一种用于检测4种常见临床心脑血管疾病药品精准用药的方法及专用引物

摘要

本发明公开了一种用于检测4种常见临床心脑血管疾病药品精准用药的方法及专用引物。本发明提供了一种检测4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性SNP位点的专用引物。本发明高效一次性实验完成与阿司匹林抵抗、硝酸甘油抵抗、华法林个体差异、氯吡格雷抵抗相关的8个SNP位点检测，一次性实验完成阿司匹林、硝酸甘油、华法林、氯吡格雷的精准用药基因检测，减少实验成本；本发明根据每个SNP位点设计的PCR引物及独特的UEP引物，具有较高的特异性。本发明对于指导阿司匹林、硝酸甘油、华法林、氯吡格雷的临床精准用药具有非常高的应用价值，适于推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测4种常见临床心脑血管疾病药品精准用药的方法及专用引物。

背景技术

精准用药是精准医疗的重要组成部分。遗传药理学和药物基因组学研究已经证实，不同患者携带的基因(如药物转运蛋白基因、药物代谢酶基因、DNA修复基因)单核苷酸多态性不同，对药物的反应不同，同一药物对不同患者的疗效作用也有很大的差异，因此，从药物疗效的角度出发，进行基因检测指导精准用药，帮助医生筛选出有效的治疗方案，对病人做出最正确的治疗决策，既节省了患者无效的医疗费用，而且提高了治疗效果。

阿司匹林是临床上常用的预防和治疗动脉血栓性疾病类的基础药物，硝酸甘油是临床上常用的心脑血管急救药物。华法林是用于预防和治疗深静脉血栓、心脏瓣膜、非瓣膜性房颤患、心腔内血栓形成、外科围手术期处理的经典口服抗凝药物，使用已超过50年。在临床上，氯吡格雷是血小板聚集抑制剂，用于预防和治疗因血小板高聚集引起的心、脑及其他动脉循环障碍疾病，如预防血栓的形成等。

然而，在临床上，存在阿司匹林抵抗现象，即阿司匹林并非对所有的血栓患者都有效果，部分患者即使服用阿司匹林也不能抑制血小板聚集和预防血栓形成，从而达不到临床治疗效果。

硝酸甘油使用无效现象在临床上也非常常见，即人们在需要急救的危急时刻，即使争分夺秒服用的硝酸甘油，也不能挽救生命。

华法林个体化差异大，医生对患者的临床用量往往不易把握，摸索剂量需要数周(月)，而不良事件高发期在30-60天。过量服用华法林，极易造成出血风险(1-3％/每年)，尤其是老年人；服用量不足，则起不到临床抗凝效果。华法林基因检测获得美国食品药品监督管理局(FDA)推荐。

氯吡格雷是抵抗现象在临床上非常常见，2010年3月,美国FDA宣布氯吡格雷抵抗的“黑框警告”,并推荐基因检测，提醒应用氯吡格雷后出现心血管不良事件与CYP2C19功能缺失的等位基因有关。

阿司匹林抵抗现象、硝酸甘油使用无效现象、华法林个体化差异大、氯吡格雷抵抗现象与基因多态性密切相关。

传统的检测方法主要采用sanger测序，荧光定量PCR等方法。以上方法虽然也可能在临床上提供较好的价值，但是存在费时、经济成本高、时间成本高等原因，未能在临床上大规模推广使用。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术可同时检测多个基因多态性位点，具有兼容性强、通量高、精准度高、性价比高的优点，可用于同时检测阿司匹林抵抗、硝酸甘油抵抗、华法林个体化差异、氯吡格雷抵抗的精准用药相关基因信息。目前尚未有将基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术应用于阿司匹林抵抗、硝酸甘油抵抗、华法林个体化差异大、氯吡格雷抵抗现象的精准用药基因检测。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性SNP位点的专用引物。

本发明提供的引物，包括引物组1和引物组2；

所述引物组1由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对 7和引物对8组成；

所述引物对1由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；

所述引物对2由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成；

所述引物对3由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成；

所述引物对4由序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子组成；

所述引物对5由序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子组成；

所述引物对6由序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子组成；

所述引物对7由序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子组成；

所述引物对8由序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子组成。

所述引物组2由单链延伸引物1、单链延伸引物2、单链延伸引物3、单链延伸引物4、单链延伸引物5、单链延伸引物6、单链延伸引物7和单链延伸引物8组成；

所述单链延伸引物1的核苷酸序列为序列17；

所述单链延伸引物2的核苷酸序列为序列18；

所述单链延伸引物3的核苷酸序列为序列19；

所述单链延伸引物4的核苷酸序列为序列20；

所述单链延伸引物5的核苷酸序列为序列21；

所述单链延伸引物6的核苷酸序列为序列22；

所述单链延伸引物7的核苷酸序列为序列23；

所述单链延伸引物8的核苷酸序列为序列24。

上述引物中，所述引物对1-引物对8中的各条引物的摩尔比为等摩尔比；

或所述单链延伸引物1、单链延伸引物2、单链延伸引物3、单链延伸引物4、单链延伸引物5、单链延伸引物6、单链延伸引物7和单链延伸引物8的摩尔比为1：1：1：1：1：1： 1：1。

本发明另一个目的是提供一种检测4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性SNP位点的 PCR试剂。

本发明提供的PCR试剂，包括PCR试剂1和PCR试剂2；

所述PCR试剂1包括上述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对 6、引物对7、引物对8、PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP和DNA聚合酶；

所述PCR试剂2包括权利要求1中单链延伸引物1、单链延伸引物2、单链延伸引物3、单链延伸引物4、单链延伸引物5、单链延伸引物6、单链延伸引物7、单链延伸引物8、单链延伸缓冲液和单链延伸酶。

上述的PCR试剂中，

所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对 8中的各条引物在所述PCR试剂1中的浓度分别为0.1μM；

或，所述MgCl₂在所述PCR试剂1中的浓度为2mM；

或，所述dNTP在所述PCR试剂1中的浓度为0.5mM；

或，所述DNA聚合酶在所述PCR试剂1中的浓度为0.2U/μl；

所述单链延伸引物1、单链延伸引物2、单链延伸引物3、单链延伸引物4、单链延伸引物5、单链延伸引物6、单链延伸引物7、单链延伸引物8在所述PCR试剂2中的浓度分别为0.05μM。

本发明第3个目的是提供一种检测4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性SNP位点的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的专用引物或上2述的PCR试剂。

上述的专用引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在制备检测4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性SNP位点基因型产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的专用引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在检测4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性SNP位点基因型中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的专用引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在对待测样本进行心脑血管疾病指导用药中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的专用引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在制备对待测样本进行心脑血管疾病指导用药产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第4个目的是提供一种检测待测样本中4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性 SNP位点基因型的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)、用上述的专用引物中的引物对1-8对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)将所述PCR扩增产物进行碱性磷酸酶消化，得到消化产物；

3)将所述消化产物用权利要求1或2所述的专用引物中的单链延伸引物1、单链延伸引物2、单链延伸引物3、单链延伸引物4、单链延伸引物5、单链延伸引物6、单链延伸引物7、单链延伸引物8进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物；

4)将所述单碱基延伸反应产物经过纯化后，进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测，得到待测样本中4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性SNP位的基因型。

上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测样本的基因组DNA。

上述方法中，所述PCR扩增的程序为先94℃2min，再94℃20s、56℃30s、 72℃60s进行45个循环，再72℃3min；

或所述碱性磷酸酶消化的程序为：37℃，40min；85℃，5min，4℃保存；

或所述单碱基延伸反应的程序为：先94℃30s，再94℃5s、(52℃5s、80℃ 5s)5个循环，进行40个循环，再72℃3min；

或所述纯化为树脂纯化。

上述中，所述SNP位点为rs5918(对应引物对1和单链延伸引物1)、rs1330344(对应引物对2和单链延伸引物2)、rs20417(对应引物对3和单链延伸引物3)、rs671(对应引物对4和单链延伸引物4)、rs1057910(对应引物对5和单链延伸引物5)、rs9923231 (对应引物对6和单链延伸引物6)、rs4244285(对应引物对7和单链延伸引物7)和rs4986893 (对应引物对8和单链延伸引物8)；

所述4种常见临床心脑血管疾病药品为阿司匹林、硝酸甘油、华法林和氯吡格雷。

本发明的实验证明，本发明高效一次性实验完成与阿司匹林抵抗、硝酸甘油抵抗、华法林个体差异、氯吡格雷抵抗相关的8个SNP位点检测，一次性实验完成阿司匹林、硝酸甘油、华法林、氯吡格雷的精准用药基因检测，减少实验成本；本发明根据每个SNP位点设计的PCR 引物及独特的UEP引物，具有较高的特异性。本发明对于指导阿司匹林、硝酸甘油、华法林、氯吡格雷的临床精准用药具有非常高的应用价值，适于推广应用。

附图说明

图1为rs5918检测结果。

图2为rs1330344检测结果。

图3为rs9923231检测结果。

图4为rs4986893检测结果。

图5为rs671检测结果。

图6为rs20417检测结果。

图7为rs1057910检测结果。

图8为rs4244285检测结果。

图9为rs5918引物组1检测结果。

图10为rs5918引物组2检测结果。

图11为rs1330344引物组1检测结果。

图12为rs1330344引物组2检测结果。

图13为rs4986893引物组1检测结果。

图14为rs4986893引物组2检测结果。

图15为rs20417引物组1检测结果。

图16为rs20417引物组2检测结果。

图17为rs671引物组1检测结果。

图18为rs671引物组2检测结果。

图19为rs1057910引物组1检测结果。

图20为rs1057910引物组2检测结果。

图21为rs9923231引物组1检测结果。

图22为rs9923231引物组2检测结果。

图23为rs4244285引物组1检测结果。

图24为rs4244285引物组2检测结果。

图25为rs671优化条件1检测结果。

图26为rs9923231优化条件2检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、检测4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性SNP位点的方法及专用引物

一、检测4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性SNP位点专用引物

根据阿司匹林抵抗、硝酸甘油抵抗、华法林个体差异、氯吡格雷抵抗相关基因的相关SNP 位点：rs5918、rs1330344、rs20417、rs671、rs1057910、rs9923231、rs4244285、rs4986893，设计特异性PCR引物和UEP引物，利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 技术实现阿司匹林抵抗、硝酸甘油抵抗、华法林个体化差异大、氯吡格雷抵抗现象的精准用药基因检测。

特异性PCR引物和UEP引物包括：

rs5918PCR引物1：ACGTTGGATGTCTTTGGGCTCCTGTCTTAC(序列1)；

rs5918PCR引物2：ACGTTGGATGAGCAGATTCTCCTTCAGGTC(序列2)；

rs1330344PCR引物1：ACGTTGGATGAGGTCACGCTATGGAAGAAG(序列3)；

rs1330344PCR引物2：ACGTTGGATGAAGAAACACTTGTGTGGCCC(序列4)；

rs20417PCR引物1：ACGTTGGATGACAGGGTAACTGCTTAGGAC(序列5)；

rs20417PCR引物2：ACGTTGGATGACTGTTCTCCGTACCTTCAC(序列6)；

rs671PCR引物1：ACGTTGGATGTTGGTGGCTACAAGATGTCG(序列7)；

rs671PCR引物2：ACGTTGGATGAGGTCCCACACTCACAGTTT(序列8)；

rs1057910引物1：ACGTTGGATGTGTCACAGGTCACTGCATGG(序列9)；

rs1057910引物2：ACGTTGGATGCTACACAGATGCTGTGGTGC(序列10)；

rs9923231引物1：ACGTTGGATGGCTAGGATTATAGGCGTGAG(序列11)；

rs9923231引物2：ACGTTGGATGTCTGGGAAGTCAAGCAAGAG(序列12)；

rs4244285引物1：ACGTTGGATGGCAATAATTTTCCCACTATC(序列13)；

rs4244285引物2：ACGTTGGATGCACTTTCCATAAAAGCAAGG(序列14)；

rs4986893引物1：ACGTTGGATGGACTGTAAGTGGTTTCTCAG(序列15)；

rs4986893引物2：ACGTTGGATGAACATCAGGATTGTAAGCAC(序列16)；

rs5918UEP引物：TTACAGGCCCTGCCTC(序列17)；

rs1330344UEP引物：TGAAGGCTCTTCCCAT(序列18)；

rs20417UEP引物：AGGAGAATTTACCTTTCCC(序列19)；

rs671UEP引物:CCACACTCACAGTTTTCACTT(序列20)；

rs1057910UEP引物：CAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAA(序列21)；

rs9923231UEP引物：GATTATAGGCGTGAGCCACCGCACC(序列22)；

rs4244285UEP引物：TTTCCCACTATCATTGATTATTTCCC(序列23)；

rs4986893UEP引物：AAACTTGGCCTTACCTGGAT(序列24)

二、检测4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性SNP位点的方法

1、模板DNA的提取

提取192例离体外周血的基因组DNA，制备工作液浓度在20-30ng/μl。

2、PCR反应

在384孔板中配制5μl PCR反应体系：模板DNA 1μl，引物混合液1μl(每条引物在反应体系中的终浓度均为0.1μM)，10×Buffer(含15mM Mg²⁺)0.5μl，MgCl₂(25mM)0.4μl(终浓度2mM)，dNTP(25mM)0.1μl(终浓度是0.5mM)，Hotstar>

引物混合液由序列1-16所示的引物和水组成，其中，每条引物浓度为0.5μM。

将上述反应体系进行PCR反应，得到PCR扩增产物。

上述PCR反应程序设置如下：

3、碱性磷酸酶处理(SAP消化反应)

向上述2得到PCR扩增产物中加入如下：SAP Buffer 0.17μl，SAP Enzyme(AgenaBIOSCIENCE,产品ref:100021,lot:0000021450)0.30μl，MBG水1.53μl，得到SAP消化反应体系。

将SAP消化反应体系进行消化反应，得到消化反应产物。

上述消化反应程序：37℃，40min；85℃，5min；4℃，∞。

4、单碱基延伸反应

向上述3得到消化反应产物中加入如下：iPLEX Buffer plus(Agena BIOSCIENCE，Ref:01431,lot:0000021844)0.2μl，iPLEX Terminator(Agena BIOSCIENCE， Ref:01430,lot:0000021435)0.2μl，iPLEX Enzyme(Agena BIOSCIENCE，Ref:01432,lot:0000021845)0.041μl，MBG水0.619μl，引物Mix 0.940μl(各条引物在单碱基延伸反应体中的终浓度为0.05μM)，得到单碱基延伸反应体系。

上述引物Mix由序列17-24所示的引物和水组成，且每条引物浓度为0.5μM。

将单碱基延伸反应体系进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物。

上述单碱基延伸反应程序如下：

5、树脂纯化

将上述4得到的单碱基延伸反应产物进行树脂纯化，具体如下：

1)将上述4得到装有单碱基延伸产物的384反应板3000rpm离心2min，每孔加16μlMBG 水，用封口膜将反应板封好，3000rpm瞬时离心。

2)取一张干净的A4纸，将树脂板(规格为6mg)置于其上，用小勺取适量树脂(AgenaBIOSCIENCE,产品ref:08040,lot:0000022403)置于树脂板上，用塑料盖板反复左右推平树脂，压实，使每孔树脂含量均匀。

3)将离心后的384反应板倒置在已经铺好树脂的树脂板上，两块板的孔一一对应。翻转两个板，使树脂板在上，384反应板在下。均匀轻轻敲打树脂板背面，使树脂落入装有单碱基延伸产物的384反应板中。

4)用封口膜将装有单碱基延伸产物和树脂的384反应板密封，摇床低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触。

5)将反应完成后的384反应板3000rpm离心5min使树脂沉入管底，上清即为纯化产物。

6、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测

将上述5得到的纯化产物通过点样仪转移到芯片(Agena BIOSCIENCE,产品 ref:01509,lot:0000022421)上，放入质谱仪中，进行质谱检测(质谱检测分子量范围： 4500-8000道尔顿)。

结果如图1-8所示，得到rs5918、rs1330344、rs20417、rs671、rs1057910、rs9923231、rs4244285和rs4986893位点的基因型；可以看出，本发明的引物对和方法可以用于这些位点的基因分型。

根据上述检测的基因型进行精准用药分析，指导临床用药，具体如表1。

表1为基因型指导临床用药

检测位点临床意义rs5918基因型CC和CT,相比基因型TT更容易发生阿司匹林抵抗rs1330344基因型CT和CC,相比基因型TT更容易发生阿司匹林抵抗rs20417基因型CC和GG,相比基因型GG更容易发生阿司匹林抵抗rs671基因型GA和AA,相比基因型GG更容易发生硝酸甘油抵抗rs1057910基因型AA可正常服药，AC,CC可适当减少用药量rs9923231基因型GG可正常服药，AA,GA可适当减少用药量rs4244285基因型GA和AA,相比基因型GG更容易发生氯吡格雷抵抗rs4986893基因型GA和AA,相比基因型GG更容易发生氯吡格雷抵抗

实施例2、检测4种常见临床心脑血管疾病药品抗药性SNP位点的方法及专用引物的应用

1、模板DNA的提取

将5名受检者外周血(均有高血压和血栓等症状)作为待检样本1-5，按照实施例1的二的1的方法提取DNA。

2、PCR反应：与实施例1的二的2相同。

3、碱性磷酸酶处理(SAP消化反应)：与实施例1的二的3相同。

4、单碱基延伸反应：与实施例1的二的4相同。

5、树脂纯化：与实施例1的二的5相同。

6、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测：

方法与实施例1的二的6相同，结果如下表2所示：

表2为待检样本的SNP位点

样本1样本2样本3样本4样本5rs5918TTTTTTTTTTrs1330344TTCTCTCTTTrs20417GGGCGCGCGCrs671GGGGGAGACArs1057910ACAAACACACrs9923231GAGGGAGAGArs4244285AGGGGGAAGGrs4986893GGGGGAGAGG

从表1的分析结果，可以看出:

样本1对阿司匹林对敏感，不易发生阿司匹林抵抗，样本5有一定的阿司匹林抵抗，样本2,3,4易发生阿司匹林抵抗，应加大药物用量；

样本1,2服用急救药物硝酸甘油有效，而样本3,4,5服用急救药物硝酸甘油无效，应选择其他急救药物；

样本2易发生华法林抵抗，可在临床上适当增加药物用量，样本1,3,4,5可减少华法林用量，可以达到临床治疗效果，并减少胃出血的副作用。

样本2,5对氯吡格雷敏感，不易发生氯吡格雷抵抗，样本1,3,在一定程度上发生抵抗，样本4较样本1,2,3,5，最易发生氯吡格雷抵抗。

经过临床用药验证：

样本1患者对阿司匹林对敏感，不易发生阿司匹林抵抗，样本5患者有一定的阿司匹林抵抗，样本2,3,4患者易发生阿司匹林抵抗，加大药物用量；

样本1,2服用急救药物硝酸甘油有效，而样本3,4,5服用急救药物硝酸甘油无效，选择其他急救药物；

样本2易发生华法林抵抗，临床上适当增加药物用量，样本1,3,4,5减少华法林用量，可以达到临床治疗效果，并减少了胃出血的副作用。

样本2,5对氯吡格雷敏感，不易发生氯吡格雷抵抗，样本1,3,在一定程度上发生抵抗，样本4较样本1,2,3,5最易发生氯吡格雷抵抗。

这与本发明的结果一致，表明本发明正确。

对比例1、

引物设计是该项检测工作的关键，引物与模板的结合率直接影响PCR扩增效率，从而影响检测结果的灵敏度和检出率，尤其是UEP引物的设计要求非常高，除了要求序列与检测位点前的序列完全碱基互补配对外，这8条UEP引物在长度设计上，必须呈梯度递增，以便产生分子量差异，实现质谱检测。引物与模板的非特异性结合，出现非特异性扩增产物，也会对实验结果产生干扰。

针对每个SNP位点，发明人平行设计了3组PCR引物和UEP引物(实施例1为引物组3)，按照实施例1的方法将192个样本用3组引物分别检测，通过比较，实施例1中的组3引物检测效果最好：检出率高，灵敏度高，聚类效果好，特异性高。

表3为引物组1

表4为引物组2

引物组3见实施例1中的序列1-序列24。

结果如图9-图24，引物组2和引物组1均出现有位点检出率低，聚类效果差的情况。

对比例2、不同酶浓度梯度及PCR反应循环数的优化过程

在摸索出实施例1的反应体系时，做出了如下平行实验：

1、优化条件1：

⑴PCR反应：

每条引物终浓度均为：0.1μM

MgCl₂的终浓度2mM

dNTP的终浓度是0.5mM

Hotstar Taq的终浓度是0.1U/μl

PCR反应程序设置如下：

⑵SAP酶消化：消化反应程序：37℃，45min；85℃，5min；4℃，∞。

⑶单碱基延伸反应

2、优化条件2：

⑴PCR反应：

每条引物终浓度均为：0.1μM

MgCl₂的终浓度2mM

dNTP的终浓度是0.5mM

Hotstar Taq的终浓度是0.1U/μl

PCR反应程序设置如下：

⑵SAP酶消化：消化反应程序：37℃，40min；85℃，5min；4℃，∞。

⑶单碱基延伸反应

采用实施例1的引物组、对照引物组1和引物组2检测实施例1的192个同样的样本的 rs671和rs9923231位点，检测的反应体系和反应条件分别为上述优化条件1和优化条件2，结果如图25和图26所示，可以看出，优化条件1和优化条件2的位点检出率低，聚类效果差。效果比实施例1的反应体系和反应条件差。

序列表

<110> 李爱娟

<120> 一种用于检测4种常见临床心脑血管疾病药品精准用药的方法及专用引物

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

acgttggatg tctttgggct cctgtcttac 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

acgttggatg agcagattct ccttcaggtc 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

acgttggatg aggtcacgct atggaagaag 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

acgttggatg aagaaacact tgtgtggccc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

acgttggatg acagggtaac tgcttaggac 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

acgttggatg actgttctcc gtaccttcac 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

acgttggatg ttggtggcta caagatgtcg 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

acgttggatg aggtcccaca ctcacagttt 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

acgttggatg tgtcacaggt cactgcatgg 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

acgttggatg ctacacagat gctgtggtgc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

acgttggatg gctaggatta taggcgtgag 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

acgttggatg tctgggaagt caagcaagag 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

acgttggatg gcaataattt tcccactatc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

acgttggatg cactttccat aaaagcaagg 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

acgttggatg gactgtaagt ggtttctcag 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

acgttggatg aacatcagga ttgtaagcac 30

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 17

ttacaggccc tgcctc 16

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 18

tgaaggctct tcccat 16

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 19

aggagaattt acctttccc 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 20

ccacactcac agttttcact t 21

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 21

caggctggtg gggagaaggt caa 23

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 22

gattataggc gtgagccacc gcacc 25

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

tttcccacta tcattgatta tttccc 26

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 24

aaacttggcc ttacctggat 20