一种在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子

摘要

本发明提供一种在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，所述启动子在种子发育过程中能够驱动目标基因特异表达，但当种子成熟后至干种子时，驱动活性消失。本发明还提供了含有该启动子的表达盒和植物表达载体及应用。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物转基因工程中，该启动子可以启动外源基因在植物中表达，适用于任何植物，尤其能够驱动外源基因在水稻植株的种子发育过程中特异表达，因此可以用于培育理想的水稻品种，提高水稻产量和品质。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域，特别涉及水稻种子特异性表达启动子及其应用。

背景技术

在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上。作为重要的繁殖器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表。种子的发育是从受精开始的，通过双受精过程，从花粉管尖端释放出的一个精子与卵细胞融合，形成二倍体的合子，发育成胚；另一个精子与两个极核融合后发育成三陪体的胚乳。这是一个从单细胞的受精卵分裂分化成多细胞个体的过程，其间伴随着特定基因的表达和积累。具体来讲，整个过程可分为早期胚胎发生(水稻等单子叶植物中包括球形胚期、早期器官分化和建成)，种子的成熟(包括胚乳的发育和大量贮藏蛋白的积累)和种子的休眠(此时种子脱水，大部分基因的转录和蛋白质的合成停止)。当种子在适当的温度和水分条件下，种子开始萌发。外部激素、温度和光照等因素影响着种子的发育和萌发过程。

在单子叶的禾本科植物中(如水稻、小麦)，随着种子的发育成熟，胚乳的体积不断增大，占据了种子的主要部分，其主要作用是贮存各类贮藏产物。胚乳发育是水稻种子发育中的一个非常重要的过程，这是因为该过程直接为人们提供了粮食来源。胚乳占糙米重量的90％，其发育情况直接决定了种子的重量和稻米的品质。水稻胚乳的主要成分是淀粉，简单的可以认为稻米品质取决于种子中淀粉的合成及积累的过程。

随着贮藏产物的大量合成和累积，胚体迅速增大，种子逐渐成熟。在胚发育的后期ABA开始累积。脱落酸(abscisic acid,ABA)是种子脱水和休眠的信号，以防止种子在成熟前的植株上萌发(precocious germintion)。在胚的成熟和休眠过程中，一些ABA诱导的基因开始转录，并引起大部分其他基因转录的停止，使胚的呼吸和代谢活动降至最低水平。当外部环境温度和水分适宜时，赤霉素(gibberellin,GA)开始增多，种子的代谢活动开始活跃，和萌发相关的基因逐渐表达。赤霉素和脱落酸的相互拮抗有效的控制了种子休眠和萌发的过程。

粮食短缺是本世纪最严重的全球性问题之一，近年来随着社会经济的快速发展和农业技术的不断提高，粮食短缺的问题得到缓解，但为了满足由于人口迅速增长而不断扩大的粮食需求，世界粮食总产量到2050年需要增加70％。中国粮食总产量到2033年需要提高35％。水稻作为重要的粮食作物之一，世界人口所需能量的21％，东南亚人口所需能量的76％均来自水稻。因此，提高水稻产量和改善稻米品质，具有重要的战略意义。水稻籽粒发育的好坏直接决定产量的高低和品质的优劣，而籽粒的灌浆充实过程决定了最终的粒重和产量乃至稻米的品质。围绕水稻籽粒灌浆充实差异问题，前人从＂源＂——物质的生产能力、＂流＂——茎銷物质的运转能力、＂库＂容活性——籽粒蔗糖-淀粉代谢关键酶活性、内源激素含量等方面开展了系统研究工作。越来越多的证据显示，库容活性与水稻弱势籽粒的灌浆充实关系密切。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过程。挖掘种子发育相关启动子，不仅有利于对水稻种子发育分子机制的了解，而且为在分子水平上操作水稻等禾谷类作物的种子发育过程，改良禾谷类作物的产量和品质创造条件。

水稻抽穗后光合产物主要以可溶性糖的形式运输到胚乳细胞，用于淀粉粒的形成，随着子房的发育，籽粒长、宽、重迅速增加。开花至成熟1个月左右的时间是水稻籽粒发育成熟的主要阶段，此时籽粒的灌浆充实动态直接关系到水稻产量与品质。

若是能够仅仅在水稻种子在发育到成熟期间促进种子的发育，而在种子成熟之后，不再对种子的发育施加影响，则既能够促进种子生长，又预留足够的时间给水稻消化转基因所带来的代谢影响以及其他方面负面影响。

但是，现有启动子往往都是在植物生长的全周期发挥作用，启动子容易对植物的代谢带来较大的负担，影响植物生长，并且由于启动子作用的长期性，更容易引起人们对转基因作物的担忧。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在植物生长的特定时期，尤其是水稻生长的特定时期发挥作用的启动子。水稻种子发育特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子，其特征在于，所述水稻种子特异表达启动子包含下述(1)-(4)中任一项所示的序列，

(1)SEQ ID No:1所示的序列；

(2)与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80％同源性的序列；

(3)在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；

(4)在严格条件下与(1)、(2)或(3)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA序列。

序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)的水稻种子特异性表达启动子，本文中称为Posendos7或启动子Posendos7。

另一方面，本发明还提供一种包含上述在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子的表达盒和重组表达载体。

再一方面，本发明提供上述在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于培育理想水稻品种，改良水稻的品质和产量。

具体实施中，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到结构包括转录起始位点上游的1960bp的DNA序列，并将其命名为Posendos7(序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1381上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，用于驱动GUS基因的表达。利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，在未成熟的转基因植株的种子中有明显的GUS染色，而在其他组织中没有染色。同时，当水稻籽粒灌浆完成，成为成熟种子后，种子中GUS染色又消失，从而证明该1960bp的序列具有驱动基因在种子发育中表达的活性。

此外，由于本发明的启动子在种子成熟期活性消失，所以，本申请的发明人还提出了一种能够降低转基因影响的水稻培育方法，利用本发明所获得的启动子，与具有提高种子淀粉或蛋白质含量的基因相结合，构建重组表达载体，然后将所述重组表达载体转入到水稻细胞中，培育转基因植株，所获得的转基因植株在生长过程中，在启动子的作用下，能够改善种子的发育，但是当种子进入成熟期后，启动子活性消失，进而预留一定时间段使转基因的影响逐渐降低。

此外，本发明提供一种促进水稻灌浆期种子发育的水稻培育方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)获取所述的在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子；

(2)取成熟水稻种子，进行愈伤诱导培养；

(3)构建含有权利要求1中所述的在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子的重组表达载体，在该重组表达载体中，所述水稻种子特异性启动子连接至预定促进种子发育的基因的上游；

(4)将所获得重组表达载体转入根癌农杆菌；

(5)对步骤(2)中所获得的愈伤培养组织利用转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化；

(6)将转化后获得的愈伤组织进行分化和生根培养获得转基因幼苗；

(7)将鉴定为阳性的幼苗进行培育，获得转基因水稻，在所述水稻发育过程中，在水稻灌浆期所述水稻种子特异性启动子诱导促进种子发育的基因特异性表达，直至种子发育成熟。

优选地，所述促进种子发育的基因包括：SHB1基因。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子Posendos7能够调控靶标基因在种子灌浆过程中特异性表达，当种子成熟期，种子中该启动子的活性消失，并且在其他植株的其他组织如根茎叶等中不表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子代替组成型启动子，调控目标基因在植株中表达，从而培育出理想的转基因水稻品种，如改变水稻籽粒中的蛋白和淀粉含量，提高种子的发育速度等。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将Posendos7启动子构建于pCAMBIA1381载体质粒中的示意图，图中A为pCAMBIA1381示意图，B为pCAMBIA1381-Posendos7示意图；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为Posendos7::GUS转基因水稻植株组织染色图。经24小时GUS染色后，根(A)、茎(B)、叶(C)、叶鞘(D)和花(E)均无GUS活性，而在非成熟种子的胚和胚乳(F)中均有GUS强烈表达(标尺＝2.5mm)。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

步骤1、野生型水稻日本晴基因组DNA提取

按照天根(北京)试剂盒提供的方法提取野生型日本晴基因组DNA。具体步骤如下：

1.处理材料：取植物新鲜组织100mg，加入液氮充分碾磨。加入400μl缓冲液FGA和6μl RNase A(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min。

2.加入130μl缓冲液LP2，充分混匀，旋涡振荡1min。

3.12,000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中。

4.加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀。

5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

6.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.重复操作步骤6。

8.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

9.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。得到的溶液即为水稻基因组DNA。

步骤2、启动子Posendos7的获得和植物表达载体的构建

依据水稻Posendos7启动子的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，引物由深圳华大基因公司合成，序列如下：

正向引物：AAGCTTGCTTGATTCATAGTTGCGACTA>

反向引物：GGATCCCGCTATCAACACACAACACGCA>

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子Posendos7，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，最终获得目的片段长度1960bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和BamHI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子Posendos7，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

回收启动子Posendos7片段，同时利用HindIII和BamHI对进行线性化处理和回收pCAMBIA1381载体片段，将上述的Posendos7片段和pCAMBIA1381片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子Posendos7与GUS基因融合的植物表达载体pCAMBIA1381-Posendos7(图1)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，获得含有pCAMBIA1381-Posendos7的农杆菌。

步骤3、阳性转基因植株获得

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述步骤2中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol forAgrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerasepositive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法，共获得24株pCAMBIA1391-Posseed阳性植株。本发明的遗传转化步骤、培养基及配置方法如下所述：

1、遗传转化所用培养基：

(1)诱导培养基：N6majors，MS iron salts，B5vitamins，B5minors，500mg/Lglutamine，500mg/L proline，500mg/L casein enzymatic hydrolysate，3g/L phytagel，2mg/L 2，4-D，30g/L sucrose，PH 5.8。

(2)共培养培养基：N6majors，MS iron salts，B5vitamins，B5minors，500mg/Lproline，500mg/L casein enzymatic hydrolysate，2mg/L 2，4-D，30g/L sucrose，100ul/L acetosyingone，4g/L phytagel，PH 5.2。

(3)恢复培养基：N6majors，MS iron salts，B5vitamins，B5minors，500mg/Lglutamine，500mg/L proline，500mg/L casein enzymatic hydrolysate，3g/L phytagel，2mg/L 2，4-D，30g/L sucrose，PH 5.8，250mg/L carbencillin。

(4)筛选培养基：N6majors，MS iron salts，B5vitamins，B5minors，500mg/Lglutamine，500mg/L proline，500mg/L casein enzymatic hydrolysate，3g/L phytagel，2mg/L 2，4-D，10g/L sucrose，20g/L Mannose，250mg/L carbencillin，25mg/Lhygromycin，PH 5.8

(5)分化培养基：N6majors，MS iron salts，B5vitamins，B5minors，500mg/Lglutamine，500mg/L proline，500mg/L casein enzymatic hydrolysate，500mg/L MES，2g/L phytagel，2mg/L 2，4-D，30g/L sucrose，30g/L sorbitol，2.5mg/L CuSO₄，0.5mg/LKT，250mg/L>

(6)生根培养基：1/2MS basal salts(2.165g/L)，B5vitamins，1.0g/L caseinenzymatic hydrolysate，20g/L sucrose，3.5g/L phytagel，0.2mg/L NAA，125mg/Lcarbencillin，25mg/L hygromycin，PH 5.8。

(7)Inoue缓冲液：10.88g MnCl₂、2.20g>2、18.65g>

2、遗传转化步骤：

(1)愈伤组织诱导：对日本晴种子用酒精、次氯酸钠+Tween20分别进行消毒，消毒后的种子用清水洗净，置于30℃黑暗条件下用无菌水浸泡过夜。过夜的种子在无菌条件下，用解剖刀将其胚切下，放置于事先配好的诱导培养基上，30℃黑暗条件下培养。每一皿培养基中大致放12～15个种子的胚(培养皿的规格为100×25mm的一次性无菌塑料培养皿，内含50mL诱导培养基)。培养时间为2～3周，期间注意将污染的种子取出。直到诱导出淡黄色颗粒状愈伤为止。

(2)预培养：从诱导培养基上挑选颗粒状的愈伤组织置于新的诱导培养基上，做侵染前的预培养，于30℃黑暗条件下培养3～5d。与此同时将冻存的表达载体农杆菌活化两次备用。

(3)侵染及共培养：将农杆菌转入侵染液中，充分振荡混匀，测量OD值为0.2备用。同时，将预培养的愈伤转入无菌的50ml管中，所需愈伤的量大致在15ml刻度的位置(因需求量会变化)。向愈伤中加入农杆菌侵染液，使其充分接触浸泡15～20min。倒出液体，用无菌滤纸充分吸干愈伤组织上的菌液(防止农杆菌残留而造成的污染)。将侵染完成的愈伤组织均匀的转入预先准备的共培养培养基中，于23℃的黑暗培养箱中共培养2d。

(4)恢复：将共培养2d的愈伤组织在超净工作台中转移至恢复培养基上，于30℃黑暗培养箱中培养3～5d。在此过程中，操作必须严格无菌，并且放置在培养基上的愈伤尽量做到均匀和不重叠，以防止交叉污染。

(5)筛选：从恢复3～5d的愈伤中，挑取不带菌斑呈现金黄色且干燥的胚性愈伤组织接种到筛选培养基上，每皿筛选培养基上大致放30粒左右的愈伤颗粒。操作中尽量避免一些染菌和无生命活力的愈伤颗粒。筛选条件为30℃黑暗培养箱中，培养2～3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤。

(6)分化：将每皿分化培养基分为5处，从筛选培养基上选取经过潮霉素B筛选后生长出新的愈伤颗粒，将其转移至分化培养基上，同一个转化事件的愈伤颗粒放置于分化培养基的同一处，每处放置3个独立的胚性愈伤颗粒即可。在这一过程中，应避免重复挑选同一筛选出处至两处和不同筛选出处至一处的情况。分化条件为30℃光照培养室培养3～4周(光照条件为16h光照+8h黑暗)，待幼苗长出。

(7)生根：将每一区域分化得到的小苗转移至配制好的生根培养基中，在30℃光照培养室(16h光照+8h黑暗)培养三周左右。在此期间对小苗进行基因组DNA的提取和PCR鉴定。

(8)将鉴定为阳性的小苗移栽至田间继续生长，至成熟收获。

步骤4、水稻种子发育特异性启动子的活性鉴定

将Posendos7::GUS转基因植株的组织器官，即根、茎、叶、叶鞘、花和非成熟种子、成熟种子分别进行GUS染色。参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。75％乙醇脱色，将组织中的叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录GUS染色的结果。结果如图3所示，GUS基因在转基因水稻非成熟的种子的胚和胚乳(图3F)部位显现出可明显观测到蓝色，在其它各器官根(A)、茎(B)、叶(C)、叶鞘(D)、花(E)和成熟种子中，均没有检测到GUS基因的表达。

该实验验证了本发明所获得启动子的特殊性状。本发明的启动子可以成功地在水稻的发育期，尤其是灌浆期驱动目的基因特异性表达，而一旦水稻种子进入成熟期，则其表达特异性消失。这种特殊性状的价值不可估量。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 一种在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子

<130> HCI20170110

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1960

<212> DNA

<213> 在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子

<400> 1:

gcttgattca tagttgcgac taatatgtcg acgccaaaaa tgattctatt agccaaccag 60

ctaaccgggt cgtctatcat catgatcctc gtattaggta agtattgcct ctttcttgac 120

aattcattaa tttttcggaa atagaactga attctattat tttcaatcta tatttggttc 180

attatcaact tcgatttgat caacctctta ggcgttgcaa ccagctcctt ccacacagga 240

cccctccctt caccgccccc ggcctccatg ctgtgtccac cacaatcacc ggtaacgtgc 300

cctttccctc cgtcagtaca acgcaacatg caaacaagaa ctagttaagt cttgtccggg 360

accaaacaaa atccaaccat tgaatacgaa gttattctca ccgtgcacag ctgcagagca 420

aacaccaatc acacgagtga ggaaaacata acgcatgagt cgatgagcag tgtggggacc 480

tataggcaac cggcatcaag attcaagtta ttcataaaaa gaaaatttta catagctaca 540

tataacaact taacaactta acatgatgca tgtctaaata aattcgatct agatcctcga 600

tttttagatc taatttaacc tctcatgtat agattttata tcattatttt cagtcgtatg 660

taatagcggg gctactgtaa aaaaaaaaca tgtccagtta tttccacggt caccattttt 720

gctaggcaca cctgtttcca tgatcctata tctcacccgt gtgcagatcg cccctgtgat 780

ccgcacatca aaacctccag tcctctacag tagcaaggag taaaccacag atccaacggg 840

cgccaggcat gcatgcacag ctatcatcgg tcgatcacgc gatgcacccg cacacacggg 900

cccacggcgc acacttagcg gtacacgtgt acggcagagg cgtagaaacg gtaagcctct 960

ctctgtgctg tctcgcacca ttccagaacc gttccagttc acttcccccc aagcaaacaa 1020

aagcactgca aagctagcta gctagcgctg catgcaacgc acggcactgg tggccgggtg 1080

gacggacggt cgttgctagc ttgaccagcc gtgtgcgcgg cgcgccccag tcccggacga 1140

caagaaaccc cccggcccgg ttcacttccg cgcgcggggc ggtgcgcgcc ccacatcgca 1200

ccgcgcgctg cacgcacgca cgtacgcgca cgcacacgcg acgcaagcgc agccgcccgc 1260

accgcacgca ggtgcaaagc cgcaaacaac aaaacgctcc cccgtcacct cccaccactg 1320

catgcgagga agcgtgcggg ggaccaccgt cggtgtggtg gtccaccccg aggcaagcta 1380

cgtacgtcgc gcgccggccg cgccgcccgt tgggctgcat gctggcttgc gtcgcgtcgc 1440

gtcgttggga cgcccgggga ggaaaaggcg cagctagcgg aaaccgccac ccggccccgg 1500

agcagcgcgc gccgcgcggg gtccgtttcg tccgaccccg atcgatcgat caaccggcca 1560

cggccgtccg tctgcacgaa gcatttccat ccaccacacg cgtacgtccc cgtcacgcga 1620

tcccatctcg gtcccctggc ccctgcagtg acgcgatcat atgcatgaat gtacgtgcgt 1680

gctctctctc gtgtggtctg gtccgcgcgc tcgtgtataa ataggcccgg ccggtcgcgt 1740

tcacctcccc acgctgctcc tcgatcggct ctctcgcgct ccctgatcat tcctggctgg 1800

ttcgtacgtt gtgattgatc gagagatcgg cgttgcacgg tgagcatgca tgcagcttcg 1860

cgttcggtaa tggctgggtt ttccccgttg gttatttccc gtgagattct tactacttct 1920

tctcgtacta tacgtcgttg cgtgttgtgt gttgatagcg 1960

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 2:

aagcttgctt gattcatagt tgcgacta 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 3:

ggatcccgct atcaacacac aacacgca 28