一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法

摘要

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法，包括如下步骤：(1)靶向CCR5基因的CRISPR/Cas9打靶系统的构建：打靶系统由Cas9/sgRNA表达载体和打靶供体组成，所述打靶供体包括启动子、荧光标记基因、中间含有gRNA靶序列的与目的基因的同源序列的设计；(2)CRISPR/Cas9打靶系统共转染哺乳动物细胞，转染后分选稳定表达荧光的细胞，进行单细胞克隆培养；(3)单细胞克隆PCR鉴定检测定点整合效率，获得高效定点定向整合的哺乳动物细胞。本发明能实现1个6kb以上大片段DNA在哺乳动物细胞中的定点定向整合。