一种测量独立同核自旋对间接偶合模式的方法

摘要

本发明公开了一种可直接应用于样品独立同核自旋对间接偶合关系检测的新型核磁共振二维J分解谱方法，利用绝热脉冲激发纯化学位移法和选择性翻转脉冲来获取同核之间独立的间接偶合信息，同时利用脉冲相位傅立叶变换矩阵编码技术来实现同时检测多对独立核‑核之间间接偶合关系并提高信号灵敏度。本发明的方法只需在谱仪上以文本格式导入编译好的脉冲序列以及相应的数据后处理代码，无需特殊硬件装置适用于任意常规核磁共振波谱仪。

说明书

技术领域

本发明涉及核磁共振(NMR，Nuclear Magnetic Resonance)波谱学检测方法，尤其是涉及一种可直接用于独立自旋对间接偶合关系测量的新型核磁共振二维J分解谱方法。

背景技术

核磁共振波谱技术可提供化学位移和J偶合等分子级别的信息，成为分子结构解析和成分分析一种强有力的工具。常规2D J分解谱直接维度提供化学位移信息，间接维度提供所有核自旋与检测自旋共同作用的J裂峰情况。然而独立同核自旋对的裂峰个数以及J偶合常数往往无法直接获得，影响分子键角度和扭转情况的测量，从而不利于信号归属和结构分析。

目前独立同核自旋对J偶合常数的测量是通过采样常规1D以及2D核磁共振谱，然后基于核磁共振谱信息通过约束分子动力学计算来获得的。为了尽可能获得详细的核磁共振信息，除了1D核磁共振谱外，还需要采样2D同核相关核磁共振谱和2D异核单量子相关核磁共振谱。另一方面，约束分子动力学计算是不同于核磁共振领域的研究，往往掌握核磁共振技术的研究人员不懂得使用约束分子动力学计算。而且，约束分子动力学计算时间长，需要配置计算能力强的计算机。因此，如何无需掌握深奥的约束分子动力学计算能力以及特殊的计算机设备，而仅从脉冲序列设计和数据后处理方法角度出发，设计出一种直接用于独立同核自旋对间接偶合关系测量的新型核磁共振二维J分解谱的方法，就能进一步提高核磁共振谱学在化学、生物结构学中的应用。

发明内容

本发明给出核磁共振谱仪上，一种直接用于独立同核自旋对间接偶合关系测量的新型核磁共振二维J分解谱方法，包括如下步骤：

1)将所检测的溶液样品装入核磁试管中，然后将装好样品的试管放入核磁谱仪的检测磁体中；

2)对样品进行匀场和锁场；

3)常规一维脉冲序列采样一张一维谱，获得谱图的谱宽；

4)在一个固定功率下，测量常规一维脉冲序列中非选择性矩形π/2脉冲的持续时间，为多色脉冲、选择性脉冲以及绝热脉冲参数设置提供依据；

5)在核磁共振波谱仪上导入事先编译好的脉冲序列；

6)打开这一脉冲序列的自旋相关转移模块、同核自旋对选择模块和J调制信号采样模块，设置各个模块的实验参数；

6)完成实验参数设置后，直接执行数据采样，测量每一个所选择核自旋与之偶合核的新型J分解谱需要20分钟左右，整个采样过程的时间等于所选择核自旋的个数乘以20分钟，得到二维谱实验数据；

7)当数据采样全部完成后，进行相关的数据后处理，得到反映独立同核自旋对间接偶合关系的新型核磁共振二维J分解谱。

在步骤1)中，所述的装样过程只需要直接将配置好的溶液样品装入核磁谱仪配备的试管并放入指定检测磁体中，整个过程无需对谱仪硬件设施进行改动。

在步骤2)中，所述的对样品进行匀场和锁场，只需要利用谱仪自带的匀场和锁场命令实现，无需附加过程，也无需对谱仪硬件设施进行改动。

在步骤3)中，所述常规一维脉冲序列是核磁共振谱仪自带的一维脉冲序列，由一个非选择性π/2射频脉冲和采样期构成，即非选择性π/2射频脉冲作用后紧跟着信号采样，目的是为了检查在液体样品放置后磁场均匀性情况，同时为谱宽参数设置提供依据。

在步骤4)中，所述常规一维脉冲序列与步骤3)中所述一致，非选择性π/2射频脉冲宽度的测量，是在固定一个功率下，对脉冲宽度从1微秒开始，以固定步长值4μs左右对脉冲时间递增方式设置10个左右的脉冲值，利用常规一维脉冲序列进行采样。以第一个脉冲宽度下采样获得的谱线利用谱仪自带调相命令进行调相，观察不同脉冲宽度下谱线分布情况。当观测到第一次出现负的幅值向正的幅值变化时，即找到2π脉冲时间的附近。为了测量2π脉冲时间，在其附近以更小的固定值(如1μs)设置一组脉冲宽度，找出谱线积分值为0时的脉冲时间，此脉冲时间即为2π脉冲时间，其值除以4即可得到π/2的脉冲时间。

在步骤5)中，所述脉冲序列使用了自旋相关转移模块、同核自旋对选择模块和J调制信号采样模块。

所述脉冲序列中自旋相关转移模块由一个多色π/2脉冲和一个非选择性矩形π/2脉冲构成。多色π/2脉冲包含多个宽度相同的选择性高斯形状π/2脉冲，其中每一个高斯形状π/2脉冲激发一个感兴趣的核自旋，每一个形状脉冲的相位根据傅立叶变化矩阵相位来设值，即其中N表示感兴趣的核自旋数目；n＝1，2，…,N，表示感兴趣核自旋编号；m＝1，2，…，N，表示脉冲序列重复采样的编号。多色π/2脉冲将感兴趣核自旋从纵向翻转到横向磁化平面，利用核-核间接偶合关系以及非选择性矩形π/2脉冲，感兴趣自旋被翻转回纵向，而与之偶合的核自旋被翻转到横向磁化平面，从而实现了相关转移。

所述脉冲序列中同核自旋对选择模块是一个多色π脉冲、作用在梯度场下的一对斜率反向的线性调频脉冲组成的PSYCHE模块、PSYCHE模块两端的散相梯度场、以及放置在多色π脉冲和PSYCHE模块两边的一对同向散相梯度场构成。多色π脉冲选择与多色π/2脉冲选择相同的核的纵向磁化进行翻转，梯度场下的一对斜率反向的线性调频脉冲实现对核自旋的少量翻转，少量被线性调频脉冲翻转的核自旋如果与多色π脉冲所选择的核自旋具有间接偶合关系，它们的偶合关系可以选择出来被J调制信号采样模块检测，同时偶合核的化学位移以及与非选择核的偶合关系在采样期被检测；而被多色π/2脉冲激发的核自旋的残留横向磁化矢量受到多色π脉冲翻转以及放置在脉冲和PSYCHE模块两边的一对同向散相梯度场作用下被滤除。

所述脉冲序列中J调制信号采样模块是由放置在同核自旋对间接偶合关系选择模块两侧的间接维演化时间t₁构成。由于前后相等的两部分演化期t₁/2及其中间同核自旋对选择模块形成自旋回波的信号演化，所选择出的核自旋的偶合核自旋在经此演化后完全消除了化学位移，只保留了所选择核自旋与偶合核自旋独立的J偶合信息，从而构成了采样信号沿F1维的信息，即二维J分解谱中J偶合信息维。

在步骤6)中，所述实验参数包括直接维谱宽SW、J调制信号模块中间接维演化期t₁、间接维点数ni、序列延迟时间RD、非选择性矩形π/2脉冲时间、多色π/2脉冲功率和时间、多色π脉冲功率和时间、PSYCHE模块中线型调频脉冲功率和时间、PSYCHE模块中梯度场强度及其作用时间、散相梯度场强度及其作用时间。所述序列延迟时间RD的设定范围为3～5s。

在步骤7)中，所述数据采样的具体过程为：首先脉冲序列延迟一段RD的时间，目的是为了让磁化矢量弛豫恢复过来；接着，脉冲序列的各个模块依次对样品进行作用演化，即选择出感兴趣的自旋进行激发并对其施加相位调制，通过相关转移模块将激发核自旋的横向磁化矢量及相位传递给其偶合核，偶合核在同核自旋对选择模块作用下在F1维仅保留与激发核的间接偶合关系，并在间接维演化期t₁进行信号演化，在采样期t₂采样最终信号。上述脉冲序列执行过程需要改变多色π/2脉冲中各个高斯形状脉冲的相位，即改变多色π/2脉冲的形状设置，每改一次多色π/2脉冲的形状，需要进行一次2D>

在步骤8)中，所述相关的数据后处理过程如下：(a)对多次二维谱实验数据重排，将每一次二维谱实验采样得到的数据按照相同的t₁时间分成一组块；(b)将(a)分块得到的数据沿采样次数维进行傅立叶变换；(c)将(b)变换得到的数据具有相同傅立叶变换域变量值的组成一组块，并按照t₁时间递增方式排列；(d)将(c)重排后的数据进行傅立叶变换，最终得到多张新型核磁共振二维J分解谱，每一张二维J分解谱F1维反映了一个选择自旋核与其偶合的所有自旋间独立的J裂峰情况，F2维反映偶合自旋与非选择自旋J裂峰情况。

本发明通过脉冲序列的设计利用同核自旋对选择模块和J调制信号采样模块来获得独立同核自旋对的J偶合关系，最终获得新型核磁共振二维J分解谱。同核自旋对选择模块中PSYCHE模块的使用有利于提高谱的信噪比。另外，通过激发脉冲相位傅立叶变换矩阵编码可同时多次采样多个感兴趣自旋的独立偶合自旋对，可以进一步提高最终核磁共振谱的信噪比。独立同核自旋对的J偶合信息有利于精确分析化学键角度和旋转情况，本发明能够克服选择核自旋受多个核自旋间接偶合的影响，直接检测出选择核自旋与所有偶合核独立间接偶合关系，且无需深奥的约束分子动力学计算以及特殊的硬件设备，可适用于任意常规核磁共振波谱仪，为化学、生物学结构提供了一种简便有效的手段。

附图说明

图1为用于检测独立同核自旋对间接偶合关系的核磁共振二维J分解谱脉冲序列，其中矩形条为非选择性π/2射频脉冲，高斯形状的条形分别为多色π/2脉冲PC₁和多色π脉冲PC₂。带箭头的梯形条为线性调频射频脉冲，总的翻转角为π，条纹填充的矩形块为沿Z方向线性梯度场G₁，G₂和G₃，t_1/2为间接维演化时间。

图2为α-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖化学结构式，以及葡萄糖混合物的常规J分解谱。

图3为本发明所提出的方法在葡萄糖混合物上所获得的α-D-葡萄糖上H₂所有独立自旋对间接偶合关系的新型二维J分解谱。

图4为本发明所提出的方法在葡萄糖混合物上所获得的β-D-葡萄糖上H₁₅所有独立自旋对间接偶合关系的新型二维J分解谱。

图5为本发明所提出的方法在葡萄糖混合物上所获得的α-D-葡萄糖上H₅和β-D-葡萄糖上H₁₇所有独立自旋对间接偶合关系的新型二维J分解谱。

图6为本发明所提出的方法在葡萄糖混合物上所获得的α-D-葡萄糖上H₃所有独立自旋对间接偶合关系的新型二维J分解谱。

图7为本发明所提出的方法在葡萄糖混合物上所获得的β-D-葡萄糖上H₂₃所有独立自旋对间接偶合关系的新型二维J分解谱。

具体实施方式

本发明所提出的方法能够克服选择核自旋受多个核自旋间接偶合的影响，直接检测出选择核自旋与所有偶合核独立间接偶合关系，最终获得新型二维J分解谱。该方法能省去深奥的约束分子动力学计算以及特殊的硬件设备，可适用于任意常规核磁共振波谱仪，为化学和生物学结构分析提供一种简便有效的方法。

本发明所用字符对照表参照下表：

本发明具体实施过程中的各个步骤如下：

步骤1，样品装样

将所检测的生物组织样品装入核磁试管并将其放入核磁谱仪检测磁体中。

步骤2，对样品进行匀场和锁场

利用谱仪自带的匀场和锁场功能实现样品的匀场和锁场。

步骤3，常规一维谱的采样

用核磁共振谱仪自带的常规一维脉冲序列采样得到一张一维谱，由一维谱获得谱图的谱宽。

步骤4，非选择性矩形π/2脉冲宽度测量

在一个固定功率下，测量常规一维脉冲序列中非选择性矩形π/2脉冲宽度，为多色脉冲、选择性脉冲以及绝热脉冲参数设置提供依据；

步骤5，脉冲序列的导入

在核磁共振谱仪操作台上，打开谱仪相应的操作软件，导入事先编译好的脉冲序列(如图1所示)，选择特定的实验区，然后调入上述脉冲序列，为下一步操作做准备。

步骤6，脉冲序列参数设置

首先打开所导入脉冲序列的各个相关模块，包括自旋相关转移模块、同核自旋对选择模块和J调制信号采样模块。接着根据检测样品实际情况设置相应的实验参数，包括直接维谱宽SW、J调制信号模块中间接维演化期t₁的点数ni、序列延迟时间RD、π/2非选择性矩形脉冲功率和时间、多色π/2脉冲功率和时间、多色π脉冲功率和时间、PSYCHE模块中线型调频脉冲功率和时间、PSYCHE模块中梯度场强度及其作用时间、散相梯度场强度及其作用时间。

步骤7，数据采样。

数据采样具体过程为：首先脉冲序列延迟一段RD的时间，目的是为了让磁化矢量弛豫恢复过来；接着，脉冲序列的各个模块依次对样品进行作用演化，即选择出感兴趣的自旋进行激发并对其施加相位调制，通过相关转移模块将激发核自旋的横向磁化矢量及相位传递给其偶合核，偶合核在同核自旋对选择模块作用下在F1维仅保留与激发核的间接偶合关系，并在间接维演化期t₁进行信号演化，在采样期t₂采样最终信号。上述脉冲序列执行过程需要改变多色π/2脉冲中各个高斯形状脉冲的相位，即改变多色π/2脉冲的设置，每改一次多色π/2脉冲，需要进行一次2D>

步骤8，数据后处理。

数据采样完成后，进行相关的数据后处理，具体过程如下：(a)对多次二维谱实验数据重排，将每一次二维谱实验采样得到的数据按照相同的t₁时间分成一组块；(b)将(a)分块得到的数据沿采样次数维进行傅立叶变换；(c)将(b)变换得到的数据具有相同傅立叶变换域变量值的组成一组块，并按照t₁时间递增方式排列；(d)将(c)重排后的数据进行傅立叶变换，最终得到多张新型核磁共振二维J分解谱，每一张二维J分解谱F1维反映了一个选择自旋核与偶合的所有自旋间独立的J裂峰情况，F2维反映偶合自旋与非选择自旋J裂峰情况。

以下给出一个具体实施例：

将本发明所提出的方法用于扫描α-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖的混合物作为一个实施例，用这个具体的实施例来验证本发明在测量独立自旋对间接偶合关系的可行性。实验测试是在一台Varian 500MHz NMR谱议(Varian,Palo Alto,CA)下进行，整个实验过程没有改动任何仪器硬件设施。按照上述本发明所提出方法的操作流程，首先用常规简单的一维脉冲序列采样得到一张一维谱，采样时间为4s，谱宽是1302.08Hz。然后用一维脉冲序列测得在发射机功率为62dB时，π/2非选择性脉冲持续时间为15.25μs。接着，用仪器自带的J谱序列采样的传统2D J分解谱如图2所示。从这张一维谱中只能获得自旋的裂峰情况，而无法获得自旋之间的间接偶合关系。然后，导入编译好的如图1所示脉冲序列，打开脉冲序列的各个相关模块，包括自旋相关转移模块、同核自旋对选择模块和J调制信号采样模块，设置实验参数。具体对于本实施例所采用的样品，其实验参数设置如下：直接维谱宽SW为1.30kHz，第一间接维谱宽SW1为60Hz，J调制信号采样模块中间接维演化期t₁的点数ni为64，序列延迟时间RD为3s，π/2非选择性矩形脉冲时间为15.25μs,线性调频射频脉冲激发功率13dB，激发频率范围6000Hz，持续时间15ms。梯度场强度为G₁＝16G/cm、G₂＝8G/cm和G₃＝0.75G/cm，其作用时间为σ₁＝σ₁＝σ₃＝0.5ms。为了在最短时间内测量出葡萄糖混合中所有独立自旋对的间接偶合关系，我们设置了四组实验，其中第一组实验选择化学位移为5.22ppm(α-D-葡萄糖上H₂)和3.23ppm(β-D-葡萄糖上H₁₅)的自旋，第二组选择化学位移为3.40ppm(α-D-葡萄糖上H₂和β-D-葡萄糖上H₁₇)的自旋，第三组选择化学位移为3.52ppm(α-D-葡萄糖上H₃)的自旋，第四组选择化学位移为3.88ppm(β-D-葡萄糖上H₂₃)自旋。每一组实验中根据选择自旋的化学位移及其与邻近自旋的化学位移差，设置自旋相关转移模块中π/2多色脉冲PC₁参数以及同核自旋对选择模块中π多色脉冲PC₂参数。在第一组实验中PC₁和PC₂均对准α-D-葡萄糖上H₂和β-D-葡萄糖上H₁₅，脉冲时间40ms，功率7dB，13dB。在第二组实验中PC₁和PC₂对准α-D-葡萄糖上H₅和β-D-葡萄糖上H₁₇，脉冲时间60ms，功率-2dB，4dB。在第三组实验中PC1和PC2对准α-D-葡萄糖上H₃，脉冲时间90ms，功率-6dB，0dB。在第四组实验中PC₁和PC₂对准β-D-葡萄糖上H₂₃，脉冲时间110ms，功率-7dB，-1dB。执行设置好的序列，第一组实验由于同时激发两个位置的自旋，激发脉冲PC₁受到二阶的傅立叶变换矩阵编码，因此需要进行两次的二维采样，两次采样到的数据根据t₁值分块，每一块做两点傅立叶变换后，再根据傅立叶变换频点值将数据分为两块，每一块都按照t₁递增顺序排列。对每一块数据作二维傅立叶变换获得的新型二维J分解谱，分别对应化学位移α-D-葡萄糖上H₂和β-D-葡萄糖上H₁₅自旋的间接偶合关系。如图3、4所示。第二至第四组实验设置完参数后采样，采样后的数据直接作二维傅立叶变换即可获得新型二维J分解谱，分别对应化学位移α-D-葡萄糖上H₅和β-D-葡萄糖上H₁₇、α-D-葡萄糖上H₃以及β-D-葡萄糖上H₂₃自旋的间接偶合关系，如图5-7所示。第一组的实验时间36min，第二至四组的实验时间分别是19min，19min，20min。

根据本方法所获得的新型二维J分解谱提供的F1和F2裂峰距离(如图3-7所示)，可测量葡萄糖混合物中各个独立H-H对的间接偶合关系，所归属的信息如表1所示：

表1.根据本发明提出方法所获得独立自旋对间接偶合关系

归属序号混合物偶合自旋对裂分方式J偶合常数(Hz)1α-D-葡萄糖2，3双重峰3.732α-D-葡萄糖3，4双重峰9.553α-D-葡萄糖4，5双重峰9.064α-D-葡萄糖5，6双重峰10.135α-D-葡萄糖6，11双重峰--6α-D-葡萄糖11，11双重峰--7β-D-葡萄糖14，15双重峰7.928β-D-葡萄糖15，16双重峰9.199β-D-葡萄糖16，17双重峰8.5810β-D-葡萄糖17，18双重峰9.2911β-D-葡萄糖18，23双重峰2.4712β-D-葡萄糖18，23双重峰5.7513β-D-葡萄糖23，23双重峰12.33

由于α-D-葡萄糖上H₆、H₁₁自旋的化学位移几乎重合，所以无法测量α-D-葡萄糖上H₆，₁₁，以及H_11，11之间的间接偶合关系。α-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖其余独立H-H自旋对的间接偶合关系均能测量。

上述实施例仅用来进一步说明本发明的一种测量独立同核自旋对间接偶合模式的方法，但本发明并不局限于实施例，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明技术方案的保护范围内。