一种基于基因重组质粒的变异链球菌生物膜pH指示计及其应用

摘要

本发明公开了一种基于基因重组质粒的变异链球菌生物膜pH指示计及其应用，所述指示计通过将质粒pDLpH转化入宿主变异链球菌UA159中获得表达；所述质粒pDLpH的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其分子量为66183.62Da；本发明的指示计成本低、适用范围广、对微生物的生长环境无影响，并且构建方便、培养简单、增殖快。

说明书

技术领域

本发明涉及生物膜pH指示计，具体涉及一种基于基因重组质粒的变异链球菌生物膜指示计、制备及其应用。

背景技术

龋病是最常见的口腔疾病之一，牙面牙菌斑生物膜的聚集是龋病形成的首要因素；牙菌斑生物膜形成迅速且较难清除，生物膜内结构特殊；其中的微生物在特殊的环境中生长，代谢产生的乳酸等酸性物质不易流出亦不易被唾液中和，故可造成牙菌斑底部附着牙面的局部长期低pH环境；龋病的发生就始于局部低pH环境造成的牙体脱矿；由此可见，相对于细菌本身而言，其产酸造成的菌斑附着表面的低pH环境才是龋病发生的直接因素；如何直观准确地反映菌斑pH也显得尤为重要。

目前，菌斑pH的测量方法大致有以下几种：1、接触式电极测量法：将微电极插入待测部位进行探测；2、取样检测法：将待测部位菌斑收集起来，再通过pH计进行检测；这两种方法简单、便宜、灵活，但测量时会扰乱待测部位生物膜、测试时间不连续、唾液的缓冲作用影响大、非原位检测；3、内在电极测量法：将微电极事先置于未形成生物膜的物体表面(如义齿基托、培养皿底部等)，然后置于患者口内或接入细菌，即可通过无线电技术连续长期地检测pH；这种方法不扰乱生物膜的形成且为原位检测，但其价格昂贵、操作复杂；4、pH染料法：使用商品化的pH荧光染料对生物膜进行染色和检测；此方法中pH染料染色的操作易受生物膜厚度、生物膜表面粗糙程度等因素的影响，造成实验误差；总体来说，目前生物膜 pH的测量方法不尽如人意。

发明内容

本发明提供一种方便、便宜、连续原位测量且误差较小的基于基因重组质粒的变异链球菌生物膜指示计、制备及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种基因重组质粒pDLpH，所述质粒pDLpH的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其分子量为66183.62Da。

一种基于质粒pDLpH的变异链球菌生物膜pH指示计，所述指示计通过将质粒pDLpH 转化入宿主变异链球菌UA159中获得表达。

进一步的，所述质粒pDLpH在宿主变异链球菌UA159中表达为绿色荧光蛋白。

进一步的，指示计用于生物膜pH检测。

进一步的，指示计用于与生物膜pH变化相关的因素检测。

进一步的，指示计用于生物膜产酸抑制剂的筛选。

进一步的，指示计用于变异链球菌生物膜pH检测。

一种基因重组质粒pDLpH的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过PCR方法获得唾液链球菌57.I的pureI基因和绿色荧光蛋白的编码基因gfp；

(2)使用限制性核酸内切酶BamHI酶切步骤(1)获得的基因片段，通过DNA连接酶连接获得重组基因片段pureI-gfp；

(3)将步骤(2)中得到的重组基因片段pureI-gfp与质粒PDL278分别使用限制性核酸内切酶SacI及SalI双酶切；

(4)将步骤(3)中得到的产物使用DNA连接酶连接，并将连接产物转化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞中；

(5)涂布含有100μg/mL壮观霉素的液体培养基琼脂平板，有氧条件下培养24h，挑选阳性克隆于液体培养基中进行增菌培养24h；

(6)提取质粒进行PCR和测序验证，验证正确的重组质粒为目标产物。

一种指示计的制备方法，包括以下步骤：

(1)将变异链球菌UA159接种于BHI培养基琼脂平板，37℃厌氧条件下培养24h，挑单菌落接种于BHI培养基中传代过夜；

(2)用BHI培养基将过夜培养的菌液稀释20倍后，于厌氧条件下培养至OD_600nm值为>

(3)取500μL上述菌液于无菌EP管中，向其中加入终浓度为1μg/mL变异链球菌感受态刺激肽CSP，并置于37℃培养箱中孵育；

(4)10min后向步骤(3)溶液中加入5μL上述载体pDLpH，厌氧条件下培养2h；

(5)取100μL步骤(4)中的菌液涂布含有1mg/mL壮观霉素的BHI琼脂平板，厌氧条件下培养48h；

(6)挑选抗壮观霉素阳性克隆于含有1mg/mL壮观霉素的BHI液体培养基中，37℃厌氧条件下进行增菌培养过夜，即得到所述指示计。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的指示计本身即为生物膜的组成成分之一，无需染色洗脱等操作即可检测其所处环境的pH；

(2)本发明采用口腔生物膜的常驻菌变异链球菌作为质粒pDLpH的宿主，使得指示计适用范围广；

(3)本发明中指示计处于活体状态，无需额外操作可连续观察荧光变化以检测生物膜 pH变化情况；

(4)本发明中指示计构建方便，培养简单、增殖快；

(5)本发明中指示计对微生物的生长无影响，能够更真实的反映微生物表型与环境pH 高低间的关系；

(6)本发明指示计成本低、适用范围广、可连续原位检测其所处pH及与pH变化相关因素。

附图说明

图1为基因重组质粒pDLpH构建方法示意图。

图2为不同pH、不同处理时间变异链球菌pH指示计荧光图。

图3为不同pH、不同处理时间变异链球菌pH指示计单位面积荧光强度统计图。

图4为对照组ΔcodY/pDLpH指示不同pH后荧光图像。

图5为对照组UA159/pDL278-pldh-gfp指示不同pH后荧光图像。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

一种基因重组质粒pDLpH，所述质粒pDLpH的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其分子量为66183.62Da。

一种基于质粒pDLpH的变异链球菌生物膜pH指示计，所述指示计通过将质粒pDLpH 转化入宿主变异链球菌UA159中获得表达。

进一步的，所述质粒pDLpH在宿主变异链球菌UA159中表达为绿色荧光蛋白。

进一步的，指示计用于生物膜pH检测。

进一步的，指示计用于与生物膜pH变化相关的因素检测。

进一步的，指示计用于生物膜产酸抑制剂的筛选。

进一步的，指示计用于变异链球菌生物膜pH检测。

一种基因重组质粒pDLpH的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：

(1)通过PCR方法获得唾液链球菌57.I的pureI基因和绿色荧光蛋白的编码基因gfp；

以唾液链球菌57.I及含有绿色荧光蛋白编码基因的变异链球菌UA159(四川大学口腔疾病研究国家重点实验室保存)基因组DNA为模板，以pureI-SacI:5’-TTTGAGCTCATTCCTGGGAGACTAGCTG-3’；pureI-BamHI:5’-TTTGGATCCCTCCTAAGTTTTTTATGTTAATATC-3’。及 gfp-BamHI:5’-AGAAGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3’； gfp-SalI:5’-TTTTGTCGACCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG-3’为引物分别PCR扩增约 450bp大小的pureI基因及约700bp大小的gfp基因；

PCR过程如下：

通过2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物中的目的基因片段；

(2)使用限制性核酸内切酶BamHI酶切步骤(1)获得的基因片段，通过DNA连接酶连接获得重组基因片段pureI-gfp；

将扩增得到的目的基因片段用限制性核酸内切酶BamHI酶切，然后使用2％琼脂糖凝胶电泳及DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的目的基因片段，并使用T4DNA连接酶16℃连接 16小时；使用1.5％琼脂糖凝胶电泳对连接产物进行分析，并切取1200bp大小的条带进行 DNA回收，PCR富集重组连接体片段；

PCR过程如下：

(3)将步骤(2)中得到的重组基因片段pureI-gfp与质粒pDL278(保藏于四川大学口腔疾病研究国家重点实验室)分别使用限制性核酸内切酶SacI及SalI双酶切；

(4)将步骤(3)中得到的产物使用DNA连接酶连接，并将连接产物转化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞中；

(5)涂布含有100μg/mL壮观霉素的LB液体培养基琼脂平板，有氧条件下培养24h，挑选阳性克隆于LB液体培养基中进行增菌培养24h；

(6)提取质粒进行PCR和测序验证，验证正确的重组质粒为目标产物。

一种指示计的制备方法，包括以下步骤：

(1)将变异链球菌UA159(四川大学口腔疾病研究国家重点实验室保存)接种于BHI 培养基琼脂平板，37℃厌氧条件下培养24h，涂片镜检及生化鉴定后，挑单菌落接种于BHI 培养基中传代过夜；

(2)用BHI培养基将过夜培养的菌液稀释20倍后，于厌氧条件下培养至OD_600nm值为>

(3)取500μL上述菌液于无菌EP管中，向其中加入终浓度为1μg/mL变异链球菌感受态刺激肽CSP，并置于37℃培养箱中孵育；

(4)10min后向步骤(3)溶液中加入5μL上述载体pDLpH，厌氧条件下培养2h；

(5)取100μL步骤(4)中的菌液涂布含有1mg/mL壮观霉素的BHI琼脂平板，厌氧条件下培养48h；

(6)挑选抗壮观霉素阳性克隆于含有1mg/mL壮观霉素的BHI液体培养基中，37℃厌氧条件下进行增菌培养过夜；

使用菌液进行PCR验证，验证过程如下：

验证正确的变异链球菌菌株命名为UA159/pDLpH，即为所述指示计。

实施例1

为了验证所述指示计的效果，进行如下实验。

(1)将重组变异链球菌菌株UA159接种于含有终浓度为15mg/mL酸碱缓冲剂Pipes (Sigma，美国)和1mg/mL壮观霉素的BHI+H₂O(体积比1:1)培养基中，37℃厌氧培养箱内培养过夜，菌液备用；

(2)将9个灭菌后的玻璃小圆片分别置于24孔板的9个孔内，并向其中加入2mL上述混合培养液及20μL上述菌液；

(3)37℃厌氧培养箱内培养14小时后，分别置于pH 7.5、pH 5.5和pH 3.5的BHI培养基中处理1min、30min、60min；

(4)将各小圆片取出置于载玻片上，向小圆片中央滴加一滴无荧光镜油，小心盖上盖玻片；

(5)于正置荧光显微镜蓝紫光激发下观察上述样本，每个样本随机选取五个视野并使用 ImagePro-Plus计算其单位面积荧光强度，并使用SNK检验分析组间差异。

其荧光图如图2所示，单位面积荧光强度统计图如图3所示；

如图2和图3所示，当处理pH为7.5和5.5时，随处理时间的增长，单位面积荧光强度明显升高；当处理pH为3.5时，处理1min与30min单位面积荧光强度无明显差异，但均较处理60min时低；使用不同pH处理相同时间时，单位面积荧光强度随pH值的降低而升高；处理1min时，随着pH的降低，指示计荧光强度明显增强；说明该指示计可以迅速的反映待测部位的pH高低；随着处理时间的增长，变异链球菌生长繁殖同时产酸，降低了所处环境的pH，故指示计荧光强度随时间增长而增强。

实施例2

为验证指示计的特异性进行如下实验。

首先构建对照组ΔcodY/pDLpH和UA159/pDL278-pldh-gfp。

1、对照组ΔcodY/pDLpH的构建

(1)将变异链球菌ΔcodY接种于改良BHI培养基琼脂平板，37℃厌氧条件下培养24h；

(2)挑单菌落分别接种于改良BHI培养基中传代过夜；

(3)使用改良BHI培养基将过夜培养的菌液稀释20倍后，于厌氧条件下培养至OD_600nm值为0.2；

(4)取500μL上述菌液于无菌EP管中，向其中加入终浓度为1μg/mL变异链球菌CSP，并置于37℃培养箱中孵育；

(5)10min后向其中加入载体pDLpH。厌氧条件下培养2.5h；

(6)取100μL菌液涂布含有1mg/mL壮观霉素的改良BHI琼脂平板，厌氧条件下培养48h；

(7)挑选壮观霉素阳性克隆于改良BHI培养基中，37℃厌氧条件下进行增菌培养；

(8)24h后以菌液作为模板，gfp-BamHI及gfp-SalI为引物，进行PCR扩增验证。将验证正确的菌株分别命名为ΔcodY/pDLpH，保种冻存待用。

2、对照组UA159/pDL278-pldh-gfp的构建

(1)将变异链球菌UA159接种于改良BHI培养基琼脂平板，37℃厌氧条件下培养24h；

(2)挑单菌落分别接种于改良BHI培养基中传代过夜；

(3)使用改良BHI培养基将过夜培养的菌液稀释20倍后，于厌氧条件下培养至OD_600nm值为0.2；

(4)取500μL上述菌液于无菌EP管中，向其中加入终浓度为1μg/mL变异链球菌CSP，并置于37℃培养箱中孵育；

(5)10min后向其中加入5μL质粒pDL278-pldh-gfp(保藏于四川大学口腔疾病研究国家重点实验室)，厌氧条件下培养2.5h；

(6)取100μL菌液涂布含有1mg/mL壮观霉素的改良BHI琼脂平板，厌氧条件下培养48h；

(7)挑选壮观霉素阳性克隆于改良BHI培养基中，37℃厌氧条件下进行增菌培养；

(8)24h后以菌液作为模板，gfp-BamHI及gfp-SalI为引物，进行PCR扩增验证。将验证正确的菌株分别命名为UA159/pDL278-pldh-gfp，保种冻存待用。

对照组进行荧光强度的测试

(1)将ΔcodY/pDLpH及UA159/pDL278-pldh-gfp分别接种于含有终浓度为15mg/mL酸碱缓冲剂Pipes(Sigma，美国)和1mg/mL壮观霉素的BHI+H₂O(体积比1:1)培养基中，37℃厌氧培养箱内培养过夜，菌液备用；

(2)将18个灭菌后的玻璃小圆片分别置于两个24孔板的18个孔内(每个孔板9个孔)，并向其中加入2mL上述混合培养液；

(3)向孔板A中的9个孔内加入20μLΔcodY/pDLpH的菌液；向孔板B中的9个孔内加入20 μL UA159/pDL278-pldh-gfp的菌液；

(4)37℃厌氧培养箱内培养14小时后，分别置于pH 7.5、pH 5.5和pH 3.5的BHI培养基中处理1min、30min、60min；

(5)将各小圆片取出置于载玻片上，向小圆片中央滴加一滴无荧光镜油，小心盖上盖玻片；

(6)于正置荧光显微镜蓝紫光激发下观察上述样本，每个样本随机选取五个视野并使用 ImagePro-Plus计算其单位面积荧光强度，并使用SNK检验分析组间差异。

实验结果如图4和图5所示，ΔcodY/pDLpH及UA159/pDL278-pldh-gfp单位面积荧光强度分别约为0.39IOD/μm²及0.42IOD/μm²，且不随处理pH的高低及处理时间的长短而变化；与本发明中的指示计UA159/pDLPH相比，ΔcodY/pDLpH缺失CodY蛋白而>

本发明利用pureI的酸诱导表达特性构建pDLpH并转入变异链球菌中制作生物膜原位pH 指示计；指示计本身即为生物膜的组成成分之一，无需染色洗脱等操作，即可检测其所处环境的pH；指示计始终处于活体状态，且无需额外操作，可以连续观察荧光变化以检测生物膜 pH变化情况；载体构建方便快捷，指示计为菌体本身，培养简单增殖快；变异链球菌是口腔生物膜的常驻菌，产酸耐酸性强，将其作为载体pDLpH的宿主，使得指示计适用范围广；可用于生物膜pH检测及与pH变化相关的因素检测，如生物膜产酸抑制剂的筛选等。

本发明中的生物膜指微生物个体间相互黏附聚集形成的结构复杂、相对稳定的微生物群体；菌斑指牙菌斑生物膜，是一种细菌性生物膜，为基质包裹的相互粘附或粘附于牙面、牙间或修复体表面的软而未矿化的细菌性群体，不能被水冲去或漱掉。

SEQ ID NO:1

<110> 四川大学

<120> 一种基于质粒pDLpH的变异链球菌生物膜pH指示计及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7885

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 60

gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 120

cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 180

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 240

cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 300

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 360

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 420

gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 480

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 540

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 600

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 660

tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 720

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 780

tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 840

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 900

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 960

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 1020

cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 1080

ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 1140

ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 1200

agaagtggtc cgataaaccc agcgaaccat ttgaggtgat aggtaagatt ataccgaggt 1260

atgaaaacga gaattggacc tttacagaat tactctatga agcgccatat ttaaaaagct 1320

accaagacga agaggatgaa gaggatgagg aggcagattg ccttgaatat attgacaata 1380

ctgataagat aatatatctt ttatatagaa gatcgatttt cgttcgtgaa tacatgttat 1440

aataactata actaataacg taacgtgact ggcaagagat atttttaaaa caatgaatag 1500

gtttacactt actttagttt tatggaaatg aaagatcata tcatatataa tctagaataa 1560

aattaactaa aataattatt atctagataa aaaatttaga agccaatgaa atctataaat 1620

aaactaaatt aagtttattt aattaacaac tatggatata aaataggtac taatcaaaat 1680

agtgaggagg atatatttga atacatacga acaaattaat aaagtgaaaa aaatacttcg 1740

gaaacattta aaaaataacc ttattggtac ttacatgttt ggatcaggag ttgagagtgg 1800

actaaaacca aatagtgatc ttgacttttt agtcgtcgta tctgaaccat tgacagatca 1860

aagtaaagaa atacttatac aaaaaattag acctatttca aaaaaaatag gagataaaag 1920

caacttacga tatattgaat taacaattat tattcagcaa gaaatggtac cgtggaatca 1980

tcctcccaaa caagaattta tttatggaga atggttacaa gagctttatg aacaaggata 2040

cattcctcag aaggaattaa attcagattt aaccataatg ctttaccaag caaaacgaaa 2100

aaataaaaga atatacggaa attatgactt agaggaatta ctacctgata ttccattttc 2160

tgatgtgaga agagccatta tggattcgtc agaggaatta atagataatt atcaggatga 2220

tgaaaccaac tctatattaa ctttatgccg tatgatttta actatggaca cgggtaaaat 2280

cataccaaaa gatattgcgg gaaatgcagt ggctgaatct tctccattag aacataggga 2340

gagaattttg ttagcagttc gtagttatct tggagagaat attgaatgga ctaatgaaaa 2400

tgtaaattta actataaact atttaaataa cagattaaaa aaattataaa aaaattgaaa 2460

aaatggtgga aacacttttt tcaatttttt tgttttatta tttaatattt gggaaatatt 2520

cattctaatt ggtaatcaga ttttagaaaa caataaaccc ttgcataact ttctcgtcca 2580

tatcggaaac tactttttta ttcccttttt ttcgaccgag attattttgc gataaaatcc 2640

gattaagata ctgcctacta actcccaatt cttgagctaa ttctgatact gttttactca 2700

tcagctacct cacaaaataa ttctttctat cccaattcca aaaggcaaca atttcacgac 2760

cagtactttc tgcagattct tctgctccgg tctgaacaag attcccttct tcgacatcat 2820

caagagctaa ctccgccttg attttcttga acaactttcc aaaaccaatc tgcctttttc 2880

ggtgcaaacc attcgttaaa tcttctgtta tccgttcttt gaccatttca gagaataatg 2940

tcacatcttc tgtatctaca tcaaaaggct taacaggata tttagctgtt tcgataatag 3000

ctgacttcaa gtttttacgt ttatgagctt tgacggttcg aatatcaact acaggtgtat 3060

aatccaattt catcgcctta gcccatagtt tcgtccattc ttcttggcta atgtaatttg 3120

tattatttcc agtaaaatag ctagatttca caaataacaa tacatgcaaa tgagggtgat 3180

aattctcatg ctcagttgaa taagttacct cagtggctcg caaatagcca ataacatttt 3240

tatcgacttt cttgtatttc ataagacgat taaaagctcg ccctatttct gaaattgatt 3300

tatttaattt ttcaccacta atgttcttaa tcgtcaaggt caaaaagaga aagcgacctt 3360

ttggatagcg tttcattgct tcatttacca ctaattcagc ttgataagca tacttcattg 3420

accgtctcca gttacaaatt gggcagagct tatttttgca aaaataagac tgatagagtt 3480

ttttcgtgcc gtcttgttgt tcgataaact tcaacacttc ggcacattga tagacccgtt 3540

caaacgaacg atatcctaaa cgctctaaac gaccagcaag ctcaatattt tttaacttgc 3600

gttctcgcca ctttctatct ttgccattct tagaatagtc cttaaagact tgattttcag 3660

tacctgtcat gttataattt tcttgcaaaa aaattttttt gagtatataa aaaagttcct 3720

gcaattctcc taagtttatt attttaaatt ggacacttaa attataaact ttattttatt 3780

aaattgcaag ggcttttttg ttacctaaaa acccagcaat atcaagggtt tgaggtgctt 3840

taaaacaaga aaataaaaaa actcattatt tctatatgta tcaagataag aaaaaaccct 3900

tgctacgcaa ttgggttttt aagggctttt cagccctctt tttcgtttca cgaaaaattc 3960

acccctaaaa cctcaaattt tgactttcta aatccaaacg tggtataata attttaacgc 4020

tagaagttct aggaaacgaa tagcacaacg caaaaaaaac agtagctgga actactgtct 4080

ttcttttttg tcctcaaaaa gaactcaggt taatttttgt cgcgtttgtt tcgaacatac 4140

cgaatcaacc aatcagcact tacctctgca gcaacgccaa ccacaaaagg tatcaaaaca 4200

agttctagga aagtcttcac agcgctcacc tccaatctaa gttcgtaact tagcgaaaga 4260

acgttgcgac ctagctatta taccatgtcc gcttacttta ttccatggtc taattgacaa 4320

caagtaacca agggcggacg tcctttgtcc gtgtcggctc gaaacgctaa agcctttcgg 4380

ctcgtcacgt cctagcgtac tttgcccttg cttattgtca attagctttc acggcataaa 4440

tcgctcaaag gcctagccct ttttcaatca ctcgtttaac tacccttacg attggctgaa 4500

tagctcttaa ctctgatata aaatttttta aggctttatc tggcataaac tctttcagtt 4560

ttcctagcat tttgtcattt tgctgtctca aaactgagtt ttcacttcta agcgctctat 4620

tttcgttcct aagacgctct atgctctctc ccttactttt ttctttagct cgttccaact 4680

cgcttcaaac cgtttagagc gtctcagagg cactatccgc cttaattgct cattctctag 4740

ctctttttga tgaacaaggt ttctgcttcg gtatatcagc cctttaaatt cttcaaactg 4800

ctctttagtc aattccacat attctttacc gaacacgcct tttttagggg taatagccgc 4860

tagttctttc tcagacatga tttttaggtc agctatttgt gtttttagtt tttctaattt 4920

cagcccctcg cgctctaaac gctctatttt cgcttctaag ctcttcgaat aattttctaa 4980

ggtatttata tatccctcag ctttagatag ctctgagagc ctctcagagg tctcagaatc 5040

gccaggaccc aacgctgccc gactgctttc ctgatgcaaa aacgaggcta gtttaccgta 5100

tctgtggggg gatggcttgt agatatgacg acaggaagag tttgtagaaa cgcaaaaagg 5160

ccatccgtca ggatggcctt ctgcttaatt tgatgcctgg cagtttatgg cgggcgtcct 5220

gcccgccacc ctccgggccg ttgcttcgca acgttcaaat ccgctcccgg cggatttgtc 5280

ctactcagga gagcgttcac cgacaaacaa cagataaaac gaaaggccca gtctttcgac 5340

tgagcctttc gttttatttg atgcctggca gttccctact ctcgcatggg gagaccccac 5400

actaccatcg gcgctacggc gtttcacttc tgagttcggc atggggtcag gtgggaccac 5460

cgcgctactg ccgccaggca aattctgttt tatcagaccg cttctgcgtt ctgatttaat 5520

ctgtatcagg ctgaaaatct tctctcatcc gccaaaacag ctgctttcct gatgcaaaaa 5580

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