一种基于微流控芯片的用于多重核酸扩增产物荧光检测的方法

摘要

本发明公开了一种基于微流控芯片的用于多重核酸扩增产物荧光检测的方法。该芯片具有加样孔，扩增腔室，虹吸管道，第一界面阀，预分配室，第二界面阀，检测腔室，废液腔，自通气管道和第三界面阀。本发明提供的芯片能够在离心的作用下，将多重扩增的产物均匀分配至不同的检测腔室内，检测腔室内含有预点样的特异性探针。本发明能够用单重荧光通道检测多重扩增产物，简化了检测仪器的荧光通道数量。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别涉及微流控芯片领域，具体涉及多重核酸扩增产物的单荧光通道检测。

背景技术

微流控技术是一种通过微管道及微腔体等结构来控制微流体完成生化反应的一种技术。目前被广泛应用于组织，细胞，核酸，蛋白及小分子的相关研究中。目前对多个核酸目标的检测常需要用到多重扩增技术，但往往需要带有不同荧光标记的探针或者引物来检测不同的产物，这就需要配套的检测仪器含有多路荧光检测的本领，使得仪器结构更加复杂，成本变高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于多重核酸扩增产物荧光检测的微流控芯片。

本发明提供的微流控芯片包括多个操作单元，每个所述操作单元包括加样孔、扩增腔室、虹吸管道、预分配室、检测腔室、废液腔和自通气管道；所述预分配室和所述检测腔室的体积相同；

所述扩增腔室与所述加样孔连接，所述扩增腔室远离旋转中心一端依次经所述虹吸管道和所述缓冲管道与所述预分配室连接；

所述预分配室设置多个，多个所述预分配室通过缓冲管道连通，且多个所述预分配室与缓冲管道的连接处距离旋转中心的长度根据进样的先后顺序依次增大；将距离旋转中心的长度最大的所述预分配室设置为废液腔；除所述废液腔以外的每个所述预分配室下方均设置有检测腔室；

所述废液腔还与所述自通气管道一端连接，所述自通气管道另一端与所述扩增腔室靠近旋转中心一侧连接；

全封闭的所述微流控芯片中的气体通过所述自通气管道进行自循环。

上述微流控芯片中，所述微流控芯片还包括第一界面阀、第二界面阀和第三界面阀；所述虹吸管道上设置有所述第一界面阀，所述第一界面阀与旋转中心之间的距离大于所述扩增腔室与旋转中心的最小距离；每个所述预分配室下方均通过所述第二界面阀与所述检测腔室连接；位于所述扩增腔室上方的自通气管道上设置有所述第三界面阀。

上述微流控芯片中，所述虹吸管道亲水化修饰。在本发明的具体实施例中，所述虹吸管道用2％(体积分数)吐温20溶液(溶剂为酒精)进行亲水修饰。

上述微流控芯片中，所述第一界面阀和所述第三界面阀表面疏水化修饰。在本发明的具体实施例中，所述第一界面阀和所述第三界面阀用氟化液FC-1700(3M公司)进行疏水修饰。

上述微流控芯片中，所述预分配室与缓冲管道的连接处距离旋转中心的最大长度与最小长度之差为3mm-9mm。

上述微流控芯片中，所述微流控芯片是由高分子聚合物、玻璃、硅和金属材料中的一种或多种制成，所述高分子聚合物具体为聚甲基丙烯酸甲酯或聚丙烯或聚碳酸酯。在本发明的具体实施例中，所述微流控芯片是由聚甲基丙烯酸甲酯通过注塑、热压、键合和粘接等方式封装而成。

上述微流控芯片中，所述操作单位的个数为2个。

上述微流控芯片中，每个所述操作单元的所述检测腔室和预分配室的个数均为7个。

上述微流控芯片中，所述微流控芯片为圆形。

上述微流控芯片中，所述预分配室与所述缓冲管道的连接处距离旋转中心的最大长度与最小长度之差为3mm。

本发明的另一个目的是提供一种检测多重核酸扩增产物的方法。

本发明提供的检测多重核酸扩增产物的方法包括如下步骤：将多重核酸扩增产物分成若干份，每份与相应的荧光探针杂交，根据荧光强度对所述多重核酸扩增产物进行定性或定量判定；其中每份对应的荧光探针序列不同但荧光基团相同。

上述方法中，所述方法包括如下步骤：

(1)将多重核酸扩增体系通过上述微流控芯片上的加样孔加入到所述微流控芯片的扩增腔室内，得到待反应的芯片，将所述待反应的芯片进行多重扩增反应，得到反应后芯片；所述反应后芯片的扩增腔室中含有多重核酸扩增产物；

(2)将所述反应后芯片进行第一次离心，通过离心作用，使所述多重核酸扩增产物突破所述微流控芯片的第一界面阀；然后进行第二次离心，通过毛细作用，使所述多重核酸扩增产物填满所述微流控芯片的虹吸管道；然后进行第三次离心，通过虹吸作用，使所述多重核酸扩增产物依次填满所述微流控芯片的预分配室；然后进行第四次离心，通过离心作用使所述预分配室内的多重核酸扩增产物突破所述微流控芯片的第二界面阀，进入到所述微流控芯片的检测腔室内，分别与每个所述检测腔室中预点样的荧光探针杂交，得到杂交后芯片；

所述第一次离心的转速和所述第三次离心的转速高于第二次离心的转速，所述第四次离心的转速高于所述第三次离心的转速；

每个所述检测腔室中预点样的荧光探针中的荧光基团相同；

(3)检测所述杂交后芯片中的每个检测腔室的荧光强度，实现对所述多重核酸扩增产物的荧光检测。

上述方法中，步骤(2)的方法为如下(a1)或(a2)：

(a1)将所述反应后芯片进行第一次离心，通过离心作用，使所述多重核酸扩增产物突破所述微流控芯片的第一界面阀；然后停止离心，通过毛细作用，使所述多重核酸扩增产物填满所述微流控芯片的虹吸管道；然后再次离心，通过虹吸作用，使所述多重核酸扩增产物依次填满所述微流控芯片的预分配室；然后提高转速，通过离心作用使所述预分配室内的多重核酸扩增产物突破所述微流控芯片的第二界面阀，进入到所述微流控芯片的检测腔室内，分别与每个所述检测腔室中预点样的荧光探针杂交，得到杂交后芯片；

(a2)将所述反应后芯片进行第一次离心，通过离心作用，使所述多重核酸扩增产物突破所述微流控芯片的第一界面阀；然后降低转速，通过毛细作用，使所述多重核酸扩增产物填满所述微流控芯片的虹吸管道；然后提高转速，通过虹吸作用，使所述多重核酸扩增产物依次填满所述微流控芯片的预分配室；然后再次提高转速，通过离心作用使所述预分配室内的多重核酸扩增产物突破所述微流控芯片的第二界面阀，进入到所述微流控芯片的检测腔室内，分别与每个所述检测腔室中预点样的荧光探针杂交，得到杂交后芯片。

上述方法中，

所述第一次离心的条件为4000-6000rpm/min离心至少10s；

所述第二次离心的条件为0-100rpm/min离心至少10s；当转速为0rpm/min时，即为停止离心；

所述第三次离心的条件为1000-2000rpm/min离心至少30s；

所述第四次离心的条件为4000-6000rpm/min离心至少10s。

上述方法中，

所述第一次离心的条件为4000rpm/min离心10s；

所述第二次离心的条件为100rpm/min离心10s；

所述第三次离心的条件为1000rpm/min离心30s；

所述第四次离心的条件为4000rpm/min离心10s。

上述方法中，

每个所述检测腔室中预点样的荧光探针中的荧光基团均为FAM。

本发明的最后一个目的是提供上述方法的新用途。

本发明提供了上述方法在多重核酸扩增产物的单荧光通道检测中的应用。

本发明提供了一种用于多重核酸扩增产物荧光检测的微流控芯片，该芯片具有加样孔，扩增腔室，虹吸管道，第一界面阀，预分配室，第二界面阀，检测腔室，废液腔，自通气管道和第三界面阀，并基于该芯片提供了一种多重核酸扩增产物的检测方法。本发明提供的芯片能够在离心的作用下，将多重扩增的产物均匀分配至不同的检测腔室内，检测腔室内含有预点样的特异性探针，能够用单重荧光通道检测多重扩增产物，大大简化了检测仪器的荧光通道数量和常规多重PCR需用多重荧光通道检测不同产物的方式。

附图说明

图1为实施例1中的芯片示意图。

图2为实施例1中的芯片使用示意图。图2(a)为加入多重扩增反应体系，并进行扩增，图2(b)为样品在离心离心力的作用下突破界面阀，并且停止离心或降低转速后，在毛细作用下，扩增产物溶液填满虹吸管道，图2(c)为在离心的作用下，产生虹吸，并依次填满预分配室，图2(d)为在离心的作用下，液体突破界面阀并进入到检测腔室，和预点样在里面的特异性探针结合，用于荧光检测。

图3为实施例2中的荧光检测结果。图3(a)为检测样品的荧光检测结果，图3(b)为阴性对照的荧光检测结果。

图4为芯片的完整示意图。

图5为芯片与离心装置的结合图。图5A为离心装置与芯片结合的卡口；5B为芯片的实物图；5C为芯片与离心装置的结合图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、一种用于多重核酸扩增产物荧光检测的微流控芯片

1、微流控芯片的设计要求

本发明为了实现多重扩增产物的单一荧光检测，芯片的设计需要满足如下要求：1)供多重核酸扩增的腔室：将多重核酸扩增体系加入到芯片上的扩增腔室内进行扩增；2)多重扩增产物的均匀分配：通过结构的设计，将产物均匀分配至不同的检测腔室内；3)产物的检测：每个检测腔室内预点样一种特定产物的探针，通过检测孔的空间位置来区分不同的产物，通过每个检测孔的荧光信号来定性或定量检测扩增产物。

2、本发明设计的微流控芯片

本发明设计的满足上述要求的试样分析芯片具有如下操作单元：一个供多重扩增的反应腔，一些流体操控结构和检测腔，芯片流体通过离心的方式操控。具体包括如下各组成部分(图1)：加样孔301，扩增腔室302，虹吸管道303，第一界面阀304，预分配室305，第二界面阀306，检测腔室307，废液腔308，自通气管道309，第三界面阀310和缓冲管道311。

在本发明提供的具体实施例中，扩增腔室302采用圆形结构，该芯片扩增腔室302与加样孔301连接，扩增腔室302远离旋转中心一端与虹吸管道303一端连接；虹吸管道303另一端经缓冲管道311与预分配室305连接，位于虹吸管道303上设置有第一界面阀304，且虹吸管道亲水化修饰；为了保证在扩增反应进行的过程中，液体不会通过毛细作用填满虹吸管道303和进入预分配室305，第一界面阀304与旋转中心之间的距离大于扩增腔室302与旋转中心的最小距离，且表面疏水化修饰。预分配室305采用多个，多个预分配室305顶部通过缓冲管道311连通，且多个预分配室305与缓冲管道311的连接处距离旋转中心的长度根据进样的先后顺序依次增大；将距离与旋转中心最大的预分配室305设置为用于收集多余扩增产物的废液腔308。除了废液腔308以外的各预分配室305下方均通过第二界面阀306与检测腔室307连接。废液腔308还与自通气管道309一端连接，自通气管道309另一端与扩增腔室302靠近旋转中心一侧连接，位于扩增腔室302上方的自通气管道309上设置有第三界面阀310；全封闭的微流控芯片中的气体通过自通气管道309进行自循环。其中，预分配室305与缓冲管道311的连接处距离旋转中心的最大长度与最小长度之差为3mm～9mm；在本实施例中，预分配室305与缓冲管道311的连接处距离旋转中心的最大长度与最小长度之差优选为3mm。

本发明提供的芯片的大小和每张芯片的操作单元数均可根据不同的需求改变。具体的，在本发明提供的具体实施例中，芯片半径为5.5cm，含有2个操作单元(图4)。每个操作单元中的扩增腔室的形状、体积，检测腔室和预分配室的形状、体积及检测腔室的个数也均可根据不同的需求改变。具体的，在本发明提供的具体实施例中，扩增腔室的体积为80μL，预分配室305和检测腔室307的体积相同，均为10μL。预分配室和检测腔室的个数均为7个。

本发明提供的芯片的材料是聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯、聚碳酸酯等高分子聚合物或玻璃、硅、金属材料中的一种或多种制成。在本发明提供的具体实施例中，芯片的材料是聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。

本发明提供的芯片是通过注塑，热压，键合和粘接等方式封装而成。

3、本发明设计的微流控芯片的使用方法

本发明设计的微流控芯片的使用方法具体如下：将多重核酸扩增体系通过加样孔301加入到芯片上的扩增腔室内302进行多重扩增反应，得到多重核酸扩增产物。多重扩增反应可以为链式聚合酶反应(PCR)、环介导恒温扩增(LAMP)和滚环扩增(RCA)等恒温扩增。在扩增反应中，多重核酸扩增产物会被第一界面阀304阻挡。在扩增腔室302中完成扩增反应后，通过离心作用，多重核酸扩增产物会突破第一界面阀304；当离心停止或者降低转速后，通过毛细作用，多重核酸扩增产物会填满虹吸管道303；再次离心，通过虹吸作用，多重核酸扩增产物会依次填满预分配室305；再次加大离心力，通过离心作用，预分配室305内的多重核酸扩增产物会突破第二界面阀306，进入到检测腔室307内，每个检测腔室307中含有一种预点样的特定的荧光探针，孵育一定时间后，可对检测腔室307内多重核酸扩增产物进行定量或定性荧光检测。荧光探针为序列特异性探针，例如分子信标(MB)，荧光基团和猝灭基团为常用的适用于分子信标的分子对。本发明的芯片使用示意图如图2所示。

实施例2、用于多重核酸扩增产物荧光检测的微流控芯片在细菌检测中的应用

采用实施例1中用于多重核酸扩增产物荧光检测的微流控芯片(图4)及多重核酸扩增产物荧光检测的方法对沙门氏菌(Sa，ATCC 35640)、单增李斯特菌(LM，ATCC7644)和大肠杆菌O157:H7(ATCC 12900)进行检测。具体步骤如下：

一、检测前实验材料准备

1、多重PCR体系的建立

多重PCR体系的建立方法参照文献“李金峰，三种食源性致病菌的多重实时PCR检测研究。华中农业大学硕士毕业论文，2008.”，与文献中的区别为分子信标的荧光基团均为FAM。沙门氏菌(Sa，ATCC 35640)、单增李斯特菌(LM，ATCC 7644)和大肠杆菌O157:H7(ATCC12900)的检测引物和分子信标序列如表1所示。

表1、检测引物和分子信标序列及终浓度

名称引物和探针序列(5'-3')终浓度(μM)Sa-FCTCACCAGGAGATTACAACATGG0.6Sa-RAGCTCAGACCAAAAGTGACCATC0.6Sa探针FAM-CCCCGACTTTTAGCCACTGACGACGGGG-DabcylLM-FTGCAAGTCCTAAGACGCCA0.48LM-RCACTGCATCTCCGTGGTATACTAA0.48LM探针FAM-CGCCGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCGGCG-DabcylO157-FAAGATTGCGCTGAAGCCTTTG0.48O157-RGCCAATATTGCCTATGTACAGC0.48O15探针FAM-CCGTGACAACCATTCCACCTTCACGG-Dabcyl

多重扩增的反应体系(PCR混合液)为80μL，其中包含PCR master mix 40μL(北京百泰克生物技术有限公司)、引物(终浓度如表1所示)、牛血清蛋白(BSA)200g/L和三种细菌的基因组DNA(终浓度均为10³copies/μL)，剩余体积用水补齐。

2、芯片的准备

(1)探针点样

用移液枪将分子信标(0.4μL，原浓度为10μM)分别点样在各个检测腔室307，检测腔室307从右至左依次编号为1-7。1和2号检测腔室点样Sa探针，3和4号检测腔室点样LM探针，5和6号检测腔室点样O157探针，7号检测腔室不点样探针，室温下将探针晾干。

(2)亲疏水修饰

芯片的虹吸管道303用2％(体积分数)吐温20溶液(溶剂为酒精)进行亲水修饰，第一界面阀304和第三界面阀310用氟化液FC-1700(3M公司)进行疏水修饰。进行完探针点样和亲疏水修饰后，用单面胶将芯片的一面封闭。

二、检测

1、PCR扩增

从加样孔301注入80μL配置好的PCR混合液，加样完毕后用单面胶将另一面的加样孔封闭，从而使芯片完全密封。将芯片放入平板PCR仪内进行PCR扩增反应，得到多重PCR扩增产物。

PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环。

2、多重PCR扩增产物的分配及杂交

PCR完毕后，将芯片转移至离心装置(图5)，离心装置的离心半径即为芯片的半径，4000rpm/min离心芯片10s，通过离心作用，使液体(多重PCR扩增产物)突破第一界面阀304；然后降低转速至100rpm/min，持续10s，通过毛细作用，使液体(多重PCR扩增产物)填充虹吸管道303；再次提高转速至1000rpm/min，持续30s通过虹吸作用，使液体(多重PCR扩增产物)填充各个预分配室305，多余的液体进入废液池308；然后继续提高转速至4000rpm/min，持续10s，通过离心作用，使液体(多重PCR扩增产物)突破第二界面阀306进入到检测腔室307的各个检测孔内，分别和预点样在其中的探针杂交(室温孵育30min)，得到杂交后芯片。同时以不加入细菌模板的PCR扩增后体系和探针杂交后的荧光强度为阴性对照。

3、荧光强度检测

将杂交后芯片放入检测仪器内测定每个检测孔的荧光强度。具体步骤如下：将杂交后芯片中检测腔室内液体吸出至20μL的EP管里，通过RT cycler 136(北京博奥生物集团有限公司)检测各个检测腔室内液体的荧光强度。检测温度为37℃，荧光通道设置为FAM，检测时间为10min。取末点荧光值作为每个孔的荧光强度。

结果如图3所示。从图中可以看出，和不加细菌模板的检测孔相比，加入细菌模板的检测孔中均检测得到荧光强度，实现对沙门氏菌(Sa，ATCC 35640)、单增李斯特菌(LM，ATCC 7644)和大肠杆菌O157:H7(ATCC 12900)的定性检测。和文献中的方法相比，本发明的方法不需要按照文献中使用三种不同的荧光基团标记探针，仅需要一种荧光基团即可实现多重核酸扩增产物的定性检测，简化了检测仪器的荧光通道数量。