含D型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物及其合成与应用

摘要

本发明公开了一类含D型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物，是将天然抗菌肽Anoplin的含D型氨基酸前体肽分别进行N末端侧链聚合而得。通过对常见的标准菌最低抑菌浓度测定，抑制生物膜形成试验，以及酶解稳定性试验，表明本发明合成的含D型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物的抗菌活性比母肽增强4~16倍，同时表现出较强的抑制细菌生物膜形成的能力。另外，本发明合成的含D型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物的稳定性也显著提高，与母肽Anoplin相比，耐受胰蛋白酶解的能力提高了10

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一类具有强抗菌活性和耐受酶降解的含D型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物的合成方法，主要用于制备长效临床抗菌药物。

背景技术

近年来，滥用抗生素产生的耐药性问题日益严重，对人类疾病造成了巨大的威胁。寻找新的可替代抗生素的新药迫在眉睫。抗菌肽（Antimicrobial peptides），是生物体经诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，来源广泛，其分子量小，大约在 3~6 kD之间，有耐热、耐酸性强，水溶性好，快速的杀菌能力等特点（Hancock REW， Scott MG.ProcNatlAcadSci USA，2000，97（16）：8856~ 8861）。抗菌肽的抗菌机制不同于普通抗生素，抗菌机制一般包括①快速破坏菌膜，使菌体内容物泄露，细菌死亡②抗菌肽与细菌细胞内容物（如DNA或RNA）作用，干扰细菌细胞正常的合成和代谢，导致菌体死亡（刘立伟，邓磊.抗菌肽作用机制研究进展[J].河北化工，2012,35（7）：13-15）。所以，抗菌肽不易诱导耐药性的产生，使其成为生物医药领域的热门研究内容。

但是天然抗菌肽也存在一些弊端，比如：酶解稳定性差，生物利用度低；选择性不强，对哺乳动物细胞会产生破坏作用等，都会限制天然抗菌肽的进一步发展。因此，对天然抗菌肽进行改造成为研究的热点，其中非天然的D型氨基酸的引入常被作为一种常用的手段，优化抗菌肽，以提高耐受酶降解的能力（Di Grazia A，Cappiello F， CohenH.et.al.D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptideesculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions[J].AminoAcids，2015，47(12)：2505-19.）。但由于非天然D型氨基酸的引入，常会影响其α螺旋结构，导致其抗菌活性的减弱。

CN201610909968.5公开了一种含D型氨基酸的抗菌肽类似物，是在天然抗菌肽Anoplin的亲水面、疏水面分别引入D型氨基酸对其进行修饰而得。虽然，其合成的亲水面D型肽类似物表现出较强的抑制细菌生物膜形成的能力和耐受胰蛋白酶能力，但其抗菌活性并没有得到提高，均保留原有母肽的抗菌活性；其合成的疏水面D型替换类似物的稳定性和耐受胰蛋白酶能力显著提高，但其抗菌活性较母肽比有所降低。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种具有高稳定性和强抗菌活性的含D型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物；

本发明的另一目的是提供一种上述含D型氨基酸的抗菌肽二聚体的合成方法；

本发明还有一个目的，就是提供该抗菌肽二聚体为活性成分在制备抗菌药物中的应用。

一、含D型氨基酸的抗菌肽二聚体的结构和合成

本发明含D型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物，是在抗菌肽Anoplin的亲水面、疏水面分别引入D型氨基酸，然后在序列的N末端分别引入2个特殊氨基酸——炔丙基甘氨酸（Fmoc-Pra-OH）或侧链Mtt保护的赖氨酸（Fmoc-Lys(Mtt)-OH），对天然抗菌肽Anoplin进行修饰，具体如下：

在抗菌肽Anoplin的亲水面、疏水面分别引入的D型氨基酸为D型Lys，引入位点分别为4和7位，并将其N末端引入氨基酸炔丙基甘氨酸（Fmoc-Pra-OH）和侧链Mtt保护的赖氨酸（Fmoc-Lys(Mtt)-OH），对其进行侧链聚合修饰，得到的含D型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物命名为Anoplin-(D4,7)₂或J-AA-(D4,7)₂；其结构式为：

在抗菌肽Anoplin的亲水面引入的D型氨基酸为D型Arg和D型Lys，引入位点分别为5和7位；疏水面引入的D型氨基酸为D型Leu，引入位点分别为9，10和3位；并将其N末端引入氨基酸炔丙基甘氨酸（Fmoc-Pra-OH）和侧链Mtt保护的赖氨酸（Fmoc-Lys(Mtt)-OH），对其进行侧链聚合修饰，得到的含D型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物命名为Anoplin-(D9,10,3+D5,7)或J-AA-(D9,10,3+D5,7)；其结构式为：

在抗菌肽Anoplin的亲水面引入的D型氨基酸为D型Lys，引入位点分别为4和7位；疏水面引入的D型氨基酸为D型Arg和D型Lys，引入位点分别为5和7位；并将其N末端引入氨基酸炔丙基甘氨酸（Fmoc-Pra-OH）和侧链Mtt保护的赖氨酸（Fmoc-Lys(Mtt)-OH）修饰，得到的含D型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物命名为Anoplin-(D4,7+D5,7)或J-AA-(D4,7+D5,7)；其结构式为：

。

二、含D型氨基酸抗菌肽二聚体类似物的体外抑菌实验

1. 对标准菌株的抑菌实验

采用常见的二倍稀释法测定药物的最小抑菌浓度，即MIC值。结果重复三次以上的、平行实验。结果见表1。

表1 对标准菌株最低抑菌浓度

2. 酶解稳定性试验

具体方法：将胰蛋白酶或糜蛋白酶配成一系列浓度 2000，200，20，2，0.2，0.02μg/ml。将抗菌肽Anoplin、J-AA-(D4,7)₂、J-AA-(D9,10,3+D5,7)、J-AA-(D4,7+D5,7)>

图1为耐受胰酶6小时稳定性试验结果。可以看出，3条二聚体类似物的耐受胰酶降解的能力显著提高，跟母肽Anoplin相比，耐受胰酶分别提高10⁵倍。

图2为耐受糜蛋白酶6小时稳定性试验结果。可以看出，四条D型类似物耐受糜蛋白酶的能力较母肽Anoplin显著提高，其中，J-AA-(D4,7)2, J-AA-(D9,10,3+D5,7)和 J-AA-(D4,7+D5,7)耐受糜蛋白酶降解的能力提高10²倍。

3. RP-HPLC降解率曲线

抗菌肽Anoplin，以及含D型氨基酸二聚体类似物J-AA-(D4,7)2, J-AA-(D4,7+D5,7)分别与200 μg/ml的胰酶37摄氏度孵育，在不同时间段，吸取孵育液，进行RP-HPLC分析，绘制降解率-时间曲线（图3）。可以看出，母肽Anoplin在120min时间内就被完全快速100%降解，而二聚体类似物的降解率显著降低，与胰酶孵育时间6小时，降解率仅为20%左右。

抗菌肽Anoplin，以及含D型氨基酸二聚体类似物J-AA-(D4,7)2，J-AA-(D4,7+D5,7)分别与20μg/ml的糜蛋白酶37摄氏度孵育，在不同时间段，吸取孵育液，进行RP-HPLC分析，绘制降解率-时间曲线（图4）。可以看出，母肽Anoplin在300min时间内就被完全快速100%降解，而二聚体类似物的降解率显著降低，在共孵育6小时，降解率仅为20%和29%。

抗菌肽Anoplin，与其D型氨基酸二聚体类似物J-AA-(D9,10,3+D5,7)分别与2μg/ml的糜蛋白酶37摄氏度孵育，在不同时间段，吸取孵育液，进行RP-HPLC分析，绘制降解率-时间曲线（图5）。可以看出，在相同时间段，母肽Anoplin的降解率均高于D型氨基酸二聚体类似物J-AA-(D9,10,3+D5,7)。

4. 抑菌圈扩散形成试验

孵育方法：将大肠杆菌和肺炎克雷伯菌接种到MH肉汤中，待细菌长到中间对数期，最终用MH稀释到1×10⁷CFU/ml.>

试验结果见图6（A：J-AA-(D9,10,3+D5,7) ; B: J-AA-(D4,7)₂;>2）。二聚体类似物的抗菌活性具有剂量依赖性，在低浓度时抑菌圈形成不明显，随着浓度的增大，抑菌圈的直径逐渐增加，表现出明显的抑菌作用。

附图说明

图1为本发明3条含D型氨基酸抗菌肽二聚体类似物耐受胰酶6小时稳定性。

图2为本发明3条含D型氨基酸抗菌肽二聚体类似物耐受糜蛋白酶6小时稳定性试验。

图3为Anoplin、D型氨基酸抗菌肽二聚体类似物J-AA-(D4,7)2, J-AA-(D4,7+D5,7)与200 μg/ml的胰酶37摄氏度孵育不同时间的RP-HPLC降解率曲线。

图4为Anoplin、D型氨基酸抗菌肽二聚体类似物J-AA-(D4,7)2, J-AA-(D4,7+D5,7)与20 μg/ml的胰酶37摄氏度孵育不同时间的RP-HPLC分析。

图5为Anoplin、D型氨基酸抗菌肽二聚体类似物J-AA-(D9,10,3+D5,7)与2μg/ml的糜蛋白酶37摄氏度孵育不同时间的RP-HPLC分析。

图6为本发明含D型氨基酸抗菌肽类似物抑制大肠杆菌抑菌圈形成试验。

图7为本发明含D型氨基酸抗菌肽类似物抑制肺炎克雷伯菌抑菌圈形成试验。

图8 为类似物J-AA-(D4,7)2的RP-HPLC分析谱图。

图9为类似物J-AA-(D4,7+D5,7)的RP-HPLC分析谱图。

图10为类似物J-AA-(D9,10,3+D5,7)的RP-HPLC分析谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明D型氨基酸抗菌肽类似物的结构、合成作进一步说明。

实施例1、类似物J-AA-(D4,7)2的合成

称取Rink-MBHA 树脂，取代值为0.43mmol/g，合肽量为0.15mmol，加入重蒸的二氯甲烷溶液，充分搅拌溶胀树脂，时间为30min，然后加入10% 的六氢吡啶脱树脂Fmoc保护，每次洗2min，共洗4遍，然后用重蒸DMF溶液洗树脂，同样每次2min，共洗4遍，最后使用茚检指示剂（苯酚：氰化钾吡啶：茚三酮=1:2:1）检验树脂是否脱去Fmoc保护基团，沸水煮树脂1min，立即观察，树脂显蓝色，则证明Fmoc基团已脱出，按合肽的序列，从C末端开始接氨基酸，经RP-HPLC制备，使用C18柱纯化，洗脱条件为20%~60%乙腈，8ml/min纯化，得到前体肽Ac-Pra-D4,7和Ac-Lys(N3)-D4,7。将得到的前体肽进行侧链聚合的点击化学反应：纯肽Ac-Pra-D4,7（1.2e~2.5e）和Ac-Lys(N3)-D4,7(1e) 投料，以CuSO₄.5H₂O>

实施例2、类似物J-AA-(D4,7+D5,7)的合成

称取Rink-MBHA 树脂，取代值为0.43mmol/g，合肽量为0.25mmol，加入重蒸的二氯甲烷溶液，充分搅拌溶胀树脂，时间为30min，然后加入15%的六氢吡啶脱树脂Fmoc保护，每次洗2min，共洗4遍，然后用重蒸DMF溶液洗树脂，同样每次2min，共洗4遍，然后茚检指示剂（苯酚：氰化钾吡啶：茚三酮=1:2:1）检验，树脂显蓝色，证明树脂上的Fmoc基团已脱出，按合肽的序列，从C末端开始接氨基酸，经RP-HPLC制备, 使用C18柱纯化，洗脱条件为20%-60%乙腈，8ml/min纯化，得到前体肽Ac-Pra-D4,7和Ac-Lys(N3)-D5,7。将得到的前体肽进行侧链聚合的点击化学反应，即，纯肽Ac-Pra-D4,7（1.0e~2.5e）和Ac-Lys(N3)-D4,7(1e) 投料，以CuSO₄.5H₂O>

实施例3、类似物J-AA-(D9,10,3+D5,7)的合成

称取Rink-MBHA 树脂，取代值为0.43mmol/g, 合肽量为0.2mmol，加入重蒸的二氯甲烷溶液，充分搅拌溶胀树脂，时间为30min, 然后加入15%的六氢吡啶脱树脂Fmoc保护，每次洗2min, 共洗4遍，然后用重蒸DMF溶液洗树脂，同样每次2min，共洗4遍，然后茚检指示剂（苯酚：氰化钾吡啶：茚三酮=1:2:1）检验，树脂显蓝色，证明Fmoc基团已脱出，按合肽的序列，从C末端开始接氨基酸，经RP-HPLC制备, 使用C18柱纯化，洗脱条件为20%-60%乙腈，8ml/min纯化，得到前体肽Ac-Pra-D9,10,3和Ac-Lys(N3)-D5,7。将得到的前体肽进行侧链聚合的点击化学反应，即，纯肽Ac-Pra-D4,7（1.1e~2.5e）和Ac-Lys(N3)-D4,7(1e) 投料，以CuSO₄.5H₂O>