基于金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法

摘要

本发明公开一种基于金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法。本发明所述金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法是利用谷胱甘肽对金纳米团簇探针‑过硫酸根电致化学发光体系发光强度的抑制作用，从而表现出电致化学发光强度的变化，可以直接用于谷胱甘肽含量的测定。在1.0×10

说明书

技术领域

本发明涉及一种金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。

背景技术

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的三肽化合物，存在于几乎身体的每一个细胞。正常的谷胱甘肽在人体的新陈代谢及能量运输等方面起着重要的作用，能帮助人体保持正常的免疫系统的功能。并且，在通常情况下，谷胱甘肽的异常表达是一些疾病的征兆，可作为疾病临床诊断的依据。因此，在生物、临床检测等分析中，谷胱甘肽含量的测定具有重要的意义。

电致化学发光是将化学发光与电化学相结合而发展起来的一种新的分析技术。该技术同时具有化学发光技术与电化学技术的优点，因而具有灵敏度高、选择性好、背景信号低、线性范围宽、检出限低，以及反应可控等特点，已被广泛应用于药物、临床治疗与诊断、免疫、食品质量、环境和安全及其它物质的测定。寻找新的发光体，发展新的电致化学发光体系是电致化学发光分析的重要研究方向。量子或纳米团簇，因具有良好的光学和电学特性，在发光材料的研发、光敏传感器的构建等方面引起了越来越多的关注。近年来，基于量子点或纳米团簇的电致化学发光分析法，因具有背景信号低、灵敏度高、可控性好、试剂可以循环使用和分析测试范围广等优点，已在生物、医药，和环境等领域得到了广泛的应用。金纳米团簇作为新型纳米发光体，具有无毒、水溶性好、比表面积大、制备条件温和、表面易修饰，且具有特殊光电性质等特点，己在生物医药、临床分析、传感检测和催化等领域广泛应用。

本发明以金纳米团簇为电致化学发光探针，建立了一种谷胱甘肽测定的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以金纳米团簇为电致化学发光探针的谷胱甘肽测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的基于金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法，其特征是以金纳米团簇探针为发光体，以过硫酸根离子为共反应剂，将金纳米团簇探针修饰在玻碳电极上，并将其作为工作电极进行电化学发光测试，利用谷胱甘肽对金纳米团簇探针-过硫酸根离子的电致化学发光体系发光强度的抑制作用，从而表现出电致化学发光强度的变化，能直接用于谷胱甘肽的含量测定。

所述的金纳米团簇探针以金纳米团簇材料为前驱体，采用还原法制备得到；所述金纳米团簇材料为功能化修饰金纳米团簇，采用N-乙酰化-L-半胱氨酸-金纳米团簇或牛血清白蛋白-金纳米团簇；所述的N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的水溶液由下述方法制备的：往4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中加入0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠与0.4 mL浓度为20 mg/mL氯金酸溶液，混匀后置于37 ℃恒温水槽中孵育3小时，反应结束后的反应液用截留分子为3500的透析袋进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇水溶液；金纳米团簇探针修饰玻碳电极由下述方法制备的：将直径3 mm的玻碳电极用1.0 μm、0.3 μm，0.05 μm的Al₂O₃粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO₃溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，N₂吹干；取5>

所述的基于金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法，其特征是以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，施加-0.2 V ~ -2 V电压，进行恒电位还原，得到金纳米团簇探针。

所述的基于金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法，其特征是将金纳米团簇探针修饰玻碳电极浸泡在0.1 mol/L硼氢化钠溶液中反应5分钟~1小时，得到金纳米团簇探针。

所述的基于金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法，其特征是以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，以过硫酸根离子为共反应剂，采用阶跃脉冲法进行电化学发光测试，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。

所述的基于金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法，其特征是采用三电极体系进行测试，以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，所用电解质为KCl或KNO₃。

所述的基于金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法，其特征是缓冲溶液pH值为7.4，过硫酸根浓度为0.1>

所述的基于金纳米团簇探针的谷胱甘肽电致化学发光测定方法，其特征是将金纳米团簇探针修饰玻碳电极，铂丝电极，Ag/AgCl电极插入含有不同浓度谷胱甘肽的过硫酸根离子共反应剂缓冲溶液中，采用阶跃脉冲法进行电化学发光测试，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s；电致化学发光强度值与谷胱甘肽浓度的对数值在1.0×10^-9>-5>-5>-1>-10>

本发明所述的基于金纳米团簇探针测定尿液中谷胱甘肽的电致化学发光方法，其特征是取新鲜人尿液，用0.45 μm膜过滤，12000 rpm转速下离心20分钟，取上清液，用含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液稀释20倍；将金纳米团簇探针修饰玻碳电极，铂丝电极，Ag/AgCl电极插入含有尿样的缓冲溶液中，采用阶跃脉冲法测定电致化学发光信号，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s；通过标准曲线进行定量，获得样品中谷胱甘肽的含量；采用标准加入法得到本发明所述的方法检测尿样中谷胱甘肽的回收率为103.1%~107.7%。

所述的基于金纳米团簇探针测定尿液中谷胱甘肽的电致化学发光方法，其特征是金纳米团簇探针修饰玻碳电极的制备方法为：将直径3 mm的玻碳电极用1.0 μm、0.3 μm，0.05 μm的Al₂O₃粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO₃溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，N₂吹干；取5>

具体地说，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的一种基于金纳米团簇为电致化学发光探针的谷胱甘肽测定方法，其特征是以金纳米团簇探针为发光体，以过硫酸根离子为共反应剂，将金纳米团簇探针修饰在玻碳电极上，并将其作为工作电极进行电化学发光测试。

上述金纳米团簇探针由以下方法制备：（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入缓冲溶液中，施加不同负电位电压，进行恒电位还原处理，得到电化学发光金纳米团簇探针；（2）化学还原法：将金纳米团簇溶液与一定浓度的硼氢化钠溶液反应一定时间，离心清洗，得到金纳米团簇探针，或将金纳米团簇修饰玻碳电极泡在一定浓度的硼氢化钠溶液反应一定时间，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。

所述的金纳米团簇材料为功能化修饰金纳米团簇，如：N-乙酰化-L-半胱氨酸-金纳米团簇，牛血清白蛋白-金纳米团簇等。

所述的电致化学发光信号由以下方法采集：将玻碳电极用Al₂O₃粉末依次抛光、打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO₃溶液、无水乙醇和去离子水中超声清洗，N₂吹干。再将金纳米团簇探针溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，即得金纳米团簇探针修饰玻碳电极。采用三电极体系进行测试，以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入含有共反应剂的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，光电倍增管高压设置为600>

本发明所述的一种基于金纳米团簇为电致化学发光探针的谷胱甘肽测定方法，包括如下步骤：1）将玻碳电极用Al₂O₃粉末依次抛光、打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO₃溶液、无水乙醇，和去离子水中超声清洗，N₂吹干；2）将金纳米团簇探针溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，即得金纳米团簇探针修饰玻碳电极；3）采用三电极体系进行测试，以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入含有谷胱甘肽和共反应剂的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，光电倍增管高压设置为600>-9>-5>-5>-1>-10>

上述共反应剂为过硫酸根离子，浓度范围为0.01~1 mol/L，优选0.1>

所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，在缓冲溶液中所添加电解质为KCl或KNO₃，浓度为0.01~1>

本发明采用的具体技术方案如下：

（一）N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的制备

N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇合成步骤如下：将浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠与浓度为0.01~0.1 g/L氯金酸溶液加入到浓度为0.02~0.18 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀后置于20~70 ℃恒温水浴恒温反应0~3.5小时。待反应结束后透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇水溶液，冷冻干燥后可得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇材料粉末。

（二）金纳米团簇修饰电极的制备

将玻碳电极用1.0 μm、0.3 μm，0.05 μm的Al₂O₃粉末依次抛光、打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO₃溶液（1:1）、无水乙醇，和去离子水中超声清洗3分钟，N₂吹干。取5>

（三）金纳米团簇探针制备

（1）电化学还原法制备金纳米团簇探针：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1 mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加不同负电位电压（-0.2 V ~ -2 V范围内），进行恒电位还原处理，得到电化学发光金纳米团簇探针。

（2）化学还原法制备金纳米团簇探针：将金纳米团簇溶液与0.1 mol/L硼氢化钠溶液反应5分钟~1小时，离心清洗，得到金纳米团簇探针。或将金纳米团簇修饰玻碳电极泡在0.1 mol/L硼氢化钠溶液反应5分钟~1小时，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。

（四）金纳米团簇探针电致化学发光信号的产生和检测

采用三电极体系进行测试，以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入含有共反应剂的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为600>

（五）谷胱甘肽的测定

向缓冲溶液中加入不同浓度的谷胱甘肽溶液，混合均匀后按步骤（四）所述方法测定电化学发光信号，绘制工作曲线。

本发明所述的以金纳米团簇为电致化学发光探针的谷胱甘肽测定方法，包括如下步骤：取新鲜人尿液，用含0.1 mol/L 过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液稀释10~20倍。将上述三电极体系插入该样品溶液，测定电致化学发光信号值，通过标准曲线进行定量，获得尿样中的谷胱甘肽含量。

本发明的优点是：

（1）本发明以高量子产率金纳米团簇探针为电致化学发光材料，利用谷胱甘肽对金纳米团簇-过硫酸根电致化学发光体系发光强度的抑制作用，构建高灵敏度的谷胱甘肽传感器。

（2）本发明所得到的金纳米团簇探针制备方法简单，绿色环保，重现性好，电致化学发光强度大，稳定性好。对谷胱甘肽检测线性范围宽，检测限低。

（3）本发明对样品的处理要求低，尿液仅需过滤、离心、稀释即可进行测定。

附图说明

图1为金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。

图2为加入谷胱甘肽后金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。

图3为电致化学发光强度变化与缓冲溶液pH之间的关系图。

图4为电致化学发光强度变化与共反应剂过硫酸钾浓度之间的关系图。

图5为电致化学发光强度变化与谷胱甘肽浓度对数值之间的线性关系图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。

实施例1

往4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中加入0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠与0.4 mL浓度为20 mg/mL氯金酸溶液，混匀后置于37 ℃恒温水槽中孵育3小时。反应结束后的反应液用截留分子为3500的透析袋进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇水溶液，冷冻干燥后得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇粉末。

实施例2

将直径3mm的玻碳电极用1.0 μm、0.3 μm，0.05 μm的Al₂O₃粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO₃溶液（浓硝酸与水体积比为1:1），无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，N₂吹干。取5>

实施例3

将实施例2制备的金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为600 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图1）。

实施例4

将实施例2制备的金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入含有1.0×10^-6>

实施例5

将实施例2制备的金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入含有1.0×10^-4>

实施例6

将实施例2制备的金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入含有1.0×10^-4>

实施例7

将实施例2制备的金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入含有不同浓度谷胱甘肽，0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为600 V，在缓冲溶液中加入不同浓度谷胱甘肽存在的条件下分别检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。在谷胱甘肽浓度为1.0×10^-9>-5>-5>-1>-10>

实施例8

取新鲜人尿液，用0.45 μm膜过滤， 12000 rpm转速下离心20分钟，取上清液，用含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液稀释20倍。将实施例2制备的金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，插入上述含有尿样的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为600 V，分别检测不同样品溶液中各工作电极表面产生的电致化学发光信号，通过标准曲线进行定量，获得样品中谷胱甘肽的含量。采用标准加入法得到本发明所述的方法检测尿样中谷胱甘肽的回收率为103.1%~107.7%。

以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。