基于丝素蛋白生物模板调控的氧化锌纳米颗粒制备方法

摘要

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种基于丝素蛋白生物模板调控的氧化锌纳米颗粒制备方法，包括以下步骤：S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；S2，将锌盐溶液以及碱溶液混合得到混合溶液；S3，将步骤S1中所得的丝素蛋白水溶液加入到步骤S2中的混合溶液中充分反应；S4，将步骤S3反应后的溶液进行洗涤、烘干后得到氧化锌纳米颗粒。丝素蛋白作为生物模板调控纳米氧化锌颗粒的大小以及形貌，得到的纳米氧化锌颗粒粒径小，形貌不规则，提高抗菌性能，且操作方法简单，成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种基于丝素蛋白生物模板调控的氧化锌纳米颗粒制备方法。

背景技术

抗生素的使用可以显著提高人类对致病病菌的抵抗力，然而随着人们对抗生素的滥用，一些致病菌对抗生素产生了一定的耐药性，影响了抗生素的治疗效果。与常用的抗生素相比，无机抗菌材料具有安全性高、持久性强、抗菌性能稳定和耐热性好等方面的优点。其中，纳米氧化锌具有良好的生物相容性、免疫调节能力和抗菌性，在抗菌应用过程中具有用量少和抗菌效率高且成本低廉等优点。

纳米ZnO的抗菌机制主要为：(1)纳米ZnO颗粒黏附在细菌膜表面，导致菌膜破损；(2)溶出产生锌离子，与菌体蛋白酶结合使其失活；(3)ZnO在阳光或紫外线照射下，可产生活性氧自由基，起溶菌作用而产生抗菌作用。纳米ZnO粒子表面能、锌离子溶出速率以及产生氧自由基的化学活性，与颗粒尺寸和其表面形貌有密切联系，因此ZnO的抗菌性能具有一定的粒径依赖性，采用不同的制备方法合成特定形貌、尺寸可控的纳米氧化锌颗粒对推动ZnO在抗菌方面的研究和应用具有重要意义。

目前，人们已经采用化学气相法、溶胶-胶法、直接沉降法、水热法等制备出具有不同形貌和结构的ZnO纳米材料，但是对于如何调控ZnO颗粒的尺寸和形貌一直是国内外的技术难题。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种ZnO纳米颗粒的制备方法，解决现有技术中难以调控氧化锌纳米颗粒粒径和形貌的问题。

(二)技术方案

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于丝素蛋白生物模板调控的氧化锌纳米颗粒制备方法，包括以下步骤：

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；

S2，将锌盐溶液以及碱溶液混合得到混合溶液；

S3，将步骤S1中所得的丝素蛋白水溶液加入到步骤S2中的混合溶液中充分反应；

S4，将步骤S3反应后的溶液进行洗涤、烘干后得到氧化锌纳米颗粒。

丝素蛋白(Silk Fibroin)是经过家蚕脱胶处理后得到的天然高分子纤维蛋白，主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸组成(占总量的95％以上)，分为Silk I和Silk II两种构象。Silk I构象是一种介于α-螺旋和β-折叠的中间形态，为无规卷曲结构和由链内氢键作用产生；Silk II构象则为反平行β-折叠(β-sheet)构象，结构内肽链排列整齐，链断间具有较强的氢键作用和分子间作用力。Silk I构象结构不稳定，极易转变为Silk II构象。丝素蛋白结构可控性强，富含氨基和羧基等极性官能团，提取过程条件温和、过程简单、价格低廉、环境友好，是纳米材料合成过程中理想的生物模板材料。加入丝素蛋白制备的氧化锌纳米颗粒粒径小、形貌更加不规则，提高了纳米氧化锌的表面能，提升了纳米氧化锌颗粒的抗菌性能。

优选地，所述步骤S1中，所述丝素蛋白水溶液的质量体积分数为6～7w/v％。

优选地，所述步骤S1包括：

S11，用Na2CO3溶液对蚕茧进行脱胶；

S12，用LiBr水溶液将步骤S11所得的脱胶后的丝素蛋白溶解，并经过透析后得到丝素蛋白水溶液。

优选地，所述步骤S3中还包括：将步骤S1中所得的丝素蛋白水溶液加入到步骤S2所得的混合溶液中得到的溶液加入水反应釜中，控制在设定温度下反应设定时长。本方案在加入丝素蛋白的基础上采用水热法制备纳米氧化锌颗粒，以水为溶剂，在一定温度和压强下，可以驱动ZnO晶体成核、生长和结晶。水热法操作方法简单，反应条件温和，无污染。

优选地，所述步骤S2中锌盐溶液为硝酸锌溶液，所述碱溶液为六次四甲基合胺。其中，锌盐溶液的溶质选自易热分解的锌盐或锌盐水合物，如醋酸锌、硫酸锌、六水硝酸锌等可溶性锌盐，碱溶液可以为氢氧化钠、氨水等碱溶液。本方案中选用六次四甲基合胺作为碱溶液，碱溶液中氢氧根离子的释放速率慢，丝素蛋白对纳米氧化锌颗粒的形成有充分的调控时间，避免氧化锌颗粒团簇，有助于形成粒径更小的纳米氧化锌颗粒。

优选地，所述硝酸锌溶液的浓度为0.01～0.1mol/L，所述六次四甲基合胺的浓度为0.01～0.1mol/L。

优选地，所述步骤S2中所述硝酸锌溶液与所述六次四甲基合胺等体积混合。

优选地，所述步骤S3得到的溶液中所述丝素蛋白浓度为0.2～4mg/ml。

优选地，所述步骤S3中反应温度为90～200℃，反应时间为4h。

优选地，所述步骤S4中洗涤次数为3～5次，烘干温度为60℃。

(三)有益效果

本发明的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：本发明在纳米氧化锌颗粒制备时加入丝素蛋白调控氧化锌晶化早期团簇结构并诱导其纳米晶化成核、生长和分级自组装，制备的氧化锌纳米颗粒粒径小、形貌更加不规则，提高了纳米氧化锌的表面能，提升了纳米氧化锌颗粒的抗菌性能，并且制备过程简单易于实现，成本低。

附图说明

图1(a)是本发明实施例一得到的氧化锌纳米颗粒的扫描电镜图；

图1(b)是本发明实施例二得到的氧化锌纳米颗粒的扫描电镜图；

图1(c)是本发明实施例三得到的氧化锌纳米颗粒的扫描电镜图；

图1(d)是本发明实施例四得到的氧化锌纳米颗粒的扫描电镜图；

图1(e)是同等条件下不加入丝素蛋白得到的氧化锌纳米颗粒与加入丝素蛋白得到的氧化锌纳米颗粒形貌类比示意图；

图2(a)是本发明实施例五得到的氧化锌纳米颗粒的扫描电镜图；

图2(b)是本发明实施例六得到的氧化锌纳米颗粒的扫描电镜图；

图2(c)是本发明实施例七得到的氧化锌纳米颗粒的扫描电镜图；

图2(d)是本发明实施例八得到的氧化锌纳米颗粒的扫描电镜图；

图3(a)是本发明实施例九得到的氧化锌纳米颗粒的扫描电镜图；

图3(b)是本发明实施例十得到的氧化锌纳米颗粒的扫描电镜图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；具体为：

S11，将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02mol/L Na2CO3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干；

S12，将步骤S11制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9mol的LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v％的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在4℃冰箱中待用；

S2，配置浓度为0.01mol/L六次四甲基合胺和浓度为0.01mol/L硝酸锌溶液，各取19ml等体积混合得到38mL；

S3，将步骤S1所得丝素蛋白溶液加入混合溶液中，使溶液总体积达到40mL且丝素蛋白浓度为0.2mg/ml；

S4，将步骤S3所得溶液加入容积为50mL的水热反应釜中，控制反应温度90℃，反应时间4h，自然冷却；取出冷却后反应釜中溶液，去离子水离心洗涤3～5次，60℃烘干，得到ZnO纳米颗粒粉末。

采用该实施例的制备方法得到氧化锌纳米颗粒如图1(a)所示。

实施例二

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；具体为：

S11，将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02mol/L Na2CO3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干；

S12，将步骤S11制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9mol的LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v％的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在4℃冰箱中待用；

S2，配置浓度为0.01mol/L六次四甲基合胺和浓度为0.01mol/L硝酸锌溶液，各取19ml等体积混合得到38mL；

S3，将步骤S1所得丝素蛋白溶液加入混合溶液中，使溶液总体积达到40mL且丝素蛋白浓度为1mg/ml；

S4，将步骤S3所得溶液加入容积为50mL的水热反应釜中，控制反应温度90℃，反应时间4h，自然冷却；取出冷却后反应釜中溶液，去离子水离心洗涤3～5次，60℃烘干，得到ZnO纳米颗粒粉末。

采用该实施例的制备方法得到氧化锌纳米颗粒如图1(b)所示。

实施例三

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；具体为：

S11，将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02mol/L Na2CO3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干；

S12，将步骤S11制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9mol的LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v％的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在4℃冰箱中待用；

S2，配置浓度为0.01mol/L六次四甲基合胺和浓度为0.01mol/L硝酸锌溶液，各取19ml等体积混合得到38mL；

S3，将步骤S1所得丝素蛋白溶液加入混合溶液中，使溶液总体积达到40mL且丝素蛋白浓度为2mg/ml；

S4，将步骤S3所得溶液加入容积为50mL的水热反应釜中，控制反应温度90℃，反应时间4h，自然冷却；取出冷却后反应釜中溶液，去离子水离心洗涤3～5次，60℃烘干，得到ZnO纳米颗粒粉末。

采用该实施例的制备方法得到氧化锌纳米颗粒如图1(c)所示。

实施例四

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；具体为：

S11，将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02mol/L Na2CO3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干；

S12，将步骤S11制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9mol的LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v％的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在4℃冰箱中待用；

S2，配置浓度为0.01mol/L六次四甲基合胺和浓度为0.01mol/L硝酸锌溶液，各取19ml等体积混合得到38mL；

S3，将步骤S1所得丝素蛋白溶液加入混合溶液中，使溶液总体积达到40mL且丝素蛋白浓度为4mg/ml；

S4，将步骤S3所得溶液加入容积为50mL的水热反应釜中，控制反应温度90℃，反应时间4h，自然冷却；取出冷却后反应釜中溶液，去离子水离心洗涤3～5次，60℃烘干，得到ZnO纳米颗粒粉末。

采用该实施例的制备方法得到氧化锌纳米颗粒如图1(d)所示。

结合上述实施例一至实施例四所得到氧化锌纳米颗粒，随着丝素蛋白浓度的增加，氧化锌纳米颗粒的形貌由圆柱体转变为由六棱柱形组成的二聚体结构。图1(e)给出了同等条件下不加入丝素蛋白得到的氧化锌纳米颗粒与加入丝素蛋白得到的氧化锌纳米颗粒形貌类比示意图，其中d表示氧化锌纳米颗粒的直径，t表示氧化锌纳米颗粒的长度，由图1(a)-图1(d)可以看出随着丝素蛋白的浓度增加，氧化锌纳米颗粒的直径和长度均逐渐减小。

实施例五

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；具体为：

S11，将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02mol/L Na2CO3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干；

S12，将步骤S11制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9mol的LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v％的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在4℃冰箱中待用；

S2，配置浓度为0.01mol/L六次四甲基合胺和浓度为0.05mol/L硝酸锌溶液，各取19ml等体积混合得到38mL；

S3，将步骤S1所得丝素蛋白溶液加入混合溶液中，使溶液总体积达到40mL且丝素蛋白浓度为0.2mg/ml；

S4，将步骤S3所得溶液加入容积为50mL的水热反应釜中，控制反应温度90℃，反应时间4h，自然冷却；取出冷却后反应釜中溶液，去离子水离心洗涤3～5次，60℃烘干，得到ZnO纳米颗粒粉末。

采用该实施例的制备方法得到氧化锌纳米颗粒如图2(a)所示。

实施例六

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；具体为：

S11，将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02mol/L Na2CO3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干；

S12，将步骤S11制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9mol的LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v％的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在4℃冰箱中待用；

S2，配置浓度为0.01mol/L六次四甲基合胺和浓度为0.1mol/L硝酸锌溶液，各取19ml等体积混合得到38mL；

S3，将步骤S1所得丝素蛋白溶液加入混合溶液中，使溶液总体积达到40mL且丝素蛋白浓度为0.2mg/ml；

S4，将步骤S3所得溶液加入容积为50mL的水热反应釜中，控制反应温度90℃，反应时间4h，自然冷却；取出冷却后反应釜中溶液，去离子水离心洗涤3～5次，60℃烘干，得到ZnO纳米颗粒粉末。

采用该实施例的制备方法得到氧化锌纳米颗粒如图2(b)所示。

实施例七

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；具体为：

S11，将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02mol/L Na2CO3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干；

S12，将步骤S11制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9mol的LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v％的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在4℃冰箱中待用；

S2，配置浓度为0.01mol/L六次四甲基合胺和浓度为0.05mol/L硝酸锌溶液，各取19ml等体积混合得到38mL；

S3，将步骤S1所得丝素蛋白溶液加入混合溶液中，使溶液总体积达到40mL且丝素蛋白浓度为1mg/ml；

S4，将步骤S3所得溶液加入容积为50mL的水热反应釜中，控制反应温度90℃，反应时间4h，自然冷却；取出冷却后反应釜中溶液，去离子水离心洗涤3～5次，60℃烘干，得到ZnO纳米颗粒粉末。

采用该实施例的制备方法得到氧化锌纳米颗粒如图2(c)所示。

实施例八

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；具体为：

S11，将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02mol/L Na2CO3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干；

S12，将步骤S11制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9mol的LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v％的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在4℃冰箱中待用；

S2，配置浓度为0.01mol/L六次四甲基合胺和浓度为0.1mol/L硝酸锌溶液，各取19ml等体积混合得到38mL；

S3，将步骤S1所得丝素蛋白溶液加入混合溶液中，使溶液总体积达到40mL且丝素蛋白浓度为1mg/ml；

S4，将步骤S3所得溶液加入容积为50mL的水热反应釜中，控制反应温度90℃，反应时间4h，自然冷却；取出冷却后反应釜中溶液，去离子水离心洗涤3～5次，60℃烘干，得到ZnO纳米颗粒粉末。

采用该实施例的制备方法得到氧化锌纳米颗粒如图2(d)所示。

结合上述实施例一、五、六以及实施例二、七、八可以看出随着硝酸锌浓度的增加，六棱柱-二聚体结构氧化锌的直径与长度均逐渐减小。

实施例九

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；具体为：

S11，将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02mol/L Na2CO3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干；

S12，将步骤S11制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9mol的LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v％的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在4℃冰箱中待用；

S2，配置浓度为0.01mol/L六次四甲基合胺和浓度为0.01mol/L硝酸锌溶液，各取19ml等体积混合得到38mL；

S3，将步骤S1所得丝素蛋白溶液加入混合溶液中，使溶液总体积达到40mL且丝素蛋白浓度为1mg/ml；

S4，将步骤S3所得溶液加入容积为50mL的水热反应釜中，控制反应温度150℃，反应时间4h，自然冷却；取出冷却后反应釜中溶液，去离子水离心洗涤3～5次，60℃烘干，得到ZnO纳米颗粒粉末。

采用该实施例的制备方法得到氧化锌纳米颗粒如图3(a)所示。

实施例十

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；具体为：

S11，将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02mol/L Na2CO3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干；

S12，将步骤S11制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9mol的LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v％的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在4℃冰箱中待用；

S2，配置浓度为0.01mol/L六次四甲基合胺和浓度为0.01mol/L硝酸锌溶液，各取19ml等体积混合得到38mL；

S3，将步骤S1所得丝素蛋白溶液加入混合溶液中，使溶液总体积达到40mL且丝素蛋白浓度为1mg/ml；

S4，将步骤S3所得溶液加入容积为50mL的水热反应釜中，控制反应温度200℃，反应时间4h，自然冷却；取出冷却后反应釜中溶液，去离子水离心洗涤3～5次，60℃烘干，得到ZnO纳米颗粒粉末。

采用该实施例的制备方法得到氧化锌纳米颗粒如图3(b)所示。

结合上述实施例二、九、十制备得到的氧化锌纳米颗粒显微形貌图可以看出随着反应温度的升高，由于丝素蛋白的变形水解，所得产物水溶液颜色加深，六棱柱-二聚体结构的氧化锌的直径与长度逐渐减小。

实施例十一

S1，将蚕茧脱胶后溶解，制备丝素蛋白水溶液；具体为：

S11，将桑蚕茧剪碎，称取5g桑蚕茧，然后将其置于2L浓度为0.02mol/L Na2CO3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋白数次，并自然晾干；

S12，将步骤S11制备的丝素蛋白在60℃下溶解于9mol的LiBr约4h，待丝素蛋白完全溶解后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v％的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放在4℃冰箱中待用；

S2，配置浓度为0.1mol/L六次四甲基合胺和浓度为0.1mol/L硝酸锌溶液，各取19ml等体积混合得到38mL；

S3，将步骤S1所得丝素蛋白溶液加入混合溶液中，使溶液总体积达到40mL且丝素蛋白浓度为1mg/ml；

S4，将步骤S3所得溶液加入容积为50mL的水热反应釜中，控制反应温度90℃，反应时间4h，自然冷却；取出冷却后反应釜中溶液，去离子水离心洗涤3～5次，60℃烘干，得到ZnO纳米颗粒粉末。

采用该实施例的制备方法得到氧化锌纳米颗粒与图1(e)中得到的氧化锌纳米颗粒形貌相似。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。