肠道及口腔菌群多样性及差异性的分析方法

摘要

本发明提供了一种基于新一代高通量测序技术的肠道及口腔菌群多样性及差异性的分析方法。该方法包括如下步骤：1)收集待测样本并进行微生物基因组DNA提取，得到基因组DNA提取液；2)对基因组DNA提取液进行检测确定样本中微生物基因组DNA的浓度和纯度；3)利用16SrDNA特异的V3‑V4区引物对基因组DNA提取液进行PCR扩增，进行文库构建，4)利用IlluminaMiSeq测序系统进行测序；5)利用FLASH，QIIME，usearch61进行生物信息学分析。与传统菌群检测方法相比，应用新一代高通量技术能够更详细、更深层地解析菌群的组成与功能。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于新一代高通量测序技术的疾病患者肠道及口腔微生物多样性及差异性的检测的技术和方法。

背景技术

人体大部分的生理功能是人本身与微生物群共同进化过种中形成的共生生活的结果，健康人体存在着多种正常的微生物群落，他们与宿主存在着共生关系，共同维护着宿主的生理平衡。一旦宿主与微生物之间共栖共生的稳态被打破，就会诱发多种人类疾病。目前已经认识到肠道和口腔微生物与人类健康和疾病的密切关系，因此，仅仅从人类自身角度出发来研究人类疾病远远不够，必须考虑到与人类共栖共生的肠道微生物的作用。

传统的研究微生物的方法主要依赖于分离培养技术，但是人体内可培养的细菌只占细菌总数很小一部分，大部分的微生物是难以培养的，故我们应用目前的分离培养技术很难深入了解人体菌群整体结构及其宿主之间的相互关系。随着分子生物学的发展，使人们全面了解各生境内的菌群结构和功能成为可能。

随着二代测序技术在疾病领域研究的发展，以微生物菌群为靶点的治疗方案就是精准医疗非常重要的一个体现。它主要以每位患者的个体化数据为基础，通过对病人身体相关微生物组如肠道，口腔，皮肤等进行大规模测序，生物信息学分析后并挖掘每位患者病理学、生理学和病理生理学等方面的特点，进一步制定出适合每位患者的独特的、最佳的治疗和预防方案，提高治疗的针对性，从而取得最优的疗效。

本发明以儿童自闭症为例进行说明。儿童孤独症或称自闭症，是一种广泛性发展障碍，以严重的、广泛的社会相互影响和沟通技能的损害以及刻板的行为兴趣和活动为特征的精神疾病。目前自闭症患者已达6700万人，中国的自闭症患儿也已超过100万人，且患病率逐年上升。自闭症的主要病症包括不正常的社交能力、沟通能力、兴趣及行为模式，其病因尚不明确。有研究显示，孤独症和肠道菌群失调有关。

发明内容

本发明的目的即在于提供一种针对疾病患者肠道及口腔菌群的多样性及差异性的检测方法。

本发明的再一个目的是提供一种通过设计特异性引物(人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补)，适用于多种类疾病患者肠道和口腔菌群的多样性及差异性的检测方法。

本发明的又一个目的在于为人们更好的了解肠道及口腔微生物以及与疾病之间的相互关系提供技术支撑和理论基础。

1.在本发明中，所述引物对(上、下游引物统称为一对引物)不限于由所述序列所示的两条单链DNA分子组成的引物对，只要是能够特异性扩增所有需要检验的微生物来源的引物对均可。

本发明提供了一种检测疾病患者肠道菌群的多样性及差异性的特异性引物对，其特征在于，所述引物对是能够特异性扩增所有需要检验的微生物来源的引物对。

本发明提供了一种检测疾病患者肠道菌群的多样性及差异性的特异性引物对，其特征在于，所述引物对是能够特异性扩增所有需要检验的微生物来源的引物对。所述引物对是由两条单链DNA分子序列组成的引物对。所述引物对

上游引物为：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；

下游引物为：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNNNNNAGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

所述的引物对，用于生物技术及检测领域，通过二代高通量测序技术，精准检测疾病患者肠道菌群的多样性及差异性。

2.本发明还提供一种判定待测疾病患者体内肠道菌群的多样性及差异性的方法，其特征在于包括以下步骤，

(1)收集待测样本并进行微生物基因组DNA提取，得到基因组DNA提取液；

(2)对基因组DNA提取液进行检测确定样本中微生物基因组DNA的浓度和纯度；

(3)利用16SrDNA特异的V3-V4区引物对基因组DNA提取液进行PCR扩增，进行文库构建；

(4)利用Illumina MiSeq测序系统进行测序；

(5)利用FLASH，QIIME，usearch61进行生物信息学分析

3.本发明所述粪便样本的采集及粪便样本DNA的提取方法为：

(1)所述粪便样本的采集方法具体为：

1)将粪便排入一个清洁且干燥的容器内。注：容器内不能混入尿液。

2)用采样管中的小勺来收集粪便，为防止粪便表层污染，需用取样勺轻轻扒开表层，在粪便内部取样，将装有粪便的小勺放入采样管中。

3)旋紧管盖，注明采样信息。

(2)所述粪便样本DNA的提取方法具体为：

用2.0克左右的粪便样本，选择用改进的CTAB抽提法进行样本DNA的提取。

1)将冻存管内的取样勺取出(尽量涮洗干净，不留样品)12000转速，离心2分钟。

2)用移液枪吸出乙醇(尽量吸干净)，加入300微克65℃预热的2×CTAB搅拌震荡为悬浊液。

3)EP管缠绕封口膜后95℃水浴加热8分钟。

4)加入300微升酚仿(取下层)混合液，振荡混匀，10000转速，离心5分钟；

5)将上清液200ul移至新的1.5毫升无菌离心管中，加入3倍体积(600微升)的溶胶液，振荡混匀，分两次(每次约400微升)移入硅质柱，静置2分钟，12000转速离心30秒；

6)弃液体，在硅质柱中加入约400微升的洗涤液，12000转速离心30秒；

7)重复前一步骤；

8)弃回收管内废液，空管离心，12000转速离心2分钟；

9)将硅质柱移入新的1.5毫升无菌离心管，加入60微升TE洗脱液，(TE洗脱液需提前65℃水浴)，12000转速离心30秒；

10)离心管中收集的60微升液体，即为DNA模版，于-20℃冰箱保存。

所述口腔拭子样本的采集方法具体为：

(1)采样前，先用清水漱口。

(2)打开采样管包装，将拭子取出。注意：采样前不要接触拭子头。

(3)伸进口腔，紧靠脸颊内侧来回刮拭15-20次(不时旋转拭子)，样本采集后，将拭子立即放入采样管内部，使拭子浸入采样液。

(4)将采样管以上拭子折断，旋紧管盖，注明采样信息。常温放置1天，-80℃可长期保存。

4.本发明所述口腔拭子样本的采集及口腔拭子样本DNA的提取方法为：

(1)本发明所述口腔拭子样本DNA的提取方法具体为：

1)采集样本后的通用细菌采样管，连同拭子一起剧烈震荡15秒或用振荡器震荡15秒，使样本从拭子头上释放出来。

2)打开管盖，用移液枪将采样管中液体转移到1.5毫升的Ep管中，12000转速，离心5分钟。

3)将离心后的EP管中的上清液弃掉，加入300微升65℃预热的2×CTAB，充分震荡混匀。

4)EP管缠绕封口膜后95℃水浴加热8分钟。

5)加入300ul酚仿(取下层)混合液，振荡混匀，10000转速离心5分钟；

6)将上清液200微升移至新的1.5毫升无菌离心管中，加入3倍体积(600微升)的溶胶液，振荡混匀，分两次(每次约400ul)移入硅质柱，静置2分钟，12000转速离心30秒；

7)弃液体，在硅质柱中加入约400微升的洗涤液，12000转速离心30秒；

8)重复前一步骤；

9)弃回收管内废液，空管离心，12000转速离心2分钟；

10)将硅质柱移入新的1.5毫升无菌离心管，加入60微升TE洗脱液，(TE洗脱液需提前65℃水浴)，12000转速离心30秒；

11)离心管中收集的60微升液体，即为DNA模版，于-20℃冰箱保存。

5.本发明所述DNA含量的判定具体为：

(1)对提取出的DNA进行NanoDrop2000分光光度计检测其纯度，发现1.6＜OD260/280＜2.0，提取DNA浓度均＞10纳克/微升。

(2)所述的方法中的PCR扩增反应为单重PCR反应，反应体系包含：

10×buffer，正向引物和反向引物，DNA模板，dNTP，Taq酶，灭菌蒸馏水。提取的DNA为模板，用所述的引物、进行荧光定量PCR扩增。

(3)所述的PCR反应的50微升的反应体系包括：

试剂使用量终浓度Taq酶溶液0.8微升上游引物(10微摩)0.5微升0.1微摩下游引物(10微摩)0.5微升0.1微摩10×buffer溶液5微升DNA模板2微升dNTP溶液4微升灭菌蒸馏水37.2微升总体积15微升

反应体系共：50微升。

(4)所述的PCR扩增反应条件为：

(5)所述的PCR反应的目标片段进行检测使用的方法是琼脂糖凝胶电泳方法。

(6)所述的测序方法是利用Illumina MiSeq测序系统进行测序。

本发明所述引物在生物技术检测领域，提供了一种基于二代高通量测序技术，检测疾病患者肠道菌群的多样性及差异性的方法。

本发明在二代高通量测序的基础上，设计了可以扩增多种微生物的通用引物，建立了基于二代高通量测序技术，检测疾病患者肠道菌群的多样性及差异性的方法。与常规方法相比，本发明的方法是通过对患者体内的肠道菌群微生物组的16SrDNA特异的V3-V4区域进行测序，对患者体内的肠道及口腔菌群的多样性及差异性进行了研究，并且利用Illumina MiSeq测序系统进行测序。

附图说明

图1所有肠道和口腔样本的Shannon多样性曲线分析图；

图2所有肠道和口腔样本的门级分类柱形图；

图3所有肠道样本的门级分类柱形图；

图4所有口腔样本的门级分类柱形图；

图5肠道和口腔样本的PCoA图；

图6自闭症儿童粪便样本与正常儿童粪便样本LDA分值直方图；

图7自闭症儿童粪便样本与正常儿童粪便样本微生物群落差异分枝图；

图8自闭症儿童口腔样本与正常儿童口腔样本LDA分值直方图；

图9自闭症儿童口腔样本与正常儿童口腔样本微生物群落差异分枝图。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。

在本发明的实施例1中，本实施例中来自儿童自闭症患儿家庭的肠道菌群多样性的分析方法如下:

1.粪便样本收集，本实施例中的粪便样本取自15个患有儿童自闭症的家庭，具体方法为：

(1)将粪便排入一个清洁且干燥的容器内。注：容器内不能混入尿液。

(2)用采样管中的小勺来收集粪便，为防止粪便表层污染，需用取样勺轻轻扒开表层，在粪便内部取样，将装有粪便的小勺放入采样管中。

(3)旋紧管盖，注明采样信息。

2.粪便样本DNA的提取

用2.0g左右的粪便样本，选择用改进的CTAB抽提法进行样本DNA的提取。样本DNA提取的实验流程：

(1)将冻存管内的取样勺取出(尽量涮洗干净，不留样品)12000转速离心2分钟。

(2)用移液枪吸出乙醇(尽量吸干净)，加入300微升65℃预热的2×CTAB搅拌震荡为悬浊液。

(3)EP管缠绕封口膜后95℃水浴加热8分钟。

(4)加入300微升酚仿(取下层)混合液，振荡混匀，10000转速离心5分钟；

(5)将上清液200微升移至新的1.5毫升无菌离心管中，加入3倍体积(600微升)的溶胶液，振荡混匀，分两次(每次约400微升)移入硅质柱，静置2分钟，12000转速离心30秒；

(6)弃液体，在硅质柱中加入约400微升的洗涤液，12000转速离心30秒；

(7)重复前一步骤；

(8)弃回收管内废液，空管离心，12000r/2分钟；

(9)将硅质柱移入新的1.5mL无菌离心管，加入60ulTE洗脱液，(TE洗脱液需提前65℃水浴)，12000rpm离心30秒；

(10)离心管中收集的60μL液体，即为DNA模版，于-20℃冰箱保存。

3.DNA含量的判定

对提取出的DNA进行NanoDrop2000分光光度计检测其纯度，发现1.6＜OD260/280＜2.0，提取DNA浓度均＞10纳克/微升。

4.利用16SrDNA特异的V3-V4区引物对基因组DNA提取液进行PCR扩增，进行文库构建。

5.利用IlluminaMiSeq测序系统进行测序。

6.利用FLASH，QIIME，usearch61进行生物信息学分析。

(1)原始数据预处理

原始数据经过去接头、低质量过滤等处理，获得高质量的Reads序列，然后合并正反向Reads，获得16SrDNA V3+V4区扩增子序列。利用FLASH软件合并正方向reads，该软件可以快速、准确的检测到正反向reads的Overlap序列，并将合并后序列输出，其准确性在99％以上。

(2)合并数据长度分布及质量统计

合并后数据使用FastQC软件进行指控分析，该软件从原始数据统计到数据质量、序列长度、GC偏好、冗余等信息以网页的形式展现出来，可以直观的看出数据的指控信息。

(3)配置文件的准备

配置文件中包含了混合扩增子的各个样本的重要信息，如样本名称、标签序列、引物序列、样本处理、采集区域、采集时间等。

(4)分离样本序列

根据配置文件标签序列信息分离样本，统计各个样本基本信息。

(5)去除嵌合体

采用denovo方式去除嵌合体序列，嵌合体检查软件为usearch61。

(6)筛选操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)

将所有分离的高质量样本序列做聚类分析，聚类可以将一定同源性的序列聚为一类(默认同源性为97％)，每一个OTU代表一个物种。

(7)分类学组成分析

使用RDP分类器和Greengenes参考数据集。

(8)样本内多样性分析(α多样性分析)

主要是稀疏曲线分析。

(9)样本间多样性分析(β多样性分析)

数据产生的距离矩阵可被主坐标分析(Principal Coordinate Analysis,PCoA)可视化。

(10)LEfSe分析

LDA分值直方图、微生物群落差异分类图及差异特征的相对丰度直方图。

在本发明的实施例2中，本实施例中来自儿童自闭症患儿家庭的口腔菌群多样性的分析方法如下:

1.口腔拭子样本收集，本实施例中的口腔拭子样本取自15个患有儿童自闭症的家庭，具体方法为：

(1)采样前，先用清水漱口。

(2)打开采样管包装，将拭子取出。注意：采样前不要接触拭子头。

(3)伸进口腔，紧靠脸颊内侧来回刮拭15-20次(不时旋转拭子)，样本采集后，将拭子立即放入采样管内部，使拭子浸入采样液。

(4)将采样管以上拭子折断，旋紧管盖，注明采样信息。常温放置1天，-80℃冰箱可长期保存。

2.口腔拭子样本DNA的提取

用改进的CTAB抽提法进行样本DNA的提取。样本DNA提取的实验流程：

(1)采集样本后的通用细菌采样管，连同拭子一起剧烈震荡15秒或用振荡器震荡15秒，使样本从拭子头上释放出来。

(2)打开管盖，用移液枪将采样管中液体转移到1.5毫升的EP管中，12000转速离心5分钟。

(3)将离心后的EP管中的上清液弃掉，加入300微升65℃预热的2×CTAB，充分震荡混匀。

(4)EP管缠绕封口膜后95℃水浴加热8分钟。

(5)加入300微升酚仿(取下层)混合液，振荡混匀，10000转速离心5分钟；

(6)将上清液200微升移至新的1.5毫升无菌离心管中，加入3倍体积(600微升)的溶胶液，振荡混匀，分两次(每次约400微升)移入硅质柱，静置2分钟，12000转速离心30秒；

(7)弃液体，在硅质柱中加入约400微升的洗涤液，12000转速离心30秒；

(8)重复前一步骤；

(9)弃回收管内废液，空管离心，12000转速离心2分钟；

(10)将硅质柱移入新的1.5毫升无菌离心管，加入60微升TE洗脱液，(TE洗脱液需提前65℃水浴)，12000转速离心30秒；

(11)离心管中收集的60微升液体，即为DNA模版，于-20℃冰箱保存。

3.DNA含量的判定

对提取出的DNA进行NanoDrop2000分光光度计检测其纯度，发现1.6＜OD260/280＜2.0，提取DNA浓度均＞10纳克/微升。

4.利用16SrDNA特异的V3-V4区引物对基因组DNA提取液进行PCR扩增，进行文库构建。

5.利用IlluminaMiSeq测序系统进行测序。

6.利用FLASH，QIIME，usearch61进行生物信息学分析。

(1)原始数据预处理原始数据经过去接头、低质量过滤等处理，获得高质量的Reads序列，然后合并正反向Reads，获得16SrDNA V3+V4区扩增子序列。利用FLASH软件合并正方向reads，该软件可以快速、准确的检测到正反向reads的Overlap序列，并将合并后序列输出，其准确性在99％以上。

(2)合并数据长度分布及质量统计合并后数据使用FastQC软件进行指控分析，该软件从原始数据统计到数据质量、序列长度、GC偏好、冗余等信息以网页的形式展现出来，可以直观的看出数据的指控信息。

(3)配置文件的准备配置文件中包含了混合扩增子的各个样本的重要信息，如样本名称、标签序列、引物序列、样本处理、采集区域、采集时间等。

(4)分离样本序列根据配置文件标签序列信息分离样本，统计各个样本基本信息。

(5)去除嵌合体采用denovo方式去除嵌合体序列，嵌合体检查软件为usearch61。

(6)筛选操作分类单元(OperationalTaxonomicUnits，OTUs)将所有分离的高质量样本序列做聚类分析，聚类可以将一定同源性的序列聚为一类(默认同源性为97％)，每一个OTU代表一个物种。

(7)分类学组成分析。

(8)样本内多样性分析和样本间多样性分析。

(9)LEfSe分析LDA分值直方图、微生物群落差异分类图及差异特征的相对丰度直方图。