基于多条DNA条形码的6个鳗鱼物种鉴别方法

摘要

本发明提供基于多条DNA条形码的6个鳗鱼物种鉴别方法，采用4对引物，用于扩增6种鳗鱼的16S rRNA、Cyt b、CO Ⅰ编码基因的4个DNA部分片段（COⅠ基因2条片段），从这4条片段中截取碱基数分别为262bp（16S rDNA）、280bp(Cyt b)、300bp(COⅠ‑1)、345bp(COⅠ‑2)的片段，这4条具有6个鳗鱼物种特异性较强的DNA片段作为标准DNA条形码，通过碱基序列同源性比对分析，建立了6个鳗鱼物种的DNA条形码鉴别方法。该方法耗时短，操作简便，特异性强。

说明书

技术领域

本发明涉及一种针对美洲鳗(Anguilla>)、欧洲鳗(Anguilla>anguilla)、日本鳗(Anguilla>)、莫桑比克鳗（Anguilla>）、花鳗（Anguilla>）、双色鳗（Anguilla>）等6个物种的多DNA条形码精确鉴别方法，更具体涉及6种鳗鱼美洲鳗(A.>)、欧洲鳗(A.>) 、日本鳗(A.>)、莫桑比克鳗（A.>）、花鳗（A.>）、双色鳗（A. bicolor>pacifica）的物种的线粒体16S>

背景技术

福建省是鳗鱼养殖与加工出口大省，每年出口额达数十亿元。由于鳗鱼加工品如烤鳗、蒲烧或制成其他形态熟食后，以及进口鳗苗体积细小，难以从形态上辨别其种类。一方面不同种类的鳗鱼产品与鳗苗价格也不同，另一方面，欧洲鳗被自然保护国际联盟组织列为极度濒危物种，《濒危野生动植物种国际贸易公约（CITES）》秘书处于2009年3月13日宣布，174个《公约》的缔约国将对欧洲鳗（European Eel）实施新的监管措施，之后所有的欧洲鳗国际贸易都必须获得濒危物种贸易许可证。我国鳗鱼产品出口日本，被要求提供检验检疫部门出具的鳗鱼物种鉴定报告，如果产品物种属于欧洲鳗，又未能提供贸易许可证，将被强行销毁处理。另外，近年来时有发现不良商家用在我国气候条件下无法正常生长成成鳗的莫桑比克鳗苗冒充“南美鳗”，给养殖企业造成巨大损失。为了维护企业与消费者利益以及正常市场秩序，应企业与执法部门要求，建立主要进出口鳗鱼种类的精准鉴定方法，对我国鳗鱼养殖业与加工出口外贸易具有重要的现实意义。

本发明研发设计4对新的引物，用于扩增6种鳗鱼的16S rRNA、Cyt b、COⅠ编码基因的4个DNA部分片段，其PCR产物通过测序得知，碱基数分别为（504-507）（16S rDNA） bp、400bp(Cyt>)、609bp(COⅠ-1)、651bp(COⅠ-2)，从中分别截取碱基数为262bp（16S>Cyt>)、300bp(COⅠ-1)、345bp(COⅠ-2)的片段(下同)，这4条具有6个鳗鱼物种特异性较强的DNA片段作为标准DNA条形码，通过碱基序列同源性比对分析，建立了6个鳗鱼物种的DNA条形码鉴别方法。

发明内容

本发明提供基于多条DNA条形码的6个鳗鱼物种鉴别方法，以提取的DNA为模板进行16S rRNA、Cyt b、COⅠ编码基因的4个部分DNA片段序列的PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测确认，然后进行DNA序列测定、剪切，筛选出具有6种鳗鱼物种特异性的碱基数分别为262bp、280bp、300bp、345bp的4个片段，作为标准DNA条形码，再应用DNA分析软件（DNAMAN6.0）对待测样品的相应基因片段的DNA序列与建立的4条标准DNA条形码碱基序列进行同源性比对分析，判定待测鳗鱼样品物种的分子生物学鉴定技术，建立6种鳗鱼美洲鳗(A.>)、欧洲鳗(A.>) 、日本鳗(A.>)、莫桑比克鳗（A.>mossambica）、花鳗（A.>）、双色鳗（A.>）物种的DNA条形码鉴别方法。

本发明的6种鳗鱼美洲鳗(A.>) 、欧洲鳗(A.>)、日本鳗(A.>japonica)、莫桑比克鳗（A.>）、花鳗（A.>）、双色鳗（A. bicolor>pacifica）物种的PCR产物序列比对鉴别方法，主要利用4对引物对待测鳗鱼样品的16SrRNA、Cyt>COI编码基因的4个部分DNA片段进行PCR扩增，分别扩增出（504-507）bp、400bp、609bp、651bp的产物，经测序并剪切成碱基数分别为262bp、280bp、300bp、345bp的片段，与标准DNA条形码进行序列比对（同源率均为100%），而进行鳗鱼种类鉴别。所述引物的核苷酸序列与PCR退火温度如表1。

表1 PCR引物及其退火温度

所述PCR扩增的条件为：94℃预变性3 min。94℃变性30 s，54-62℃(各对引物相应温度见表1)退火时间30 s，72℃延伸60 s，40个循环；72℃延伸10 min。4℃下保存。反应体系为：10×Taqbuffer>Taq酶1.0>2>2O将总体积补至25μL。

本发明的方法用于特异性地鉴别出6种鳗鱼日本鳗(A.>)、美洲鳗(A.>rostrata)、欧洲鳗(A.>) 、莫桑比克鳗（A.>）、花鳗（A.>）、双色鳗（A.>）物种，该方法耗时短，操作简便，特异性强，采用4条DNA条形码，检测结果能互相验证，可以用于无法从形态学上加以识别的蒲烧鳗鱼等鳗鱼加工产品与鳗苗物种的精确鉴定，为维护企业与消费者利益以及正常的市场秩序提供技术支撑。

附图说明

图1 6种鳗鱼16S rRNA基因部分DNA片段（504-507bp）PCR产物电泳图。

图2 6种鳗鱼Cyt b基因部分DNA片段（400 bp）PCR产物电泳图。

图3 6种鳗鱼CoⅠ-1的DNA片段（609 bp）PCR产物电泳图。

图4 6种鳗鱼CoⅠ-2的DNA（651 bp）PCR产物电泳图。

图5 6种鳗鱼16S rRNA基因的DNA条形码(262 bp)标准序列图。

图6 6种鳗鱼Cyt b基因的DNA条形码(280 bp)标准序列图。

图7 6种鳗鱼CoⅠ-1的DNA条形码 (300 bp)标准序列图。

图8 6种鳗鱼CoⅠ-2的DNA条形码 (345 bp)标准序列图。美洲鳗序列开头与结尾下划线部分各8个碱基作为各目的片段截取引子用。

具体实施方式

试剂来源：10×Taqbuffer>Taq酶、dNTPs购自上海生工有限公司，引物委托上海生工有限公司合成，DNA序列委托广州英韦创建生物科技有限公司测试。

引物合成

应用16S>Cyt>、CoⅠ（CoⅠ-1、CoⅠ-2）3个编码基因的4对通用引物，扩增出美洲鳗(A.>) 、欧洲鳗(A.>)、日本鳗(A.>)、莫桑比克鳗（A.>mossambica）、花鳗（A.>）、双色鳗（A.>）6种鳗鱼的16S>Cytb、CoⅠ（CoⅠ-1、CoⅠ-2）等3个基因4条DNA片段的PCR产物，根据序列测定与DNAMAN6.0软件同源性分析结果，挑选6种鳗鱼序列相同部分设计了4对PCR引物（序列如表1），并优化了PCR反应温度循环条件。

鳗鱼DNA提取

1.5 mL离心管中加入约100 mg鲜肉样品或50 mg样品粉末，加200 μL TE溶液(pH8.0)，旋涡混匀；加入400 μL裂解液，旋涡混匀，65℃温浴1h或超声波中65℃温浴振荡15 min；加600 μL酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，剧烈振荡，12000 g离心10 min；取上清液，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，剧烈振荡，12000 g离心10 min；取上清液，加0.8倍体积异丙醇，12000g离心10 min；取沉淀，加入400 μL NaCl（1 mol/L）于65℃温浴中溶解，再加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），5 μL Rnase A（10 μg/mL）]，剧烈振荡30秒以上，37℃温浴1h，期间定期晃动。加等体积的水饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），振荡，12,000 r/min离心15 min，重复该步骤1-2次，直到蛋白质去除干净为止。取上清，加2倍体积的无水乙醇，轻微晃动，12,000 r/min离心10 min。取沉淀，70％乙醇清洗2次，干燥，加100 μL TE（pH8.0）溶解。每个样品设2个重复。也可使用市贩的应用于动物DNA提取的试剂盒。

DNA的浓度与纯度测定

样品DNA用核酸蛋白分析仪测定260 nm和280 nm处吸收值，分别计算DNA纯度与浓度，计算公式如下： DNA纯度=OD₂₆₀/OD₂₈₀，比值在1.7-2.0之间较为理想；双链DNA浓度（μg/mL）=50>260值。

反应体系与条件

反应体系为：10 × Taqbuffer>Taq酶1.0>2>2O将总体积补至25>

PCR扩增的条件为：94℃预变性3 min。94℃变性30 s，54-62℃(各对引物相应温度见表1)，退火时间30 s，72℃延伸60 s，40个循环，72℃延伸10 min。4℃下保存。

结果分析

图1-图4分别为美洲鳗(A.>) 、欧洲鳗(A.>)、日本鳗(A.>japonica)、莫桑比克鳗（A.>）、花鳗（A.>）、双色鳗（A. bicolor>pacifica）6种鳗鱼的16S>Cytb、CoⅠ等3个基因的4条DNA>Cytb）、609bp(COI-1)、651bp(COI-2)。图5-图8，分别为4条DNA片段PCR产物测序、剪切，筛选出具有6种鳗鱼物种特异性的、碱基数分别为262bp（16S>Cyt>)、300bp(CoⅠ-1)、345bp(CoⅠ-2)的4条标准DNA条形码碱基序列，供待测样品比对与验证，可在6种鳗鱼范围内进行鳗鱼物种鉴别。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 基于多条DNA条形码的6个鳗鱼物种鉴别方法

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<170> PatentIn version 3.3

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