆和防毒装置，收率低、成本高和环境污染严重。而生物发酵法合成工艺简单，常温常压下就能生产，无污染、收率高，具备成本优势。

然而，生物法合成十二碳二元酸的现有方法中，依然存在发酵水平不高，产品纯度达不到制备长链二元酸酯的要求，特别是二元酸产品中由于发酵菌株α，ω-氧化位点的不同，会产生一定含量的一元酸杂质，由于一元酸和二元酸不容易分离，这给后面合成尼龙1212的工艺带来巨大不便。

发明内容

令人意外地，本发明的发明人通过长期生产实践过程中，意外地在发酵后废液(即含有废弃的生产菌株的发酵液中)筛选出一株热带 假丝酵母(Candida tropicalis)C1201(保藏号CCTCC NO.M2014545，保藏日期为2014年11月4日，保藏地点为武汉大学，中国典型培养物保藏中心，分类命名Candida tropicalis C1201)，其一方面能保持现有高水平发酵生产DC12的能力或略有提高，又具有高度专一的α，ω-氧化能力，使得产品一元酸的含量大大降低，即热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201为具有单一产品二元酸的高产菌株。此外，该菌株发酵获得产品二元酸，具有更大晶形，使得产品更容易达到后续工艺无尘化和低尘化要求，更加符合欧美市场特别是欧盟市场对无尘化产品的要求

热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201的生理特征如下：

一、糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。

二、同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松二糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤鲜醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。

三、生长素的需要：生物素++，维生素B1++，维生素B2+，维生素B6+，维生素B12+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。四、其它：硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。

形态特征：奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。

培养特征：在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭圆细胞。

发明所述的发酵转化正十二烷(nC12)生产十二碳二元酸(DC12)的方法是以热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201为发酵菌种，在以正十二烷为基质的培养基混合液中同步发酵，生产α， ω-十二碳二元酸。

发明所述的发酵转化正十二烷(nC12)生产十二碳二元酸(DC12)的方法的步骤为：

第一阶段为生产热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201的种子培养，即

优选地，把用一株热带假丝酵母C1201(Candida tropicalis)培养成的种母液接入pH值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和95～60％(v/v)发酵培养基的混合液中。

优选地，本发明的种子培养基：

(1)10巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；

(2)10巴林糖度的麦芽汁液体培养基；

(3)烷烃种子培养基包含：KH₂PO₄>

优选地，培养种子的过程为：取一接种环热带假丝酵母(Candida tropicalis)C1201酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(试管，每支装6～7mL培养基，灭菌后放成斜面)，于29～30℃培养40小时。取1～2支上述培养好的菌种全部刮入装有30mL烷烃种子培养基的250mL三角瓶中，于29～30℃220转/分的旋转摇床上培养40～48小时，作为摇瓶发酵种子或取两支上述培养好的斜面菌种全部刮入装有500mL培养基的5000mL三角瓶中，于200转/分的旋转摇床29～30℃培养44～48小时，菌株生长OD值达到0.6～0.85时，作为发酵液的种子。

应当明确，以上种子培养基及培养方法仅为优选方法，在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下，可以对上述条件进行改变，只要使得菌株生长正常能够达到OD值达到0.6～0.85， 作为发酵液的种子即可。

优选地，用本发明的C1201菌株生产长链二元酸，特别是十二碳二元酸的第二阶段是：

优选地，把培养好的经过镜检，没有杂菌的发酵液种子接入pH值为5.5～9.0含有5～40％(v/v)12个碳原子的正烷烃和95～60％(v/v)发酵培养基的混合液中。

更优选地，把培养好的经过镜检，没有杂菌的发酵液种子接入pH6.0～6.8的含有15～30％(v/v)的C₁₂的正烷烃和85～70％(v/v)发酵培养基的混合液中。

优选地，发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐4～15g/L，最好为6～10g/L，氯化钠0.5～2.5g/L，最好为1.0～2.0g/L，消泡剂400～1200ppm，重蜡或蔗糖15～30g/L及一些其他公知的营养源。

应当明确，以上种子培养基及培养方法仅为优选方法，在本发明说明书给出了该菌株的培养特征、营养特征的前提下，可以根据菌体在不同培养罐中的环境对上述条件进行改变。

优选地，所述热带假丝酵母C1201(Candida tropicalis)的发酵培养阶段为：将所述混合液在24～34℃下转化48～168小时，然后将生产的十二碳二元酸进行分离纯化。

更优选地，所述热带假丝酵母C1201(Candida tropicalis)的发酵培养阶段为：在pH6.0～7.5下将上述混合物在25～34℃，最优选地在27～31℃通气发酵72～168小时。

优选地，发酵阶段的第一阶段中，体系pH控制在6.0～6.8，以菌体生长为主，同时生产一定数量的二元酸；第二阶段，体系pH控制7.0～8.0之间，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体。更优选地，从72小时开始，每天补加一定量正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)，碱金属磷酸盐可从 KH₂PO₄或NaH₂PO₄中选一种。

优选地，本发明还包括将发酵液中产物十二碳二元酸分离回收阶段：

即发酵结束后，将发酵液加热加碱破乳，加热至80-90℃，加碱至pH10左右，压入静置分层罐分层。优选地，本发明还包括将残余正烷烃回收再用的步骤，即膜分离除去菌体，清液放置，冷却至20℃，收集DC12钠盐的晶体，母液直接酸化结晶，收集DC12钠盐和DC12，用水或有机溶剂进行重结晶，得到DC12白色结晶。

用本发明的热带假丝酵母C1201菌株和发酵方法，可在50m³发酵罐，从nC₁₂发酵生产DC₁₂时，发酵163小时，产酸量达220g/L以上，转化率达到90％以上，DC₁₂纯度达到98％以上，其中一元酸的含量小于0.01％。此外，令人意外地，如说明书附图图1所示，本发明的DC12产品具有令人满意的晶体状形态，这对欧洲无尘化、低粉尘产品进口要求而言更具有竞争力。

附图说明

图1a为本发明方法实施例1制备的十二碳二元酸晶体；

图1b为对比例1方法制备的十二碳二元酸粉末产品。

具体实施方式

实施例1：

(1)、取一接种环热带假丝酵母C1201菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天。

(2)、取上述菌种一支，接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。液体种子培养基中含有KH₂PO4>

(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述培养好的种子液，于28-30℃，220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用6N NaOH调一次PH至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含KH₂PO₄>

发酵结束后，用6N的HCl调节PH至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到DC12白色结晶，用15ml中性乙醇溶解后，用标准NaOH溶液滴定，计算出发酵液中DC12含量为89.8g/l，纯度99.43％，其中一元酸含量0.009％。

实施例2：

(1)种子培养基及培养方法和发酵培养基同实例1。

(2)把3000mL培养两天，OD(×30，620nm)为0.81pH 3.8，健壮，无杂菌种液接入装有700L种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶0.8，培养36小时，作为二级种母的种子。

(3)把(2)中培养的健壮，无杂菌的700L种液接入装有6.5m³种子培养基，经过121℃灭菌40分钟的10m³二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.7，培养40～48小时，作为发酵的种子。

(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的种液，接入装有33m³发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的50m³发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.5，开始时，nC₁₂>3，30小时内，体系pH控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生28.5g/L>12，然后体系pH在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到120g/L，70小时后每天补加一定量nC₁₂，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发>

发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nC₁₂，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓H₂SO₄至pH3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状DC₁₂产品。nC₁₂转化率为92.8％，后处理总收率达到90.5％，DC₁₂纯度达到99.35％，其中一元酸的含量0.008％。

实施例3：

(1)种子培养基及培养方法及发酵培养基、发酵方法同实例2。

(2)把3000mL培养两天，OD(×30，620nm)为0.81pH 3.8，健壮，无杂菌种液接入装有2个700L种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶0.8，培养36小时，合并作为二级种母的种子。

(3)把(2)中培养的健壮，无杂菌的2个700L种液分别接入2个装有26.5m³种子培养基，经过121℃灭菌40分钟的10m³二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.7，培养40～48小时，合并作为发酵的种子。

(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的种液，接入装有66m³发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的100m³发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.5，开始时，nC₁₂>3，30小时内，体系pH控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生32g/L>12，然后体系pH在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到125g/L，70小时后每天补加一定量nC₁₂，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发酵140小时，产酸量达215g/L，发酵到163小时结束，产酸量达213g/L。

发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nC₁₂，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20分钟，压滤除去活性炭，脱色清液加热后加入浓H₂SO₄至pH3，冷却至室温，压滤，空气吹干，固形物经烘干机烘干，得白色结晶状DC₁₂产品。nC₁₂转化率为90.8％，后处理总收率达到91.6％，DC₁₂纯度达到99.45％，其中一元酸的含量0.009％。

对比例1：

该对比例使用中国科学院微生物所许可专利菌株热带假丝酵母UH-2-48，保藏号为CGMCC NO.0239菌株(参见专利ZL 95117436.3)，其他方法同实施例1即：

(1)、取一接种环热带假丝酵母UH-2-48菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，在28℃培养2天。

(2)、取上述菌种一支，接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中于28-30℃在220转/分的旋转摇床上培养40小时。液体种子培养基中含有KH₂PO₄>

(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接入3.5ml上述培养好的种子液，于28-30℃，220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用6N NaOH调一次PH至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含KH₂PO₄>

发酵结束后，用6N的HCl调节PH至2-3，用120ml乙醚抽提后，蒸去乙醚，得到DC12白色粉末，用15ml中型乙醇溶解后，用标准NaOH溶液滴定，计算出发酵液中DC12含量为62.7g/l，纯度97.23％，其中一元酸的含量为大于1.2％。

此外，通过附图1的比较，本发明的实施例1获得产品晶体更大，而对比例1获得产品基本为粉末状。

对比例2：

该对比例使用微生物所许可专利菌株热带假丝酵母UH-2-48，保藏号为CGMCC NO.0239菌株(参见专利ZL 95117436.3)，其他方法同实施例2即：

(1)种子培养基及培养方法及发酵培养基、发酵方法同实例2。

(2)把3000mL培养两天，OD(×30，620nm)为0.81pH 3.8，健壮，热带假丝酵母UH-2-48无杂菌种液接入装有700L种子培养基，经121℃灭菌40分钟的一级种子罐中，29℃350转/分，罐压0.8kg/cm²，通气量1∶0.8，培养36小时，作为二级种母的种子。

(3)把(2)中培养的健壮，无杂菌的700L种液接入装有6.5m³种子培养基，经过121℃灭菌40分钟的10m³二级种母罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.7，培养40～48小时，作为发酵的种子。

(4)把(3)中培养的健壮、无杂菌的无杂菌种液种液，接入装有33m³发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的50m³发酵罐中，30℃，200转/分，罐压1kg/cm²，通气量1∶0.5，开始时，nC₁₂>3，30小时内，体系pH控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生20.1g/L>12，然后体系pH在7.0～8.0，继续发酵，到67小时，产酸量达到108g/L，70小时后每天补加一定量nC₁₂，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(v/v)。发酵139小时，产酸量达133g/L，发酵到163小时结束，产酸量达143g/L。

发酵结束后，进行破乳分层，回收上层残余nC₁₂，下层菌体层通过压滤，除去菌体，合并清液，加入0.6～0.7％活性炭90℃脱色20>2SO₄至pH>12产品。nC₁₂转化率为88.8％，后处理总收率达到85％，DC₁₂纯度达到96.35％，其中一元酸的含量大于1.5％。

以上实施例仅用以说明本发明专利的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明专利进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明专利的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明专利的权利要求范围当中。